John Libbey Eurotext

Virologie

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Antibacterial applications of bacteriophages Volume 24, issue 1, Janvier-Février 2020

Figures

  • Figure 1
  • Figure 2
  • Figure 3
  • Figure 4

Tables

Introduction

Les bactériophages sont des virus qui infectent les bactéries. Ils sont nombreux et forment l’entité biologique la plus abondante sur notre planète. Présents dans tous les environnements colonisés par des bactéries, y compris au sein du corps humain, ils exercent une pression de sélection sur les populations bactériennes et participent donc activement à leurs régulation (quantitativement) et évolution (qualitativement). Cette interaction antagoniste et dynamique est illustrée par la course aux armements que bactéries et bactériophages engagent pour leur survie, les premières par la mise en place de mécanismes de résistances et les seconds par le contournement de ces mécanismes. Ainsi, ces deux populations coévoluent continuellement [1].

Quelle que soit son orientation (agronomique végétale ou animale, médecine humaine), la phagothérapie se définit comme l’utilisation d’un ou de plusieurs bactériophages pour cibler la ou les bactéries qui posent problème. Cependant, l’isolement de bactériophages d’intérêt (capables de lyser une ou plusieurs souches bactériennes données) peut s’avérer difficile malgré leur abondance. En effet, certaines bactéries, parce qu’elles n’expriment pas les récepteurs habituellement ciblés par les bactériophages ou bien parce qu’elles possèdent différents mécanismes capables de bloquer la réplication virale (par exemple les systèmes de restriction-modification ou le système CRISPR-Cas) requièrent des bactériophages très spécifiques, numériquement plus rares [2]. Ainsi, chaque bactériophage est caractérisé par ce que l’on nomme son spectre d’hôte, qui peut être qualifié d’« étroit » (virus très spécifiques, capables par exemple d’infecter un unique sérotype d’une espèce bactérienne), à « large » dans le cas de bactériophages capables d’infecter des souches appartenant à des espèces bactériennes phylogénétiquement proches (virus généralistes, à spectre large, capables par exemple d’infecter des souches d’espèces bactériennes proches telles que Staphylococcus aureus et de Staphylococcus epidermidis). Ce spectre d’hôte est à rapprocher du degré de polymorphisme génétique de l’espèce bactérienne ciblée : il est facile de trouver des bactériophages généralistes (larges spectres) ciblant des souches d’espèce bactériennes présentant un faible degré de variabilité intra-espèce (S. aureus par exemple), alors que cette tâche s’avère impossible lorsqu’il s’agit de cibler des souches d’espèces très polymorphes (Escherichia coli par exemple). Enfin, comme pour tout agent thérapeutique, l’innocuité, la tolérance et l’efficacité des bactériophages nécessitent d’être démontrées par des études cliniques contrôlées [3]. Ces études, de par les particularités que présentent les bactériophages, telles que leur capacité à s’auto-amplifier au cours de leur application et leur nature virale, bousculent un ordre établi essentiellement pour des molécules chimiques. Ainsi, le chemin pour réintroduire les bactériophages en médecine humaine ou pour développer d’autres applications n’est pas un long fleuve tranquille [4]. La dynamique des recherches menées dans ce sens ces dernières années et présentée dans cette revue est incontestablement encourageante.

Les principes de la phagothérapie

Afin d’illustrer notre propos, ce paragraphe sera agrémenté d’exemples tirés de la littérature dédiée à l’application en médecine humaine car elle demeure la plus abondante. Comparativement aux antibiotiques et autres agents antibactériens d’origine chimique, les bactériophages présentent une spécificité d’hôte beaucoup plus étroite. Ainsi, la très grande majorité des bactériophages caractérisés sont spécifiques d’une espèce bactérienne et le plus souvent d’un nombre restreint de souches au sein de cette espèce. Des exceptions existent, comme le bactériophage P1, capable d’infecter E. coli K12 et certaines souches de Shigella et Salmonella[5], le bactériophage EcS1 capable de lyser des souches appartenant à trois espèces bactériennes distinctes : Shigella spp., Salmonella enterica, E. coli[6] ou encore certains bactériophages de Sphaerotilus natans capables d’infecter également Pseudomonas aeruginosa et E. coli[7]. Par contre, des bactériophages capables d’infecter à la fois des bactéries à Gram positif et à Gram négatif n’ont jamais été décrits, probablement à cause de l’organisation membranaire très différente de ces deux familles de bactéries.

Il peut toutefois exister un biais dans les données relatives aux spectres d’hôtes des bactériophages. En effet, les données disponibles concernant le spectre d’hôte de chaque bactériophage isolé reflètent d’autant plus la réalité que le bactériophage aura été testé sur un nombre conséquent de souches qui présentent des génotypes différents, représentatifs au mieux de l’espèce bactérienne ciblée (nécessité de collections de souches larges et multicentriques). De façon corollaire, comme précisé plus haut, la variation génotypique existant au sein d’une espèce bactérienne est également une donnée importante : le nombre théorique de bactériophages requis pour couvrir l’ensemble des souches d’une espèce bactérienne faiblement diversifiée sera plus faible que s’il s’agit de couvrir celles d’une espèce présentant un polymorphisme génétique important. Par exemple, les souches de S. aureus résistant à la méticilline (SARM) présentent une faible diversité génotypique, ce qui permet l’utilisation d’un faible nombre de bactériophage pour traiter des infections causées par ce germe [8]. Par contre, pour des infections provoquées par exemple par E. coli, la diversité intra-espèce est très importante et finalement peu de bactériophages pourront couvrir plusieurs souches pathogènes [9]. L’utilisation de bactériophages à spectre étroit pourrait aussi limiter les risques d’affecter des souches commensales de la même espèce bactérienne, comme E. coli par exemple. La structure réceptrice ciblée par le bactériophage lors de sa fixation à la bactérie et le caractère conservé/essentiel ou bien très variable de cette structure au sein de l’espèce bactérienne est certainement l’un des paramètres majeurs expliquant cette spécificité [10]. Notons enfin que l’étude de la sensibilité d’une souche bactérienne vis-à-vis d’un panel de bactériophages d’intérêt thérapeutique (phagogramme) est réalisée in vitro et qu’une transposition directe du résultat obtenu (sensible ou résistant) n’est pas systématiquement extrapolable au sein du site infectieux in vivo, du fait des mêmes limites que celles observées avec les antibiotiques (pharmacocinétique, diffusion/concentration sur le lieu de l’infection, discordance entre test sur milieu liquide et milieu solide, etc.).

Dans l’approche thérapeutique humaine, l’utilisation d’une association de plusieurs bactériophages différents semble la plus rationnelle. Cette association en cocktail est justifiée par deux raisons :

  • augmenter le spectre global de couverture du mélange en sommant les spectres individuels de bactériophages ciblant différents récepteurs bactériens ;
  • minimiser la probabilité d’apparition d’une souche résistante au cocktail : il est en effet plus difficile pour une souche de résister simultanément à plusieurs assaillants qu’à un seul.

Ce dernier point impose néanmoins que les bactériophages du cocktail possèdent des spectres d’hôtes redondants (la bactérie est ciblée par plusieurs phages différents), les mécanismes d’infection des bactériophages ne soient pas antagonistes (récepteurs bactériens différents) et le mécanisme de résistance bactérienne à l’un des bactériophages ne bloque pas l’action d’autres bactériophages [11]. Enfin, il convient de s’assurer que les bactériophages ne se neutralisent pas les uns les autres lorsqu’ils sont assemblés en cocktails [12].

Si l’utilisation de cocktails repose sur des principes simples, leurs mises en œuvre pour traiter des patients sont quant à elles envisagées de deux manières différentes : une approche sur-mesure (personnalisée) ou prêt-à-porter (pour le plus grand nombre) [13].

Dans l’approche sur-mesure, il s’agit d’apporter le ou les bactériophages les plus actifs sur l’agent étiologique qui doit, par définition, être connu et isolé. La largeur du spectre du ou des bactériophages importe peu dès lors que ceux-ci infectent le pathogène causal. Le caractère personnalisé impose de choisir le ou les meilleurs candidats au sein d’une collection préétablie (phagothèque), ou du patient lui-même (exploitation de son « phagobiote ») ou encore plus simplement de l’environnement (isolement de novo). Cette approche est particulièrement pertinente dans le cadre des infections chroniques et/ou pour lesquelles un délai de prise en charge (nécessaire à l’exécution des tests d’activité bactériophage-bactérie) est possible.

Dans le cas du prêt-à-porter, il s’agit d’administrer un cocktail préétabli, dont le champ d’action a été déterminé au préalable. La conception d’un cocktail est idéalement basée sur des données épidémiologiques (E. coli est la bactérie retrouvée dans plus de 90 % des infections urinaires communautaires par exemple) et sur des données phénotypiques (par exemple 80 % des souches rencontrées dans ce type d’infection expriment tel phénotype spécifiquement ciblé par tel phage). Il est constitué de façon à obtenir la couverture la plus large possible des souches statistiquement les plus représentées dans un type d’infection donné. Il s’agit donc d’un cocktail permettant de cibler plusieurs souches bactériennes connues pour être impliquées dans les infections considérées. Toutefois, cette stratégie est susceptible de laisser non couverte une fraction microbiologique épidémiologiquement moins représentée (pari microbiologique, au même titre que celui fait lors d’une antibiothérapie probabiliste).

Ces deux approches ne s’excluent pas l’une de l’autre et sont conceptuellement adaptables à chaque situation clinique. De plus, la réévaluation périodique de la composition de ces cocktails semble nécessaire afin de garantir une activité antibactérienne optimale, afin de s’adapter aux résistances des souches qui apparaîtront inéluctablement et d’accompagner les modifications d’épidémiologie bactérienne [11].

Applications des bactériophages en médecine humaine

Actuellement, la prévalence croissante des infections causées par des bactéries multirésistantes est inquiétante comme le souligne un rapport récent de l’Organisation mondiale de la santé (http://www.who.int/mediacentre/news/releases/2017/running-out-antibiotics/fr/). Il est ainsi devenu urgent de développer de nouvelles stratégies anti-infectieuses. Si l’utilisation des bactériophages comme agents antibactériens n’est pas une solution universelle, elle est réaliste tant en termes économiques que temporels. À la lumière des connaissances fondamentales obtenues au cours de plus de 100 années de recherche, des approches médicales et scientifiques rigoureuses se mettent aujourd’hui en place pour lever les derniers obstacles à la réintroduction de la phagothérapie en médecine humaine dans les pays ayant oublié ou négligé cette approche thérapeutique.

Bien que les bactériophages aient été les premiers agents spécifiquement antibactériens proposés à partir de 1917 par Félix d’Hérelle [14], le destin thérapeutique des bactériophages s’est heurté à plusieurs erreurs historiques qui leur ont jeté un fort discrédit de manière pourtant fortuite : ainsi, au début du siècle (1920-1940), les bactériophages étaient produits selon des standards différents de ceux d’aujourd’hui avec d’importants problèmes concernant qualité et quantité de produit fini, conduisant à la commercialisation de préparations dont l’efficacité était variable, voire nulle [15]. De plus, les indications retenues à l’époque n’étaient pas toujours fondées (on pouvait par exemple utiliser des préparations de bactériophages réputées traiter certaines infections que l’on sait maintenant causées par le virus herpès [16]. De même, l’utilisation de certaines préparations n’était pas toujours appropriée du fait d’une méconnaissance de l’écologie bactérienne impliquée (ce qui arrive encore également de nos jours avec la prescription d’antibiotiques dans le cadre d’infections non systématiquement bactériennes [17]). Enfin, la forte spécificité des bactériophages est un de leur avantage majeur (respect du microbiote, absence d’acquisition de résistance chez les souches non ciblées) mais constitue en même temps l’un des points les plus contraignants (pour choisir le ou les bactériophages actifs, il demeure nécessaire d’isoler l’agent étiologique, de tester sa sensibilité par un « phagogramme », puis de produire la préparation thérapeutique). Toutes ces étapes rendent la phagothérapie plus contraignante par comparaison à l’administration d’antibiotiques à large spectre. Malgré la découverte de nombreux nouveaux antibiotiques, la production de bactériophages thérapeutiques a perduré jusqu’à la fin des années 1970 en France (figure 1) où plusieurs préparations étaient inscrites dans le dictionnaire Vidal.

La phagothérapie consiste en l’application de bactériophages dits « virulents » (i.e. ne réalisant qu’un cycle lytique, sans cycle lysogénique, qui est une caractéristique des bactériophages dits « tempérés ») pour le traitement d’une infection bactérienne. Même si aucun obstacle conceptuel ne s’oppose à l’action théorique des bactériophages quel que soit le type d’infection, certaines considérations pratiques en limitent l’applicabilité. Par exemple, les méningites, par l’existence de la barrière hématoencéphalique qui impose déjà une forte majoration des posologies d’antibiotiques, constituent des infections dont la prise en charge thérapeutique par des bactériophages n’apparaît pas prioritaire en termes de balance bénéfice-risque, même si elle s’est révélée expérimentalement efficace chez le rat nouveau-né [18]. Inversement, la capacité des bactériophages à augmenter leur concentration au site infectieux suite à leur réplication aux dépens de l’agent pathogène en fait des alliés particulièrement intéressants dans les infections où les antibiotiques diffusent mal : infections osseuses ou articulaires, matériel prothétique, infections de type abcès, empyèmes, etc. [19–21].

Le caractère aigu ou chronique (cinétique intrinsèque) et la morbidité-mortalité de l’infection sont des paramètres déterminant pour l’application (ou non) de la phagothérapie. Ainsi, dans la plupart des infections chroniques, la bactérie responsable est connue et le pronostic vital des patients n’est généralement pas engagé en termes d’heures ou de jours. Il est alors possible d’adopter une approche personnalisée « sur-mesure » (voir ci-dessus). Inversement, la phagothérapie sur-mesure n’est pas recommandée dans le cas des infections aiguës menaçant le pronostic vital, puisqu’on souhaite un traitement efficace le plus rapidement possible alors que la plupart du temps, la bactérie responsable n’est pas encore identifiée. Par ailleurs, dans la mesure où les bactériophages n’infectent que des cellules bactériennes, la phagothérapie est d’un recours limité pour les bactéries pathogènes ayant un développement exclusivement intracellulaire (par exemple Coxiella burnetii, Chlamydia spp., Rickettsia spp., Tropheryma whipplei) et/ou à croissance intracellulaire facultative (par exemple Legionnella pneumophila, Bartonella spp., Brucella melitensis, Helicobacter pylori).

La modélisation de la pharmacocinétique des bactériophages nécessite de prendre en compte de nombreux paramètres liés à leur cycle viral, tels que la constante d’adsorption des virus sur les bactéries hôtes, le nombre de virions libérés par cycle, le temps de latence, la quantité de bactéries initiales et le ratio bactériophage/bactérie (on parle de multiplicité d’infection). De même, la densité bactérienne minimale pour assurer un amorçage de la multiplication/transmission virale doit être connue : par analogie, on sait que certaines maladies virales humaines introduites dans une zone peu peuplée auront une probabilité d’émergence plus faible que si elles sont introduites dans un environnement urbain, avec comme conséquence une extinction précoce de l’épidémie par défaut de relais. La modélisation se complexifie encore lorsque l’on prend en compte la dynamique de la population bactérienne au cours du temps (les cellules non infectées continuant à se répliquer) ainsi que les phénomènes de résistance aux bactériophages et d’amplification de ceux-ci au cours du traitement [22]. Cette pharmacocinétique si particulière n’est que peu abordée dans les études expérimentales animales, typiquement en raison de sa complexité (détermination des constantes virales in vivo, inoculum bactérien, constante d’élimination virale spontanée, etc.). Il s’agit cependant d’une approche fondamentalement importante et qui, faute d’avoir été prise en compte, pourrait expliquer un certain nombre d’échecs antérieurs de la phagothérapie [23]. La modélisation théorique de la pharmacocinétique a ainsi permis de corréler positivement et significativement les résultats prédits avec ce qui est observé in vitro[24] mais difficilement in vivo[25], prouvant la nécessité de poursuivre les études dans ce domaine.

Chez les mammifères (humains comme animaux), la mise en contact d’un virus avec les tissus (par voies cutanée, orale, respiratoire ou intraveineuse) est à même de provoquer une réaction immunitaire, potentiellement délétère pour l’hôte. Toutefois, de manière singulière, les bactériophages ne semblent pas provoquer d’effet toxique [26]. En effet, ces particules virales sont largement présentes dans divers microbiotes avec lesquels les mammifères sont en interactions permanentes, comme par exemple l’intestin [27, 28].

L’innocuité des bactériophages a ainsi pu être démontrée dans différentes études. Au plan expérimental en premier lieu, des études réalisées in vivo (modèle murin) et ex vivo (sur cellules dentritiques) ont montré que le bactériophage T4 administré par voie intrapéritonéale (T4 entier ou ses protéines majeures de capside) n’a pas induit la production de cytokines de la phase aiguë. Mis au contact de cellules dendritiques, le bactériophage T4 ne provoque pas la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) [29]. Enfin, une activité immunomodulatrice des bactériophages a été proposée mais sa pertinence demande à être vérifiée in vivo[30]. Une étude récente a montré que l’administration par voie pulmonaire de deux coliphages chez des souris infectées ou non par des souches pathogènes d’E. coli n’entraînait pas de synthèse significative des cytokines de la phase aiguë de l’inflammation (Il-1b, Il-6, TNFa, KC notamment) par rapport aux souris ayant reçu le solvant ou un traitement antibiotique de référence [31].

Chez l’homme, on peut par exemple mentionner l’Institut Ludwik-Hirszfeld en Pologne qui a suivi des patients (n = 157 sur trois ans) présentant différentes infections à germes multirésistants, notamment urinaires, osseuses ou respiratoires, et traités par phagothérapie pendant plusieurs semaines. Un suivi biologique de différents paramètres (numération de la formule sanguine, bilan hépatique, fonction rénale et protéine C réactive) a été réalisé après le début du traitement et comparée à la situation avant traitement. Aucune variation cliniquement pertinente de ces paramètres n’a été observée chez ces patients démontrant l’innocuité des bactériophages dans ces conditions [32]. De manière similaire, aucun des volontaires (n = 15) ayant réalisé trois prises orales par jour pendant deux jours du bactériophage T4 ciblant E. coli n’a présenté d’effets indésirables, ni d’élévation des marqueurs de cytolyse hépatique ni même développé d’anticorps dirigés contre le bactériophage T4 lors d’analyses réalisées à la fin de la période d’observation [33]. Notons que cette innocuité des bactériophages ne se limite pas au phage T4, mais a aussi été montré avec d’autres applications, voire par exemple l’ingestion de cocktail commerciaux par voie orale [34].

De nombreux cas de patients traités par phagothérapie ont également été rapportés dans la littérature, non obligatoirement centré sur la question de l’innocuité, mais n’ont pas mis en évidence de problème de tolérance, alors même que l’administration de bactériophages était réalisée par voie intraveineuse [35-40].

Outre leur innocuité, l’administration des bactériophages est à même de générer la formation d’anticorps spécifiques. Historiquement, le bactériophage ϕX174 (un microviridae infectant E. coli) a été utilisé à partir des années 1960 chez l’homme, en injection intraveineuse, pendant plus de 30 ans, afin d’induire et de quantifier une réponse immunitaire en dosant la présence d’anticorps spécifiques à ce bactériophage [41-43]. On signalera par ailleurs qu’aucun effet secondaire sérieux n’a été rapporté chez ces patients qui recevaient par voie intraveineuse des doses de 2,109 particules virales (PFU) par kilogramme de poids corporel, générant des concentrations plasmatiques post-injection de l’ordre de 5,107 PFU/mL (trois injections au total, espacées de six semaines, étaient réalisées). Les patients immunocompétents développaient tous un schéma de réponse normale avec synthèse d’immunoglobulines de type IgM puis IgG de forte affinité. Ces anticorps possédaient un pouvoir neutralisant envers le bactériophage ϕX174. Des résultats similaires ont été observés avec le bactériophage T4 [44]. Cependant, cette production d’anticorps n’est pas toujours synonyme d’inactivation virale puisque les anticorps produits peuvent être non neutralisants, n’entravant pas le pouvoir infectieux du bactériophage [45].

Enfin, une étude récente permet de poser la question de l’efficacité de la phagothérapie en fonction de l’état immunitaire de l’hôte. C’est pour répondre à cette question que la variation de l’immunocompétence de l’hôte a été étudiée dans un modèle murin d’infection respiratoire [46]. Les auteurs ont pu montrer que les souris immunocompétentes survivent à une infection létale grâce au traitement par un bactériophage, tandis que des souris immunodéprimées ne survivent pas plus qu’en l’absence de traitement par bactériophage. Plus précisément, l’échec de la phagothérapie chez les souris immunodéprimées semble être dû à l’absence de neutrophiles qui limitent, chez les animaux immunocompétents, la croissance des bactéries devenues résistantes au bactériophage utilisé (figure 2). Ces travaux montrent bien la synergie entre le système immunitaire et les bactériophages et la nécessité de prendre en considération les interactions tripartites entre bactériophages, bactéries et cellules immunitaires pour contrôler au mieux l’application des traitements.

Lors d’un traitement antibactérien par molécule chimique ou par phagothérapie, les bactéries lysées peuvent induire une réaction immunitaire aiguë par le relargage d’une quantité importante de molécules immunogènes (endo- et exotoxines, ADN bactérien). Plus précisément, chez les bactéries à Gram positif, il s’agit des acides lipoteichoïques et du peptidoglycane principalement, et chez les bactéries à Gram négatif du lipopolysaccharide (notamment sa fraction lipidique : le lipide A ou endotoxine). Récemment, une étude comparative entre antibiotiques et bactériophages a permis de montrer que le taux d’endotoxine libéré par l’action des bactériophages est bien inférieur à celui obtenu avec des β-lactamines couramment utilisées en clinique [47]. Mieux, les bactériophages et les antibiotiques peuvent être utilisés de manière complémentaire, et ce pour diminuer l’apparition de génotypes bactériens résistants à l’un ou l’autre traitement [48, 49].

Ainsi, quatre situations pratiques peuvent être schématiquement envisageables :

  • l’infection est aiguë et sévère, liée à un germe ne posant pas de problème connu d’antibiorésistance où une antibiothérapie conventionnelle est envisageable : dans ce cas la phagothérapie n’est pas pertinente ;
  • l’infection est sévère ou non, mais causée par une bactérie multirésistante dont la prise en charge par des antibiotiques de référence est impossible, conduisant à l’utilisation d’antibiotiques moins actifs ou non validés ou présentant des effets secondaires indésirables (e.g. insuffisance rénale liée à l’usage de la colistine) : un co-traitement par antibiotiques et bactériophages est pertinent. Dans ce cas, peu de données existent concernant la temporalité optimale d’utilisation de ces deux traitement anti-infectieux (co-administration, antibiotiques puis bactériophages ou l’inverse). Certains auteurs ont ainsi pu démontrer l’importance d’une séquentialité (phages puis antibiotiques) dans le contrôle bactérien et l’apparition de bactéries résistantes aux antibiotiques [50]. Par ailleurs, il existe un nombre croissant de publications qui font état d’un effet synergique fort entre ces deux thérapeutiques, notamment en présence de concentrations sub-inhibitrices d’antibiotiques (situation fréquente en cas de résistance ou en fin de traitement ou encore de mauvais usage). Par un mécanisme mal élucidé, l’utilisation simultanée d’antibiotique majore le pouvoir lytique des bactériophages avec notamment une augmentation de la quantité de virions libérés [51-54]. D’autres travaux ont également mis en évidence une synergie en termes de diminution de la résistance au virus et à l’antibiotique. Par exemple, au cours d’un traitement compassionnel, Chan et al., ont utilisé un bactériophage anti-pseudomonas dont le récepteur bactérien est une protéine d’efflux impliquée dans l’efflux de certains antibiotiques (et donc leur résistance) [35]. Pour la bactérie, un des mécanismes de résistances au phage est une mutation (ou diminution de l’expression) de ce récepteur-pompe, laquelle va aboutir à une perte de cette fonction d’efflux, restaurant alors une sensibilité à l’antibiotique ;
  • l’infection est causée par un germe responsable d’une infection bénigne et chronique pour laquelle le traitement antibiotique n’apparaît pas pertinent, contre indiqué (allergie) ou peu efficace (problème de diffusion, résistance, colonisation chronique) : le traitement peut alors être envisagé exclusivement par la phagothérapie. Il s’agit typiquement des infections cutanées (furonculose, infection du pied chez le patient diabétique, folliculite, impétigo peu étendu par exemple) [37] ou de la sphère ORL (otites chroniques par exemple) [55] ;
  • il n’y a pas d’infection mais une situation de colonisation par un pathogène (à même de provoquer secondairement une infection). On peut notamment inclure les colonisations urinaires (à l’origine des cystites chroniques), les colonisations bronchiques (mucoviscidose et dilatation de bronches, en dehors des décompensations), les colonisations à germes multirésistants (digestives avec les entérobactéries ou cutanéomuqueuses avec les souches de S. aureus résistant à la méticilline), ou encore les colonisations oropharyngées des patients sous ventilation mécanique. Le propos d’une phagothérapie est ici de cibler le réservoir bactérien, de réaliser une épargne antibiotique et d’exercer une action essentiellement prophylactique.

À ce jour, le nombre de cas individuels traités avec succès par bactériophages augmente rapidement dans le monde [35, 38, 40], mais peu d’études cliniques conduites selon la méthodologie de référence (étude en double insu, randomisée et contrôlée contre placebo ou traitement de référence) ont été publiées [56]. Ce faible nombre d’essais cliniques et la qualité variable des publications rapportant les cas individuels rendent ainsi difficile l’interprétation des résultats et diminuent la robustesse des conclusions. Néanmoins, nous rappellerons brièvement les faits marquants issus des trois essais cliniques les plus récents.

Le premier a concerné l’efficacité thérapeutique des bactériophages dans les otites chroniques à P. aeruginosa multirésistant [55] (essai contrôlé, en double insu, contre placebo). Le critère de jugement principal était clinique (évaluation des lésions par le médecin avec un score composite et évaluation par le patient de ses symptômes avec également un autre score). Le critère de jugement secondaire était le compte bactérien. Vingt-quatre patients ont été inclus (les patients présentant une infection à P. aeruginosa résistant au cocktail de six bactériophages étaient exclus). Le cocktail était administré localement par voie intra-auriculaire une unique fois à j0 avec un suivi à j7, j21 et j42. Les résultats de l’étude sont positifs sur les critères de jugement principal et secondaire avec cependant un effet antibactérien de faible amplitude (réduction du compte bactérien inférieure à un facteur 10).

La deuxième étude (NCT00937274) a porté sur le traitement des diarrhées du jeune enfant (six à 24 mois) à E. coli (souches entérotoxinogènes et entéropathogènes principalement) au Bangladesh. Cet essai randomisé contrôlé monocentrique a comparé une prise en charge thérapeutique par une solution de réhydratation orale (traitement commun) avec traitement oral par cocktail de bactériophages ou bien placebo [57]. Deux cocktails de phages étaient testés : un cocktail de 11 phages de type T4, issu de la recherche Nestlé et un cocktail commercial de la société Microgen. Le critère de jugement principal était la tolérance et l’innocuité du cocktail de phage. Le critère de jugement secondaire était la capacité du cocktail à s’amplifier dans les selles et à diminuer la quantité d’E. coli entérotoxinogènes. Le troisième critère de jugement était l’impact des cocktails sur le volume et la fréquence des selles ainsi que le volume d’hydratation nécessaire. Des analyses du microbiote fécal ont également été réalisées.

Cent vingt patients ont été inclus. Aucun effet secondaire attribuable aux cocktails n’a été mise en évidence (évaluation clinique et biologique sur des paramètres rénaux, hépatiques et hématologiques). Les cocktails se sont révélés inefficaces sur le plan clinique (critère de jugement tertiaire). En prenant en compte la quantité de phage administré, il n’a pas été observé d’amplification significative des phages des deux cocktails dans les selles, même chez les patients porteurs de souches d’E. coli sensibles aux phages administrés. Aucune diminution significative de la quantité d’E. coli entérotoxinogène dans les selles n’a été mise en évidence chez les patients traités par phages. La négativité de cet essai peut a posteriori s’expliquer en partie par une prévalence plus faible qu’attendue d’infection à E. coli entéropathogène (60 % des 120 patients inclus seulement) et par un titre bactérien faible dans les selles, ne permettant pas de soutenir une réplication virale des bactériophages administrés. D’autre part, seulement 50 % des patients présentaient des souches d’E. coli sensibles aux cocktails, avec une corrélation positive entre symptômes (diarrhées) et quantité de germes du genre Streptococcus dans les selles (analyse du microbiote fécal) soulevant la question de l’agent causal réel de ces diarrhées [58]. Enfin, l’administration des phages se faisait sans neutralisation du pH gastrique, ce qui a pu conduire à une destruction importante des virus administrés et donc une biodisponibilité très réduite en aval de l’estomac.

L’étude la plus récente (non aveugle, randomisée, contrôlée), dénommée PhagoBurn (NCT02116010), a évalué l’effet de l’application locale d’un cocktail de 12 bactériophages ciblant P. aeruginosa (infections monogermes) sur les complications infectieuses des plaies de patients brûlés, comparé à la sulfadiazine argentique (traitement antiseptique local de référence) [12]. Le critère de jugement principal était le délai de réduction de l’inoculum bactérien par une méthode semi-quantitative (écouvillonnage quotidien de la plaie et dénombrement sur milieu gélosé). Vingt-sept patients ont été inclus (13 traités par le cocktail de bactériophages, 14 par la sulfadiazine argentique) au cours d’une période de 13 mois. Cet essai s’est révélé négatif, avec une efficacité significativement moindre du cocktail de bactériophages. Aucun effet indésirable n’a été mis en évidence chez les patients traités par bactériophages. Une analyse effectuée a posteriori a révélé une diminution majeure du titre de bactériophages dans les lots thérapeutiques, aboutissant à une application très réduite du nombre de bactériophages sur les plaies (concentration finale active observée autour de 102 PFU/mL comparée à une concentration attendue d’au moins 106 PFU/mL). De plus, certaines souches bactériennes isolées des patients présentaient une sensibilité intermédiaire, voire une résistance, au cocktail de bactériophages.

Notons toutefois que d’autres essais cliniques sont en préparation en France, en Europe et aux États-Unis, s’appuyant sur des start-ups (e.g. Pherecydes Pharma en France, Vésale Pharma en Belgique, Armata Pharmaceuticals aux États-Unis), ce qui apportera rapidement de nouveaux résultats permettant :

  • de mieux définir les indications thérapeutiques ;
  • de tenir compte des écueils passés et ne pas négliger les paramètres propres à la pharmacodynamie, pharmacocinétiques et galénique optimale des préparations de bactériophages ;
  • de mieux définir la place d’une stratégie « prêt-à-porter » (cocktail de phages générique et fixe) comparée à une stratégie « sur-mesure » (un ou plusieurs phages spécifiquement sélectionnés pour cibler la bactérie causale).

Enfin signalons qu’aux États-Unis, dans l’État de Californie, un centre de référence a été récemment créé (juin 2018), avec pour objectif de centraliser et répondre aux demandes de traitement compassionnels par phagothérapie (Center for Innovative Phage Applications and Therapeutics, IPATH). Cette structure, basée à San Diego et sous la responsabilité de la faculté de médecine, se positionne également comme un acteur-clé visant à promouvoir les échanges entre partenaires industriels et institutionnels, dans un objectif thérapeutique premier.

Les applications des bactériophages dans l’agriculture et l’agroalimentaire

Les bactéries pathogènes sont aussi une menace pour la sécurité alimentaire et donc la santé humaine. Dans l’industrie alimentaire, les élevages d’animaux et l’agriculture, l’interdiction ou la réglementation plus stricte de l’usage d’antibiotiques a provoqué rapidement un intérêt vers d’autres solutions antimicrobiennes telles que les bactériophages. Mais l’application des bactériophages dans en agriculture et en agroalimentaire est particulièrement complexe. En effet, ces différents environnements recèlent des substances telles que les matrices des aliments ou les particules du sol, qui peuvent inhiber l’attachement des bactériophages à ses bactéries hôtes. Également, en plein champ, les radiations UV ou le pH extrême de certains sols sont des facteurs limitants, qui cependant peuvent être contournés ou dont l’impact peut être réduit.

Les infections bactériennes chez les plantes entraînent des pertes économiques massives dans le domaine de l’agriculture [59]. La gestion des maladies de plantes comprend majoritairement la sélection de cultivars résistants ou l’utilisation de produits chimiques tels que les métaux lourds ainsi que les antibiotiques dans certains pays. Plusieurs limitations à ces approches existent, y compris l’augmentation des parasites résistants aux deux dernières mesures. De plus, les antibiotiques se répandent dans le sol et l’eau et ont des conséquences majeures en santé humaine et dans l’environnement du fait de la sélection de bactéries multirésistantes [60, 61]. Les stratégies de lutte biologique cherchent à développer des méthodes durables et naturellement intégrées pour résoudre ces problèmes, illustrés par les progrès réalisés dans la lutte biologique contre les insectes nuisibles [62]. En agriculture, le développement de stratégies de lutte biologique a été encouragé par des initiatives telles que le plan EcoPhyto du ministère français de l’Agriculture. En dépit d’un impact majeur sur la production alimentaire mondiale, la gestion durable des maladies bactériennes des plantes est encore très limitée.

Dans le contexte agricole, des préparations de bactériophages contre les bactéries pathogènes de plantes ont été utilisées dès 1924 et représentaient donc des agents de biocontrôle pionniers [63]. Des essais en serre et sur le terrain contre les principaux phytopathogènes tels que Xanthomonas spp. (y compris Xylella sp.), Erwinia amylovora, Streptomyces scabies ou Ralstonia solanacearum ont été concluants (figure 3) [64]. De même, un essai de biocontrôle au vignoble a été rapporté au Texas afin de traiter (de manières curative et prophylactique) le pathogène Xylella fastidiosa, responsable de la maladie de Pierce de la vigne [65]. De manière intéressante, plusieurs entreprises se sont lancées dans la production de bactériophages, certaines comme Omnilytics (originaire des États-Unis, mais achetée en 2015 par l’entreprise chinoise Phagelux) depuis plus de 15 ans, avec des produits tels que AgriPhage dont l’objectif est de protéger les cultures de tomates et de poivrons de l’attaque des pathogènes Xanthomonas pestris et Pseudomonas syringae, à la fois en agriculture conventionnelle et biologique [66]. En 2019, la même entreprise a débuté la commercialisation d’une préparation de bactériophages contre E. amylovora, bactérie responsable du « feu bactérien », l’une des maladies les plus problématiques pour les pommiers et poiriers en Europe actuellement. Les bactériophages dans l’agriculture aux États-Unis ont un statut de GRAS (generally recognized as safe), qui simplifie énormément leur réglementation auprès de la Food and Drug Administration (FDA). On notera également la commercialisation en Grande-Bretagne par APS Biocontrol d’une approche de contrôle post-récolte assurant la protection des pommes de terre ensachées vis-à-vis de bactéries d’altération. Cette entreprise a connu un succès commercial important au Royaume-Uni (plus de 40 % des pommes de terre des supermarchés traités avec bactériophages), et elle est en train de finaliser un produit contre Pseudomonas sp. pour traiter des salades emballées et des raisins secs. Il faut noter que les préparations de bactériophages d’APS Biocontrol ont été approuvées en tant qu’« auxiliaires technologiques », sans besoin d’étiquetage ou de tests de toxicité, au contraire des produits classifiés en tant que biocides pour une utilisation en plein champ.

Dans les élevages européens, suite au bannissement des antibiotiques utilisés comme promoteurs de croissance, l’intérêt pour les bactériophages se développe. C’est certainement en pisciculture que les essais sont les plus avancés, dans les pays nordiques, pour lutter contre les pathogènes de la truite arc-en-ciel et du saumon, en particulier Flavobacterium psychrophilum[67]. CUSTUS®YRS est un produit commercialisé par une entreprise norvégienne récemment approuvé, en tant qu’auxiliaire technologique également, pour contrôler Yersinia ruckeri, un pathogène du saumon très problématique en aquaculture. Un très net intérêt est également manifesté dans la filière aviaire, qui repose sur des cocktails contre Salmonella ou Clostridium perfringens commercialisés en Europe par Intralytix [68]. Certaines infections bovines causées par S. aureus ou porcines par E. coli sont aussi ciblées par plusieurs entreprises à l’aide de bactériophages. En somme, le potentiel des bactériophages en agriculture semble majeur, car la phagothérapie peut s’appliquer à un large éventail de pathosystèmes, en prévenant les risques émergents de pathogènes associés au changement climatique. De plus, la phagothérapie est hautement complémentaire à d’autres méthodes respectueuses de l’environnement, permettant une gestion intégrée des maladies des plantes ou des animaux. Les défis sur les conditions d’application des bactériophages sont immenses au regard de la variété des situations, rendant prioritaire le renforcement de la recherche sur les conséquences environnementales de l’emploi de bactériophages à grande échelle. En effet, les dynamiques naturelles entre bactériophages et bactéries dans les environnements agricoles sont peu connus par rapport aux milieux marins ou au tube digestif des animaux. Il est maintenant nécessaire d’intégrer les bactériophages dans les études à venir sur le microbiote du sol, des plantes et des eaux pour pallier ce manque de connaissances et mieux évaluer les risques des diverses phagothérapies envisagées.

Dans le domaine de l’agroalimentaire, les bactériophages complètent l’arsenal des outils de maîtrise de la sécurité des aliments. Ils permettent de limiter le développement des pathogènes pendant les étapes de transformation et/ou sur les surfaces en contact avec les aliments.. L’exemple le plus représentatif est Listeria monocytogenes, qui revêt une forte priorité dans les industries alimentaires dans les secteurs des produits laitiers, de la viande et du poisson [69]. Depuis 2007, deux cocktails de bactériophages anti-Listeria sont disponibles et bénéficient des agréments conjoints des autorités sanitaires américaines (FDA), canadiennes (Environmental Protection Agency [EPA]) et plus tardivement européennes (European Food Safety Agency [EFSA]). Ces produits (ListShield™, société Intralytix et PhageGuard Listex ™, société Micreos Food Safety, figure 4) sont actuellement implémentés par les grands groupes agroalimentaires dans les processus de production et conditionnement des aliments à risques, où ils participent à la maîtrise du risque de contaminations. Ces produits sont utilisés comme auxiliaires technologiques, en complément des bonnes pratiques d’hygiène et de production. En Europe, il n’y a pas encore de position officielle uniforme, mais cependant les ministères de la Santé danois et suisse ont d’ores et déjà rendu un avis officiel autorisant l’utilisation de la préparation ListexP100 comme additif en production alimentaire. Sur le même principe la société Intralytix fabrique également le produit EcoShield autorisé aux États-Unis et au Canada [70] (FDA, 2010), ciblant E. coli O157:H7 responsable de colites hémorragiques graves et FINK TEC GmbH (Hamm, Allemagne) développe le produit Secure Shield E1, actif sur E. coli. Enfin, il convient de mentionner le dynamisme des travaux en cours sur le contrôle d’autres agents de toxi-infections alimentaires comme les salmonelles, shigelles et l’espèce Campylobacter jejuni. Néanmoins, l’interaction phages-bactéries au sein des matrices alimentaires traitées (qui peuvent être d’une complexité physicochimique très variable selon l’aliment considéré) est un paramètre important à prendre en compte : certaines matrices immobilisent les phages après leur introduction, limitant ainsi leur action vis-à-vis du pathogène en cas de re-contamination. Ces points ont notamment été soulignés par l’ANSES lors d’une saisine en 2014 (2013-SA-0111).

Dans les industries agroalimentaires, les travaux s’élargissent aujourd’hui au biocontrôle par les bactériophages des flores indésirables responsables de la production d’amines biogènes [71] ou de déviations organoleptiques au cours des procédés de fermentations. Les bactériophages sont ainsi envisagés afin de réduire les flores productrices d’amines biogènes ou encore les flores d’altération dans les filières laitière et viticole [72-75]. Les avancées récentes dans l’utilisation commerciale des bactériophages en agriculture ou dans l’industrie alimentaire ne se reflètent pas dans les données scientifiques publiées. Des détails sur les préparations de bactériophages déjà commercialisés, les modes d’application ou les résultats acquis sont encore trop peu nombreux et justifient la mise en place d’études supplémentaires.

Conclusion et perspectives

En résumé, l’utilisation des bactériophages à visée thérapeutique présente plus d’avantages que d’inconvénients. Ils sont brièvement résumés dans le tableau 1. Pour être utilisé en thérapeutique, un bactériophage devra être défini et « labellisé » en répondant à un cahier des charges précis tel que proposé par certains auteurs [76, 77]. Comme nous l’avons vu, l’utilisation de la phagothérapie en santé humaine ou dans l’agroalimentaire (animale ou végétale) doit suivre des règles strictes afin de garantir toutes les conditions d’efficacité et d’innocuité pour les hôtes (humains, animaux, plantes) mais également leur impact faible ou absent sur l’environnement. Par ailleurs, il est important de considérer que cette thérapie peut être complémentaire aux autres stratégies de luttes antibactériennes actuellement en cours de développement, tels que les peptides antimicrobiens, les agents modulant l’immunité (e.g. vaccins et immunostimulants), les pro- et prébiotiques, les extraits de plantes, les inhibiteurs ciblant les facteurs de virulences (e.g. quorum-sensing, biofilm ou toxines), les anticorps et les protéines de lyse. Il n’en demeure pas moins que l’un des grands avantages de la phagothérapie, lorsque appliquée aux pathogènes les plus fréquemment ciblés chez l’homme (entérobactéries, Pseudomonas, Staphylococcus) et lorsque comparé au processus d’élaboration d’un nouvel antibiotique par exemple, est sa grande capacité à être adaptable dans un délai assez court (de quelques jours à quelques semaines). Ainsi, il est tout à fait envisageable de développer rapidement et pour des coûts raisonnables de nouveaux traitements au fur et à mesure que les résistances bactériennes apparaîtront. Cette flexibilité, qui n’existe pas pour les antibiotiques et autres molécules chimiques, doit être préservée pour garantir sur le long terme l’utilisation des bactériophages comme arme antibactérienne. Ces points positifs ne doivent néanmoins pas effacer certaines difficultés rencontrées pour isoler des phages contre certaines souches bactériennes, particulièrement « phago-résistantes ». Il s’agit alors souvent d’une situation complexe où deux paramètres-clés conditionnent la probabilité de succès d’isolement d’un ou de plusieurs phages actifs : le temps et la pluralité – diversité des sources de bactériophages utilisés.

Remerciements

Nous remercions les membres de nos laboratoires respectifs pour leur participation aux travaux et activités du réseau Phages.fr. Nous remercions également les organismes qui financent nos activités au travers d’un réseau thématique pluridisciplinaire depuis 2016 : l’INSB-CNRS, l’INEE-CNRS et l’INRA. Nous tenons également à remercier chaleureusement le Dr Alain Dublanchet pour son soutien inconditionnel à nos travaux et son implication déterminante pour l’obtention du prix de la fondation François-Sommer Homme Nature 2018 attribué à notre réseau le 14 novembre 2018. Pour cette occasion, une version préliminaire de ce manuscrit a été conçue.

Note : certains passages de cette revue sont issus du manuscrit de thèse de Nicolas Dufour (http://www.theses.fr/2015USPCC259).Liens d’intérêts

les auteurs déclarent ne pas avoir de lien d’intérêt en rapport avec cet article.