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Virologie

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Interaction virus-cellule : Fonctions cellulaires Volume 23, numéro 2, Mars-Avril 2019

 

Interaction virus-cellule : Fonctions cellulaires

Jeudi 28 mars 2018, 14 h 00-15 h 15 Amphi Mérieux

Modération : Julie Lucifora, Pierre-Yves Lozach

Communications orales O1 à O5

Affiches P1 à P45

O1

Évolution convergente de virus et de bactéries pour détourner des kinases cellulaires à des fins différentes

Frédéric Sorgeloos, Peeters Michael, Hayashi Yohei, Fabian Borghese, Melissa Drappier, Teresa Cesaro, Didier Colau, Vincent Stroobant, Didier Vertommen, Grégory De Bodt, Stéphane Messe, Ignasi Forne1, Felix Mueller-Planitz, Jean-François Collet, Thomas Michiels

Université Catholique de Louvain, de Duve Institute (UCLouvain), Bruxelles, Belgique

thomas.michiels@uclouvain.be

 

Les picornavirus appartenant au genre des Cardiovirus (virus de l’encéphalomyocardite (EMCV), virus de Theiler (TMEV), virus Saffold (SAFV)) produisent une petite protéine, appelée L, qui correspond à l’extrémité amino-terminale de la polyprotéine virale. Cette petite protéine d’environ 70 acides aminés est multifonctionnelle. Elle perturbe le trafic nucléo-cytoplasmique des ARNs et des protéines cellulaires, inhibe la transcription des gènes d’interféron et empêche l’activation de PKR. Nos données montrent que les différentes activités de la protéine L du virus de Theiler dépendent de l’interaction de cette protéine avec les kinases cellulaires de la famille RSK. Dans des cellules RSK1/2-KO, les différentes activités de la protéine L sont perdues. Ces activités sont restaurées dans des cellules transduites pour réexprimer RSK. De manière intéressante, d’autres pathogènes comme le virus herpès associé au sarcome de Kaposi (KSHV) ou les bactéries du genre Yersinia, produisent également des protéines capables d’activer les kinases RSK. Nos données montrent que les protéines des différents pathogènes utilisent la même interface pour interagir avec les kinases RSK. Néanmoins, alors que la protéine L des Cardiovirus utilise RSK pour inhiber PKR et perturber le trafic nucléo-cytoplasmique, les protéines de Yersinia et de KSHV activent les kinases RSK respectivement pour inhiber l’inflammasome ou activer le cycle de réplication virale. Nous proposons un modèle pour expliquer comment ces différents pathogènes utilisent une stratégie identique à des fins différentes.

 

O2

Retroviral Tax plugs and freezes UPF1 helicase leading to Nonsense Mediated mRNA Decay (NMD) inhibition during HTLV-1 infection

Francesca Fiorini, Jean-Philippe Robin, Joanne Kanaan, Malgorzata Borowiack, Vincent Croquette, Hervé Lehir, Pierre Jalinot, Vincent Mocquet

Laboratoire de biologie et de modélisation de la cellule (LBMC), ENS Lyon, CNRS UMR1210, 69007 Lyon, France

vincent.mocquet@ens-lyon.fr

 

Recent observations from several (+) RNA virus as well as retroviruses converge to demonstrate that the host RNA decay pathway known as Nonsense Mediated mRNA Decay (NMD) constitutes a major threat for virus spreading. NMD is described to target and degrade RNA when translation termination occurs with an inadequate 3’UTR context. Besides degrading defective mRNAs harboring premature termination codons (PTCs), NMD also targets many mRNAs encoding functional full-length proteins. In fine, it regulates the stability of around 15 % of human RNA. There is now much evidence demonstrating that NMD also degrades retroviral RNA. To escape this cellular control, each virus evolved specific counteracting measures. By instance, we found that the human retrovirus HTLV-1 that may lead to two diseases (Adult T cell leukemia and HTLV associated myelopathy) is sensitive to NMD and we found that the viral protein Tax, known to transactivate viral and cellular genes, is also able to directly repress NMD by targeting the conserved and central DNA RNA helicase of NMD known as UPF1. Using human and viral recombinant proteins we showed that the action of Tax is exerted through a physical interaction with the helicase core domain of UPF1 (HD) leading to ATP hydrolysis inhibition. On one hand, ex vivo and in vitro bulk experiments effectively demonstrated that Tax can prevent HD binding to RNA due to steric hindrance. On the other hand, results from endogenous RNA immunoprecipitations, from interferometry experiments and from the magnetic tweezer single molecule assay, revealed that Tax can bind to a UPF1 molecule pre-associated to RNA. The complex Tax/HD is then less sensitive to the ATP and the translocation of UPF on its substrate is strikingly reduced. The identification of a Tax mutant for NMD inhibition finally revealed how Tax shapes host and viral RNA stability to the advantage of the virus. In conclusion, we describe a two-level regulation of UPF1 function by the viral protein Tax from HTLV-1, demonstrating an effect of Tax (1) prior to the binding of UPF1 to RNA and (2) on an actively unwinding enzyme during NMD.

 

O3

Étude de la régulation de l’expression des ARN non-codants au cours de l’infection par la souche HCoV-229E des Coronavirus

Camille Baudesson, Céline Amadori, Margot Morin-Dewaele, Hassan Danso1, Quentin Nevers, Vanessa Demontant1, Christophe Rodriguez2,3,4, Abdelhakim Ahmed-Belkacem1, Christophe Desterke5, Cyrille Feray, Jean-Michel Pawlotsky2,3, Patrice Bruscella 2

1 Centre national de référence des hépatites virales B, C et Delta, Créteil, France, Inserm : U955, Université Paris-Est Créteil Val-de-Marne (UPEC), France2 Institut Mondor de recherche biomédicale (IMRB), Inserm U955, Université Paris-Est Créteil Val-de-Marne-Paris 12, CHU Henri Mondor, Créteil, France3 Unité de virologie, Département de microbiologie, Assistance publique-Hôpitaux de Paris (AP-HP), CHU Henri Mondor, Créteil, France4 Institut Mondor de recherche biomédicale, Plateforme de séquençage haut débit (pACT) (IMRB), Université Paris-Est Créteil Val-de-Marne-Paris 12, Inserm U955, IFR10, Créteil, France5 UMS33 Inserm, Université Paris XI Paris Sud, 14, avenue Paul Vaillant-Couturier, France

jean-michel.pawlotsky@aphp.fr

 

Ces dernières années, l’émergence et/ou la ré-émergence de nombreuses infections virales causant des épidémies mortelles (MERS-CoV en 2012, Ebola virus en 2013), orphelines de traitements spécifiques et donc difficiles à contrôler et à éradiquer, ont attiré l’attention de la communauté scientifique. Afin d’optimiser le processus de développement de nouveaux antiviraux et le nombre de virus ciblés par ces derniers, une approche thérapeutique pan-virale, avec des molécules ciblant plusieurs virus au sein d’une même famille virale ou encore des virus de familles différentes, représente un véritable challenge scientifique. L’étude des fonctions des ARN non codants (ARNnc) constitue une approche de choix dans cette stratégie car une molécule d’ARNnc peut réguler l’expression de nombreux gènes cellulaires dont ceux qui influencent l’infection virale. De plus, de nombreuses études ont montré l’importance des ARNnc au cours de différentes pathologies, dont les infections virales. Les ARNnc sont regroupés en deux familles principales : les petits (microARNs) et longs ARNc (lnCARNs). Nos résultats récents indiquent que la protéine KSRP, essentielle pour l’expression d’ARNnc lors de l’infection par le virus de l’hépatite C, est un facteur proviral pour le virus HCoV-229E, modèle des Coronavirus. Le but de ce travail était d’évaluer l’impact de l’infection par HCoV-229E sur l’expression des ARNnc, d’identifier des ARNnc essentiels pour l’infection et d’étudier la régulation de leur expression par KSRP. Les lignées cellulaires humaines MRC-5 ont été utilisées pour les infections par HCoV-229E. L’expression de KSRP a été diminuée de manière transitoire par transfection de siARNs. La réplication de HCoV-229E et l’expression d’ARNm ou d’ARNnc ont été mesurées par RT-qPCR ou Western Blot. L’interaction directe entre l’ARN viral et la protéine KSRP ou les ARNnc et la protéine KSRP a été évaluée par Immunoprécipitation d’ARN (« RIP »). Les expériences de « Next Generation Sequencing » (« NGS ») ont été réalisées par la plateforme « NGS » de l’hôpital Henri-Mondor. Afin d’identifier les ARNnc modulés au cours de l’infection HCoV-229E et notamment ceux dont l’expression était KSRP-dépendante, nous avons fait une analyse croisée des résultats obtenus par séquençage « NGS » dans quatre conditions : infectée vs non-infectée, et infectée si KSRP vs infectée si négatif ctrl. Nous avons identifié le LinC00473, un lnCARN existant sous deux isoformes, comme un facteur cellulaire très fortement induit par l’infection HCoV229E et dont l’expression était KSRP-dépendante. L’induction de l’expression de LinC00473 est dépendant de la MOI et est transitoire jusqu’à 24 h post-infection. Par transfection de siARNs ciblant l’isoforme 1 de LinC00473 (LinC00473-1), nous avons montré que ce lnCARN était un facteur proviral essentiel pour l’infection HCoV-229E. Des expériences de « RIP » ont montré une interaction directe entre KSRP et LinC00473-1, et des expériences de « silencing » de KSRP montrent que cette protéine est nécessaire pour l’expression de LinC00473-1. Nous avons identifié par séquençage « NGS » un nouvel ARNnc essentiel pour l’infection par HCoV-229E. LinC00473-1 est un nouveau facteur proviral pour l’infection HCoV-229E, induit de manière transitoire 24 h post-infection. Son expression nécessite l’interaction directe avec la protéine KSRP. Cet ARNnc pourrait constituer une nouvelle cible thérapeutique antivirale pan-coronavirus.

 

O4

Étude de la dynamique d’interaction entre le virus de l’hépatite C et les protéines des jonctions serrées par imagerie en temps réel

Camille Clement1,2, Cristina Dorobantu3, Thomas Baumert3, Philippe Ronde4, Yves Mély4, Vincent Lucansky3, Raphael Gaudin1,5

1 Institut de recherche en infectiologie de Montpellier (IRIM), CNRS : UMR9004, Université de Montpellier, Montpellier, France2 Université de Strasbourg (Unistra), France3 Institut de recherche sur les maladies virales et hépatiques, Université de Strasbourg, Inserm UMRS1110, Institut de virologie, Strasbourg, France4 Laboratoire de bioimagerie et pathologies (LBP), Uuniversité de Strasbourg, CNRS : UMR7213, Illkirch, France5 Université de Montpellier (UM), CNRS : UMR9004, Montpellier, France

raphael.gaudin@irim.cnrs.fr

 

Le virus de l’hépatite C (VHC) est un virus à ARN simple brin enveloppé infectant de façon chronique les hépatocytes. Ces infections induisent des lésions hépatiques pouvant conduire à une fibrose, une cirrhose et finalement au carcinome hépatocellulaire, l’un des cancers les plus agressifs. Avec 71 millions de personnes infectées de manière chronique dans le monde, le VHC reste un problème de santé publique majeur à résoudre. Plusieurs facteurs d’entrée ont été décrits pour faciliter l’internalisation du VHC par les hépatocytes notamment CD81, SR-B1, Claudin1 (CLDN1), Occludine (OCLN), EGFR et Eph2A. Deux de ces facteurs d’entrée, CLDN1 et OCLN sont des protéines structurelles majeures composant les jonctions serrées (TJs), un complexe jonctionnel macromoléculaire essentiel pour l’homéostasie tissulaire et l’établissement de la polarité cellulaire. La dynamique spatiotemporelle de ces facteurs et l’ordre séquentiel de leur implication dans le processus d’entrée du VHC restent à l’heure actuelle controversés. En effet deux modèles sont décrits : le premier propose que le VHC migre vers les TJs pour interagir avec CLDN1 et OCLN, tandis que le second privilégie une association du VHC avec des formes extra-jonctionnelles de CLDN1 et OCLN. À l’aide d’une approche 3D par imagerie en temps réel sur des cellules vivantes en cours d’infection par le VHC, notre projet de recherche vise à caractériser la dynamique spatiotemporelle de ces protéines et les mécanismes moléculaires sous-jacents impliqués dans les étapes d’entrée du VHC. Pour ce faire, le génome de cellules dérivées de l’hépatocarcinome humain (Huh7.5.1) a été modifié à l’aide de Crispr-Cas9. Cette stratégie nous a permis d’insérer une séquence codant pour une protéine fluorescente en amont ou en aval des gènes du récepteur conduisant à l’obtention de cellules exprimant des niveaux endogènes de récepteurs viraux marqués par fluorescence. Les lignées cellulaires éditées EGFP-OCLN+/+ et TagRFP-CLDN1+/+ ont été caractérisées afin d’évaluer l’impact de l’étiquette insérée sur leur fonction, leur distribution cellulaire et la permissivité au virus. En parallèle, nous avons produit un virus VHC compétent pour la réplication que nous avons marqué par fluorescence en utilisant des agents de réticulation chimique activés par un ester (NHS-ester AlexaFluor647). Ainsi nos premières données d’imagerie confocale en temps réel de particules virales isolées infectant des cellules modifiées ont révélé que l’OCLN endogène est recrutée en dehors des TJs pour interagir avec les particules du VHC. De plus cette interaction semble modifier la mobilité latérale du VHC à la surface de la cellule avant l’endocytose de la particule. Des travaux supplémentaires sont en cours pour mesurer statistiquement la dynamique de ces événements et identifier les mécanismes sous-jacents impliqués. Nos travaux ont mis en lumière une stratégie de subversion du VHC lors de laquelle les protéines associées aux TJs sont réquisitionnées en dehors de leur localisation physiologique. Ces résultats ouvrent la voie à de nouvelles recherches visant à déterminer les mécanismes moléculaires sous-jacents.

 

O5

La protéine non structurale W du virus Nipah module la voie de signalisation NF-κB

François Enchery, Claire Dumont, Noémie Aurine, Mathieu Iampietro, Rodolphe Pelissier, Louis-Marie Bloyet, Cyrille Mathieu, Denis Gerlier, Chloé Journo, Branka Horvat

Centre international de recherche en infectiologie (CIRI), CIRI, Inserm, U1111, Université Claude-Bernard Lyon 1, CNRS, UMR5308, École normale supérieure de Lyon, Univ Lyon, F-69007, Lyon, France

branka.horvat@inserm.fr

 

Le virus Nipah (NiV), un paramyxovirus zoonotique hautement pathogène responsable d’épidémies régulières en Asie du Sud-Est, est associé à une létalité élevée et à une transmission interhumaine. NiV produit trois protéines non structurales, V, W et C, connues comme facteurs de virulence. NiV-W inhibe la réponse aux chimiokines in vitro et module la réaction inflammatoire in vivo. Cependant, son mécanisme d’action reste mal compris. Plusieurs de ces chimiokines étant régulées par la voie canonique NF-κB (un des principaux régulateurs de l’inflammation), nous avons étudié les effets de NiV-W sur cette voie de signalisation. Nous démontrons que la protéine NiV-W réprime l’activation de la voie de NF-κB induite par l’IL-1β et le TNFα. Cette fonction nécessite le domaine C-terminal de NiV-W et dépend de l’accumulation nucléaire de la protéine NiV-W. Contrairement à l’infection par un virus NiV sauvage, l’inhibition de l’activation de NF-κB est altérée pendant l’infection par un NiV recombinant déficient en NiV-W. De plus, une protéine d’échafaudage impliquée dans la signalisation intracellulaire et régulant NF-κB a été identifiée comme partenaire potentiel de NiV-W par spectrométrie de masse. Une mutation spécifique au sein de NiV-W, responsable de la perte de l’interaction avec ce partenaire intracellulaire, entraîne une incapacité d’inhiber la voie NF-κB. Ce mécanisme permet de mieux comprendre l’inhibition de la production de chimiokines et du recrutement des leucocytes induite par le NiV-W. Dans l’ensemble, nos résultats suggérant que la protéine NiV-W inhibe la voie NF-κB et module en conséquence la réponse inflammatoire induite par le NiV, permettent d’avancer dans la compréhension de l’immunopathogenèse de cette infection virale sévère.

 

P1

La protéine myéloïde S100A9 restreint l’infection des cellules de Langerhans par le VIH-1

Ghizlane Maarifi, Olivier Moncorgé, Boris Bonaventure, Caroline Goujon, Fabien Blanchet

Institut de recherche en infectiologie de Montpellier (IRIM), CNRS UMR9004, Université de Montpellier UM 1919 Montpellier, France

olivier.moncorge@irim.cnrs.fr, caroline.goujon@irim.cnrs.fr

 

Certains sous-types de cellules dendritiques (DC) sont des cibles préférentielles et précoces de microbes transmis par les muqueuses. Ces cellules possèdent des mécanismes de défense liés à l’immunité innée en exprimant notamment des facteurs cellulaires spécifiques permettant de limiter certaines infections microbiennes. La caractérisation récente de SAMHD-1 en tant que puissant facteur de restriction du VIH-1 a été une découverte majeure. Alors que cette restriction du VIH-1 dépendant de SAMHD-1 a été démontrée sans ambiguïté dans la plupart des types de cellules dendritiques (DC) myéloïdes, les mécanismes de restriction présents dans les cellules de Langerhans (LC), un sous-type particulier de DC principalement présent dans l’épiderme et les couches suprabasales des muqueuses, ne sont pas bien déterminés. Ce sous-type de DC est d’autant plus important qu’il a été rapporté comme étant susceptible d’influencer les premiers événements de la transmission du VIH-1. Des données récemment publiées par l’équipe démontrent que le facteur de croissance transformant bêta (TGF-b), une cytokine essentielle au développement des LC, induit une forte activité anti-VIH-1 dans les LC primaires de la peau et les LC dérivées de monocytes (MoLC). Cette activité antivirale TGF-b-dépendante est transposable à d’autres cellules, notamment myéloïdes, suggérant une régulation transcriptionnelle TGF-b-spécifique d’un ou plusieurs facteur(s) de restriction du VIH-1 exprimés naturellement dans les LC. Une analyse transcriptomique différentielle à haut-débit dans des cellules myéloïdes humaines primaires nous a permis d’identifier différents gènes directement régulés par le TGF-b dont certains se sont avérés des candidats intéressant déjà impliqués dans l’immunité antimicrobienne. Parmi ces gènes, nous avons identifié s100a9 comme étant un gène exprimant la protéine S100A9 (également appelée MRP14 ou calgranuline B) aussi classée comme motif moléculaire associés aux dégâts (DAMP) et dont la fonction extracellulaire régule les processus inflammatoires. Nos expériences suggèrent que cette protéine antimicrobienne agit aussi comme facteur intracellulaire majeur limitant la réplication du VIH-1dans les LC. Nos données montrent qu’une diminution de l’expression de S100A9 dans les LC rend ces cellules très susceptibles aux infections par des lentivecteurs dérivés du VIH-1. Inversement, l’expression exogène de S100A9 restreint la transduction dans différents types cellulaires non réfractaires à la réplication virale. En outre, le niveau d’expression ainsi que la localisation de S100A9 sont régulés de manière TGF-b-dépendante corrélant avec une restriction virale survenant lors des étapes tardives de la rétro-transcription du VIH-1. De manière intéressante, les niveaux d’expression de S100A9 dans des LC matures corrèlent avec leur susceptibilité à l’infection par le VIH-1 plaçant ainsi S100A9 comme facteur cellulaire important limitant la transmission de l’infection. Une meilleure caractérisation des mécanismes responsables de la restriction du VIH induite par S100A9 dans les LC humaines pourrait venir en appui des stratégies antivirales actuelles visant à lutter contre les premiers événements de l’infection par le VIH-1.

 

P2

Identification des mécanismes moléculaires et cellulaires responsables de la dissémination du virus Zika dans les tissus les plus difficiles d’accès : l’hypothèse du cheval de Troie

Nilda Vanesa Ayala-Nunez1, Gautier Follain2, Gilian Hale3, François Delalande4, Aurélie Hirschler4, Margot Carocci5, Brigid Bollweg3, Sandrine Bourdoulous6, Nolwenn Jouvenet7, Muriel Coulpier8, Sherif Zaki3, Anita Eckly5, Frédéric Doussau9, Sarah Cianferani4, Christine Carapito4, Béatrice Uring-Lambert10, Jacky Goetz2, Raphael Gaudin1

1 Institut de recherche en infectiologie de Montpellier (IRIM), CNRS UMR9004, Université de Montpellier Montpellier, France2 Inserm UMRS1109, 67000 Strasbourg, France3 Centers for Disease Control and Prevention [Atlanta] (CDC), 1600 Clifton Rd, GA 30333 Atlanta, GA, États-Unis4 Institut pluridisciplinaire Hubert-Curien (IPHC), Université de Strasbourg, CNRS UMR7178, Strasbourg, France5 Établissement français du sang-Grand Est (EFS-alsace Strasbourg), Inserm U1255, Université de Strasbourg, Strasbourg, France6 Institut Cochin Université Paris Descartes-Paris 5 : UM3, Inserm U1016, CNRS UMR8104, Paris, France7 Institut Pasteur, CNRS UMR3569, Paris, France8 Virologie UMR1161 (VIRO), INRA UR1161, École nationale vétérinaire d’Alfort, Anses, ENVA Maisons-Alfort, France9 Institut des neurosciences cellulaires et intégratives (INCI), Université de Strasbourg, CNRS UPR3212, Strasbourg, France10 Hopitaux universitaire de Strasbourg, Université de Strasbourg, 67000 Strasbourg, France

raphael.gaudin@irim.cnrs.fr

 

Le virus Zika (ZIKV) représente un problème de santé publique depuis qu’il a été démontré que l’infection de femmes enceintes est responsable d’une forte augmentation du risque de microcéphalie pour le fœtus. Plus récemment, d’autres complications, telles que des troubles neurologiques sévères, ont été observées chez les enfants et adultes infectés. Dans des modèles murins et primates, le virus atteint le système nerveux central et y persiste, même en l’absence de réaction inflammatoire détectable. Cependant, le mécanisme par lequel le virus passe une barrière hémato-encéphalique (BHE) mature et imperméable n’a pas été élucidé. Les monocytes sont particulièrement permissifs à l’infection par ZIKV et nous avons postulé que les monocytes circulant pourraient servir de cheval de Troie, transportant le virus du sang vers le cerveau. Tout d’abord, nous avons montré que ZIKV induit une augmentation de la capacité des monocytes à transmigrer à travers un modèle de BHE in vitro. Afin de confirmer ces observations dans un contexte de circulation sanguine active, des monocytes primaires humains ont été injectés dans un modèle d’embryon de poisson-zèbre Tg(fli1:egfp) exprimant la protéine fluorescente EGFP dans les cellules endothéliales. Dans ce système, la pré-exposition à ZIKV induit une plus importante transmigration des monocytes de la circulation sanguine vers les tissus par rapport à des monocytes non-exposés au virus. Par spectrométrie de masse et cytométrie en flux, nous avons déterminé que ZIKV induit une forte surexpression des molécules d’adhésion à la surface des monocytes. En conséquence, l’exposition à ZIKV entraîne une augmentation significative de l’attachement des monocytes aux cellules endothéliales que nous avons quantifié par microscopie in vivo sur des poisson-zèbres vivants. Enfin, nous avons mis en évidence que des monocytes pré-infectés par ZIKV sont responsables de profondes altérations de l’organisation du cervelet dans un modèle de culture organotypique murin ex vivo. Ces altérations n’ont pas été retrouvées dans le cas d’une infection par du virus libre, suggérant que l’association de ZIKV aux monocytes est un facteur augmentant la virulence de ZIKV. Lors de cette étude, nous avons également caractérisé une molécule antivirale capable de bloquer l’infection des monocytes par ZIKV et de prévenir des effets délétères du virus sur le système nerveux central. En conclusion, nos résultats mettent en lumière de nouveaux concepts importants pour la compréhension de la physiopathologie liée à l’infection par ZIKV et permettent d’envisager de nouvelles stratégies thérapeutiques antivirales.

 

P3

Sélénium et sélénoprotéines et infection virale VIH-1

Olivia Guillin, Caroline Vindry, Didier Decimo, Philippe Mangeot, Theophile Ohlmann, Laurent Chavatte

Centre international de recherche en infectiologie (CIRI), Inserm, U1111, Université Claude-Bernard Lyon 1, CNRS, UMR5308, École normale supérieure de Lyon, Univ Lyon, F-69007, Lyon, France

olivia.guillin@ens-lyon.fr

 

Le Sélénium (Se) est un oligo-élément aux propriétés antioxydantes qui est incorporé dans la famille des sélénoprotéines sous la forme de l’acide aminé rare, la sélénocystéine. Dans le génome humain on dénombre 25 gènes de sélénoprotéines qui ont pour fonction la défense antioxydante, l’homéostasie redox et la signalisation redox. L’expression des sélénoprotéines est fortement régulée par l’apport en sélénium de l’organisme mais aussi par différents stimuli exogènes, comme le stress oxydant. La déficience en sélénium impacte les fonctions essentielles des sélénoprotéines dans l’organisme et notamment la fonction immunitaire. Dans le cas de patients infectés par le VIH-1, agent étiologie du sida, cette déficience est associée à une diminution des cellules CD4 et de l’espérance de vie des patients. Ce pronostic négatif peut être en partie inversé par une supplémentation en sélénium. L’infection par le VIH est une maladie chronique nécessitant un traitement intensif et qui présente une évolution clinique variable. Plusieurs facteurs sont impliqués dans la progression vers le sida, notamment le sélénium, qui est un oligoélément essentiel. Son rôle dans le fonctionnement immunitaire reste à explorer aux niveaux cellulaire et moléculaire. L’objectif de notre étude est de déterminer le rôle du sélénium et des sélénoprotéines dans les cellules immunitaires, et en particulier lors de l’infection par le VIH, à la fois aux niveaux cellulaires et moléculaires.

 

P4

La protéine NS3 du virus de la dengue stimule l’activité hexokinase dans les hépatocytes pour supporter la réplication virale

Marianne Figl, Clémence Jacquemin, Patrice André, Laure Perrin-Cocon, Vincent Lotteau, Olivier Diaz

CIRI, Unité Inserm 1111, Équipe biologie cellulaire des infections virales, Université Claude-Bernard Lyon 1, CNRS, UMR5308, École normale supérieure de Lyon, Univ Lyon, F-69007, Lyon, France

olivier.diaz@inserm.fr

 

Contexte et buts. Les virus sont capables de moduler le métabolisme central du carbone dans les cellules qu’ils infectent mais les mécanismes moléculaires sous-jacents sont aujourd’hui encore peu décrits. Au sein de l’équipe, nous avons démontré que la protéine NS5A du virus de l’hépatite C interagit avec la première enzyme de la glycolyse, l’hexokinase, et augmente son activité afin de permettre la réplication virale (Ramiere et al, 2014). Afin d’évaluer si ce mécanisme est partagé par d’autres flavivirus, nous avons recherché si les protéines du virus de la dengue (DV) étaient également capables de moduler l’activité hexokinase. D’un point de vue clinique, l’infection DV est accrue dans le foie lors du développement de formes sévères. Nous avons donc analysé dans différents modèles hépatocytaires la dépendance de la réplication du DV à la glycolyse et à l’activité hexokinase.

Méthodes. Des expériences de Protein-Fragment Complementation Assay (PCA) et de co-immunoprécipitation ont permis d’étudier les interactions entre les protéines du DV et les quatre isoformes d’hexokinase. Comme pratiquement toutes les cellules cancéreuses, la lignée HuH7 issue d’un hépatocarcinome exprime la forme « cancéreuse » HK2 de l’isoenzyme alors que in vivo, les cellules hépatocytaires expriment l’isoforme HK4 (aussi appelé glucokinase, GCK). Aussi, nous avons créé un modèle à partir des cellules HuH7 en invalidant l’expression d’HK2 par le système CRISPR-Cas9 et restauré l’expression de l’hexokinase spécifique des hépatocytes, GCK. La dépendance de la réplication virale à la glycolyse a été évaluée dans ces deux modèles cellulaires.

Résultats. Nous avons démontré que NS3-DV interagissait avec toutes les isoformes d’hexokinase, suggérant un impact de NS3 sur l’activité glycolytique des cellules infectées. L’expression de NS3 augmente la consommation de glucose et la sécrétion de lactate dans les deux modèles hépatocytaires HuH7-HK2 et HuH7-GCK ainsi que dans une autre lignée cellulaire non hépatocytaire A549 exprimant HK1. L’analyse des paramètres catalytiques des hexokinases dans des homogénats de cellules exprimant NS3 indique que NS3 diminue le Km apparent de GCK et abolit son comportement allostérique normal. L’infection DV est augmentée dans les cellules HuH7 exprimant GCK à la place d’HK2. De façon intéressante, en utilisant un réplicon DV subgénomique couplé à la luciférase (DV-Rluc), nous avons observé que l’expression de Rluc dépendait de la concentration en glucose dans le milieu de culture, confirmant l’impact direct de l’activité glycolytique sur la réplication virale. Par ailleurs, l’inhibition de GCK par la surexpression de son inhibiteur naturel GKRP induit une diminution de l’expression Rluc.

Conclusion. Le DV contrôle la glycolyse hépatique en interagissant via NS3 avec GCK. Cette interaction modifie les paramètres catalytiques de l’enzyme et favorise la réplication virale. Cette observation suggère que l’infection DV dans le foie est hautement dépendante du contrôle de la glycémie in vivo.

 

P5

L’isoforme Gag-p40 du VIH-1: mythe ou réalité ?

Sylvain De Breyne1, Jules Deforges2, Christelle Daude3, Nathalie Chamond2, Didier Decimo1, Bruno Sargueil2, Theophile Ohlmann1

1 Centre international de recherche en infectiologie (CIRI), ENS Lyon, Université Claude-Bernard Lyon 1, Inserm U1111, CNRS UMR5308, Lyon, France2 Laboratoire de cristallographie et RMN biologiques (LCRB -UMR 8015), Université Paris Descartes-Paris 5, CNRS UMR8015, Faculté des Sciences pharmacologiques et biologiques, Paris, France3 Centre de recherche en neurosciences de Lyon (CRNL), Université Claude-Bernard Lyon 1, Université Jean Monnet [Saint-Etienne], Inserm U1028, CNRS UMR5292, CH Le vinatier, Bron, France

sylvain.de.breyne@ens-lyon.fr

 

La traduction de l’ARNm non épissé du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est initiée par plusieurs mécanismes distincts. Le recrutement du ribosome se produit principalement au niveau de la structure de l’extrémité 5’ de l’ARNm et sur deux sites d’entrée interne des ribosomes (IRES). L’orchestration de ces processus n’est pas encore comprise. Il est intéressant de noter que l’IRES situé dans la région codant pour Gag favorise exclusivement l’expression de Gag-p40 : une isoforme de Gag-p55 tronquée de la région N-terminale dont la pertinence pour la réplication virale reste à déterminer. Nous avons montré que la traduction de Gag-p40 est initiée à partir l’IRES dans plusieurs systèmes d’étude de la traduction (in vitro et ex vivo). Ces caractéristiques traductionnelles sont conservées dans des séquences issues de patients infectés par le VIH-1. Récemment, nous avons montré, au sein même de l’IRES, la présence de deux sites indépendants capable d’interagir directement avec le ribosome. Enfin, nous présentons de nouvelles données montrant que Gag-p40 est exprimée dans les cellules productrices du virus et que diverses mutations du codon d’initiation de Gag-p40 impactent différemment la production de Gag et la réplication virale.

 

P6

Mise en évidence d’une nouvelle fonction portée par la protéine NS3 du virus de la fièvre catarrhale ovine dans la modulation de la voie de signalisation MAPK/ERK

Cindy Kundlacz, Marie Pourcelot, Aurore Fablet, Rayane Amaral DaSilva Moraes, Cyril Viarouge, Corinne Sailleau, Emmanuel Breard, Sylvie Lecollinet, Zientara Stefan, Damien Vitour, Grégory Caignard

Virologie UMR1161 (VIRO), INRA UR1161, École nationale vétérinaire d’Alfort, ENVA Maisons-Alfort, France

gregory.caignard@vet-alfort.fr

 

Le virus de la fièvre catarrhale ovine (bluetongue virus, BTV) est l’agent étiologique de la fièvre catarrhale ovine, une arbovirose non contagieuse transmise aux ruminants domestiques et sauvages par l’intermédiaire de morsures de moucherons hématophages du genre Culicoïdes. Il existe actuellement 27 sérotypes décrits de BTV à travers le monde dont la classification est basée sur une variabilité au niveau de la protéine de capside VP2. Entre 2006 et 2010, l’émergence d’une souche de sérotype 8 du BTV (BTV-8) dans le nord de l’Europe a eu un retentissement sans précédent de par sa rapidité de dissémination à une grande partie de l’Europe et son coût économique (coût de la seule vaccination : 200 millions d’euros pour l’Union européenne, dont 90 millions pour la France en 2009). Bien que la France continentale eût retrouvé son statut indemne de BTV en 2012, de nouvelles souches de BTV-8 et BTV-4 ont récemment (ré)-émergé, avec notamment 3507 foyers recensés de BTV-8 en France entre le 1er janvier 2016 et le 24 janvier 2018 (http://agriculture.gouv.fr/). Les sérotypes de BTV se distinguent par les pathologies qu’ils induisent et leur capacité à infecter et se propager chez leur(s) hôte(s) mammifère(s). Depuis 4 ans, nous avons monté un vaste programme de cartographie à large échelle des interactions entre protéines virales et cellulaires qui vise à identifier les interactions moléculaires spécifiques de souches/serotypes de BTV pour expliquer leurs différences de pathogénicité/virulence et/ou de franchissement de barrière d’espèces. Dans le cadre de ce travail d’interactomique, nous avons notamment révélé BRAF comme étant un nouvel interacteur cellulaire de la protéine NS3 du BTV. BRAF est un acteur majeur impliqué dans la régulation de la voie MAPK/ERK. Cette cascade de signalisation répond aux facteurs de croissance (comme l’EGF) et son activation augmente non seulement la prolifération, la différenciation et la survie cellulaire mais permet aussi l’initiation de la traduction. L’utilisation de gènes rapporteurs luciférase ainsi que des tests biochimiques nous ont permis de démontrer que la protéine NS3 était capable à elle seule d’activer la voie MAPK/ERK et que cette activation nécessitait la présence de BRAF. Cette fonction semble d’ailleurs être spécifique au BTV par rapport à d’autres virus appartenant au genre Orbivirus. Un inhibiteur spécifique de la voie MAPK/ERK, l’U0126, inhibe de façon significative la réplication du BTV soulignant ainsi la nécessité de ce virus pour activer cette voie. Des expériences d’immunofluorescence réalisées en contexte infectieux ont également permis de mettre en évidence une relocalisation de BRAF avec NS3 au niveau de l’appareil de Golgi et de la membrane plasmique. L’accumulation de BRAF par NS3 dans ces compartiments cellulaires pourrait ainsi participer à son activation ainsi que celle de toute la cascade de signalisation en aval de BRAF. L’activation de la voie par la protéine NS3 pourrait être un mécanisme de détournement de la machinerie de traduction cellulaire au profit de l’expression des protéines virales et pourrait également constituer un élément de réponse pour expliquer l’hyper-inflammation observée dans le cas d’une infection par ce virus.

 

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Les anticorps circulant dans le plasma des chasseurs africains infectés par des virus foamy simiens n’inhibent pas la transmission virale de cellule à cellule

Mathilde Couteaudier1,2, Thomas Montange2,1, Edouard Betsem1,2,3, Augustin Mouinga-Ondémé4, Richard Njouom5, Antoine Gessain2,1, Florence Buseyne2,1

1 CNRS, UMR 3569, Institut Pasteur Paris, France2 Unité d’épidémiologie et physiopathologie des virus oncogènes (EPVO), Institut Pasteur, Département de virologie Institut Pasteur, Paris, France3 Université de Yaoundé I [Yaoundé], B.P. 337 Yaoundé, Cameroun4 Groupe des infections rétrovirales et pathologies associées (IRPA), Département de rétrovirologie, Centre international de recherches médicales de Franceville, Franceville, Gabon5 Centre Pasteur du Cameroun, Yaoundé, Cameroun

mathilde.couteaudier@pasteur.fr

 

Les virus foamy simiens (VFS) sont des rétrovirus complexes largement répandus chez les primates non humains (PNH). L’homme n’est pas un hôte naturel des VFS mais peut être infecté suite à une morsure de PNH. Les VFS établissent alors une infection persistante. Cependant, à ce jour, aucune pathologie ou transmission secondaire n’a pu être observée, ce qui suggère un contrôle immunitaire efficace de ce rétrovirus chez l’homme. Des anticorps neutralisants à des titres élevés ont été retrouvés dans le plasma d’individus infectés par des VFS zoonotiques. Ces anticorps neutralisent des virus libres et ciblent les épitopes conservés situés dans le domaine dimorphique en surface (SU) de la glycoprotéine d’enveloppe (Env). La principale voie de transmission des virus foamy se fait via des contacts de cellule à cellule, le virus étant hautement associé aux cellules. De plus, le processus de fusion cellulaire est régulé par Env. Notre objectif était de déterminer si les anticorps présents dans le plasma d’individus infectés inhibent la transmission des VFS de cellule à cellule. Différentes lignées cellulaires ont été infectées par des virus foamy primaires zoonotiques de gorille (SFVggo_huBAD468 et SFVggo_huBAK74) ou par des virus foamy de chimpanzé (isolats adaptés au laboratoire, SFVpsc_huPFV et SFVpve_Pan2) pendant 72 h. Des dilutions en séries de plasma ont été ajoutées pendant 90 minutes, avant l’apport de cellules indicatrices (GFAB). Ces cultures ont été maintenues en présence de plasma pendant 72 h. La synthèse de β-galactosidase sous contrôle du promoteur viral est révélée par addition d’un substrat chromogène. L’expression et la localisation de la glycoprotéine Env dans les cellules infectées par des VFS ont été étudiées par immunomarquage avec des anticorps monoclonaux. Des chasseurs camerounais et gabonais infectés par des VFS de gorille ont été étudiés. Vingt-trois échantillons de plasma d’hommes infectés par des VFS ont été sélectionnés pour leur capacité à neutraliser efficacement les virus libres. Ces plasmas étaient incapables d’inhiber l’infection médiée par les cellules, même à des dilutions plus basses que celles neutralisant le virus libre. Toutes les souches virales étaient résistantes aux anticorps neutralisants dans le contexte d’une infection de cellule à cellule alors qu’elles étaient neutralisées lors d’une infection par un virus libre. Env était majoritairement localisée dans la région périnucléaire. Des syncytia et des connections intercellulaires ont également été visualisés. Ces structures ont été observées dans les cellules infectées en présence et en absence de plasma durant l’infection et la culture des cellules. En conclusion, les anticorps présents dans le plasma d’hommes infectés par des VFS zoonotiques sont incapables de neutraliser la transmission virale de cellule à cellule. La capacité de ces anticorps à détruire les cellules infectées en présence d’effecteurs cellulaires sera étudiée.

 

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Le rétrovirus oncogène HTLV-1 exploite les fonctions de p62, une protéine de liaison à l’ubiquitine, pour l’activation constitutive de la voie NF-kB

Aurélien Schwob1,2, Elodie Teruel1,2, Louise Dubuisson1,2, Florence Lormieres1,2, Pauline Verlhac3,4, Yakubu Princely Abudu5, Janelle Gauthier1,2, Marie Naoumenko1,2, Fanny-Meï Cloarec1,2, Mathias Faure4, Terje Johansen5, Helene Dutartre1,2, Renaud Mahieux1,2, Chloé Journo1,2

1 CIRI, Inserm 1111, Équipe oncogenèse rétrovirale, Université Claude-Bernard Lyon 1 -CNRS, UMR5308, ENS Lyon, Université Lyon, Lyon, France2 Équipe labellisée « Fondation pour la recherche médicale ». France3 Department of Cell Biology, University of Groningen, Pays-Bas4 CIRI, Inserm 1111, Équipe autophagie, infection, immunité », Université Claude-Bernard Lyon 1, CNRS, UMR5308, ENS Lyon, Université Lyon, Lyon, France5 Molecular Cancer Research Group, Institute of Medical Biology, University of Tromsø -The Arctic University of Norway, Tromsø, Norway, Norvège

Renaud.mahieux@ens-lyon.fr, chloe.journo@ens-lyon.fr

 

La voie de signalisation NF-kB contrôle la survie et la prolifération cellulaire ainsi que l’inflammation. Elle est constitutivement activée lors de la leucémie à cellules T de l’adulte, un cancer hématologique agressif provoqué par le rétrovirus oncogène HTLV1 (human T-cell leukemia virus type 1). L’oncoprotéine virale Tax induit l’activation constitutive de la voie NF-kB via une interaction avec la protéine régulatrice IKKγ du complexe IKK. Cette activation met en jeu le recrutement de chaînes d’ubiquitine au sein du signalosome Tax/IKK et nécessite également les protéines OPTN et TAX1BP1, décrites récemment comme appartenant à la famille des récepteurs semblables à p62. De façon intéressante, p62 est connue pour son implication dans la régulation de la voie NF-kB et sa capacité à interagir avec les chaînes d’ubiquitine. Nous avons donc cherché à évaluer le rôle de p62 dans l’activation constitutive de la voie NF-kB induite par Tax. Grâce à l’utilisation de tests de gènes rapporteurs combinés à des dosages des facteurs NF-kB actifs réalisés dans des cellules déficientes ou déplétées en p62, ou dans des cellules sur-exprimant p62, nous avons démontré que p62 était nécessaire pour permettre une activation optimale de la voie NF-kB dépendante de Tax. Afin d’identifier le mécanisme par lequel p62 participe à l’activation de la voie NF-kB induite par Tax, nous avons ensuite analysé par microscopie confocale la localisation de p62 dans des lymphocytes T sur-exprimant ou non Tax et dans des lymphocytes T chroniquement infectés par HTLV1. Ces observations, complétées par des expériences de co-immunoprecipitation, ont démontré que p62 est détectée au sein des complexes entre la protéine virale Tax et IKKγ localisés dans des structures périnucléaires associées à l’appareil de Golgi. Nous avons ensuite montré par des expériences de pull-down in vitro que p62 interagissait directement avec Tax et nous avons identifié le domaine 170 à 221 de p62 comme nécessaire et suffisant pour cette interaction. Cependant, un mutant de p62 délété de ce domaine est toujours détecté au sein des complexes entre la protéine Tax et IKKγ, et est toujours capable de potentialiser l’activité de Tax sur NF-kB, suggérant un mécanisme indirect. De façon intéressante, un mutant de p62 délété du domaine d’interaction avec les chaînes d’ubiquitine perd sa capacité à moduler l’activité de Tax. Ces résultats suggèrent donc que p62 pourrait potentialiser l’activité de Tax en favorisant l’association des chaînes d’ubiquitine (libres ou liées) au signalosome Tax/IKK, un processus dont l’importance a été soulignée récemment dans la littérature. En conclusion, ces travaux identifient p62 comme un nouveau régulateur de l’activité de l’oncoprotéine virale Tax, et confirment l’importance de l’ubiquitination comme un mécanisme contrôlant la voie de signalisation NF-kB exploitée par les virus.

 

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Identification de mutations adaptatives favorisant conjointement la résistance à la réponse antivirale et le pouvoir infectieux du virus Zika par approche d’évolution expérimentale

Vincent Grass1, Coralie Guy1, Emilie Hardy1, Elodie Décembre1, Sara Muñoz González1, Kassian Kobert2, Peter Markov2, Lee Sherry1, Alain Kohl3, Bastien Boussau2, Marlène Dreux1

1 Centre international de recherche en infectiologie, CIRI, Inserm, U1111, Université Claude-Bernard Lyon 1, CNRS, UMR5308, École normale supérieure de Lyon, Univ Lyon, Lyon, France2 Laboratoire de biométrie et biologie évolutive (LBBE), Université Claude-Bernard Lyon 1, INRIA, CNRS, Villeurbanne, France3 University of Glasgow, Glasgow, Scotland, Royaume-Uni

marlene.dreux@ens-lyon.fr

 

Le virus Zika (ZIKV), un flavirirus transmis par le moustique, est un problème majeur de santé publique. Au cours des dernières épidémies, l’infection par ZIKV est responsable de fausses couches et d’atteintes neurologiques sévères. De récentes études démontrent que la réponse à l’interféron detype I et III (IFN-I/III) est cruciale pour le contrôle de la propagation, la transmission in utero ainsi que la pathogenèse de ce virus. Afin de déterminer les interactions génétiques entre la réponse IFN-I/III et le génome de ZIKV, nous avons établi une analyse génomique de l’évolution de la quasi-espèce virale en réponse à une pression de sélection exercée par la signalisation antivirale induite par le récepteur Toll-like (TLR)-3 dans un environnement cellulaire contrôlé. Nous avons découvert qu’après plusieurs passages successifs, les populations virales se répliquent mieux que le virus parental, révélant ainsi une adaptation à la réponse antivirale. L’analyse de la taille des foyers infectieux révèle une augmentation de la propagation virale des populations virales adaptées. En accord, le pouvoir infectieux de la population virale augmente au cours des passages des populations virales et est temporairement associée à la résistance virale à la restriction induite par TLR-3. Ce phénotype est observé dans les cellules Huh7.5.1, alors que ces virus adaptés ne présentent pas d’avantage réplicatif et induisent une réponse IFN dans d’autres cellules (i.e, Vero et U6A), suggérant une adaptation spécifique à un environnement cellulaire. L’étude de la quasi-espèce virale par séquençage haut débit et analyse bio-informatique de l’évolution virale met en évidence des mutations impliquées dans l’adaptation virale, temporellement associées à l’acquisition du phénotype adapté. L’importance fonctionnelle des mutations candidates a été validée par leur introduction dans le clone moléculaire de ZIKV. Ainsi deux mutations sont suffisantes pour reproduire le phénotype des populations virales adaptées. Ces mutations adaptatives comprennent une substitution dans la protéine de surface E (S455L) positionnée à l’extrémité de l’hélice amphipathique, proche du domaine transmembranaire. Elle pourrait ainsi moduler la stabilité en surface de la protéine E et/ou ses changements de conformation induit lors de l’acidification conduisant à la fusion membranaire. Une seconde mutation se trouve à l’extrémité d’une hélice amphipathique de NS4B, prédite pour interagir avec la membrane du côté de la lumière du réticulum endoplasmique. L’ensemble de nos résultats montrent que ZIKV s’adapte rapidement à un environnement cellulaire, via une augmentation de son pouvoir infectieux et de son efficacité de réplication, menant alors à une résistance à la réponse antivirale de l’hôte.

 

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Hepatitis E Virus: Viral evasion through OAS/RNase L inactivation

Oney Ortega, Briant Laurence, Bruno Coutard, Bruno Canard, Nadia Rabah

Architecture et fonction des macromolécules biologiques (AFMB), CNRS UMR7257, Aix-Marseille Université : UMR7257, Faculté des Sciences de Luminy, Marseille, France

oney.ortega-granda@afmb.univ-mrs.fr

 

The interferon inducible OAS/RNase L system is one of the first antiviral responses in infected cells. It relies on the synthesis, by oligoadenylate synthetases (OAS), of short 2’-5’ oligonucleotides that act as second messengers to activate the latent cellular RNase L. This enzyme degrades viral and cellular RNAs, restricting viral infection. Viruses have developed diverse strategies to escape most antiviral effects. It has been recently reported that non-structural proteins of coronavirus and rotavirus have 2’-5’-phosphodiesterase (PDE) activity; that hydrolysis 2’-5’ oligoadenylate thereby antagonizing the OAS/RNase L pathway. PDE enzymes bear two conserved catalytic Hx(S/T)x motifs (where x is referentially a hydrophobic amino acid). Sequence and structural analysis of Hepatitis E virus (HEV) revealed the presence of this conserved motif in ORF1 gene product. The HEV ORF1 gene encodes viral nonstructural polyprotein, essential for RNA replication and virus infectivity. HEV is an important etiological agent causing acute and chronic hepatitis. It is estimated that 20 millions people contract HEV annually. The global mortality rate due to fulminant liver failure is about 2 % and reaches 20– 30 % in the case of pregnant women.In this work Sar-55 HEV replicon served as a template to design and clone recombinant proteins containing Hx(S/T)x motifs. The proteins of interest correspond to the following putative HEV domains: hypervariable-Macro (HVD-XD), Macro (XD), helicases (HEL) and polymerase (RdRp). A truncated form of HEV polymerase harboring a Hx(S/T)x motif was also constructed (RdRpΔNT)). These domains were successfully cloned into the pet28b vector. Optimization of heterologous expression conditions in E.coli was done for each recombinant protein. To ensure the highest yield of expressed protein we tested the effect of IPTG concentrations, temperature and different culture media (LB, 2YT and TB2. Recombinant proteins were purified by affinity chromatography. The aim of this work is to identify and characterize enzymatic activities and molecular motifs of HEV implicated in the inactivation of the innate immune response. Finally, this study will contribute to the understanding of HEV evasion mechanisms; which could ultimately be extrapolated to other RNA virus with the aim of developing antiviral tools.

 

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Inhibition de la rétro-transcription du VIH-1 par la protéine Daxx

Sarah Maillet, Ghizlane Maarifi, Nathalie Arhel, Sébastien Nisole

Viral Trafficking Restriction and Innate Signaling, Institut de recherche en infectiologie de Montpellier, Montpellier, France, CNRS : UMR9004, France

sebastien.nisole@irim.cnrs.fr

 

La protéine PML, ou TRIM19, appartient à la famille des protéines à motif tripartite (TRIM). Elle est principalement exprimée dans le noyau, où elle forme des structures dynamiques nommées corps nucléaires PML et dans lesquelles elle recrute d’autres protéines comme sp100, SUMO et Daxx. Alors que l’implication de PML dans la défense antivirale est bien documentée, son rôle dans la réplication du VIH-1 est encore mal caractérisé. Nous avons montré que l’expression de PML interfère avec une étape précoce de la réplication du VIH-1 sans qu’elle ne soit le principal médiateur de cette inhibition. PML agit en effet par l’intermédiaire d’une autre protéine cellulaire nommée Daxx, dont elle assure la stabilité [1]. Daxx est une protéine majoritairement nucléaire, qui exerce une activité de répresseur transcriptionnel, activité qui lui confère un pouvoir antiviral largement démontré dans le cadre des infections par des virus à ADN (pour revue, voir [2]). Daxx est également exprimée dans le cytoplasme et a d’ailleurs été identifiée comme interagissant avec le « domaine de mort » du récepteur Fas, à l’origine de son nom (Death domain-associated protein 6). Lors des premières heures de l’infection par le VIH-1, la protéine Daxx cytoplasmique est localisée à proximité des capsides virales entrantes et inhibe la transcription inverse [1]. Nos travaux ont permis d’identifier Daxx comme un inhibiteur à large spectre, qui affecte la réplication du VIH-1 mais aussi d’autres rétrovirus. Cependant, le mécanisme par lequel Daxx parvient à cibler les capsides rétrovirales et à inhiber la rétro-transcription est encore inconnu. Les principaux objectifs de ce projet de recherche sont d’identifier la cible de Daxx, qu’elle soit virale ou cellulaire et d’élucider le mécanisme par lequel Daxx inhibe la rétro-transcription. En utilisant des mutants de Daxx, nous avons pu montrer que le motif de liaison à SUMO (SIM) de Daxx est indispensable à son activité inhibitrice, suggérant que Daxx inhibe la rétro-transcription en ciblant une protéine conjuguée à SUMO. Nous avons évalué dans un premier temps l’implication des protéines du VIH-1 ayant été identifiées comme des substrats de SUMO, telles que p6 ou l’intégrase. Afin de pouvoir identifier une potentielle cible cellulaire, nous avons également entrepris une analyse protéomique par spectrométrie de masse des interactants de Daxx, en se focalisant sur les protéines modifiées par SUMO. Nous anticipons que l’identification de la cible de Daxx sera la clé pour élucider son mode d’action. Cette étude permettra de caractériser le rôle de PML et de Daxx au cours des phases précoces de la réplication des rétrovirus et d’élucider par quel mécanisme Daxx exerce son activité inhibitrice.

 

Références

1. Dutrieux J, et al. PLoS Pathog 2015 ; 11:e1005280.

2. Maillet S, et al. Virologie 2016 ; 20 : 261-72.

 

 

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Décrypter le réseau des dysfonctions centrosomales induites par la protéine Tax du rétrovirus oncogène HTLV-1

Elodie Teruel1,2,3, Renaud Mahieux, Chloé Journo

1 CIRI, Inserm U1111, CNRS : UMR5308, École normale supérieure (ENS) Lyon, Université Claude-Bernard Lyon I (UCBL) Lyon, France2 Labex Ecofect, Université Claude-Bernard Lyon I (UCBL), Lyon, France3 Équipe Labellisée FRM, Fondation pour la recherche médicale, Lyon, France

elodie.teruel@ens-lyon.fr

 

Le virus HTLV-1 (virus humain de la leucémie T de type 1) est l’agent étiologique de la leucémie T de l’adulte (ATL). Le génome d’HTLV-1 code diverses protéines régulatrices et auxiliaires nécessaires à la réplication et à la persistance virale, ainsi qu’à la transformation des cellules cibles qui l’expriment. Parmi ces dernières, la protéine virale Tax contribue à l’initiation du processus oncogène. De façon intéressante, Tax induit des altérations du centrosome menant à l’instabilité chromosomique qui est corrélée avec l’aneuploïdie observée dans les cellules infectées par HTLV-1. Cependant, les mécanismes moléculaires induits par Tax menant à des dysfonctions centrosomales sont encore assez mal compris. Notre objectif est donc d’une part d’identifier de nouveaux partenaires de Tax au centrosome par une approche de protéomique basée sur de la biotinylation in situ, et d’autre part de caractériser les altérations structurales du centrosome induites par Tax par microscopie à fluorescence. Nous développons une approche de protéomique basée sur la biotinylation de proximité (BioID) pour identifier les partenaires de Tax au centrosome. Pour cela, Tax est fusionnée à BirA*, une forme mutée d’une biotine ligase d’E. coli, capable de biotinyler des partenaires dans un rayon de 10 nm. Après fractionnement cellulaire et enrichissement en centrosomes, l’analyse par spectrométrie de masse des protéines biotinylées permet l’identification des partenaires centrosomaux de Tax. Après avoir vérifié avec succès l’expression de BirA*-Tax dans les cellules 293T et U2OS, nous avons validé la fonctionnalité de cette protéine virale de fusion. La capacité de BirA* à biotinyler les protéines cellulaires a été validée par western blot et microscopie à fluorescence. Nous avons vérifié que BirA*-Tax conservait les fonctions initiales de la protéine virale, notamment en analysant par microscopie à fluorescence sa localisation au centrosome et sa capacité à induire des altérations de celui-ci. Un protocole de fractionnement cellulaire, suivi de la purification des protéines biotinylées est actuellement développé. Les premières données d’analyse par spectrométrie de masse nous ont permis d’identifier de potentiels partenaires de Tax au centrosome. Certains sont notamment impliqués dans le cycle de duplication du centrosome et dans le maintien de l’intégrité de celui-ci. Les expériences visent à valider l’approche de protéomique par BioID pour décrypter le réseau des interactants centrosomaux de Tax. L’étude plus approfondie des interactions entre Tax et les protéines centrosomales ainsi que les conséquences sur l’organisation structurale et les fonctions du centrosome seront au centre des analyses à venir.

 

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Co-évolution de la syncytine-A, protéine d’enveloppe fusogène d’origine rétrovirale, et de son récepteur, Ly6e

Laetitia Heng, Noémie Preault, Manon Vavasseur, Agathe Bacquin, Cécile Vernochet, Thierry Heidmann, Anne Dupressoir

Institut Gustave Roussy (IGR), CNRS : UMR9196, Villejuif, France

dupresso@igr.fr

 

Les syncytines sont des gènes d’enveloppe de rétrovirus endogènes, acquis indépendamment au cours de l’évolution dans plusieurs branches de mammifères et capables de provoquer la fusion des membranes cellulaires via leur interaction avec un récepteur membranaire specifique. Le génome de la souris possède deux gènes de syncytine, syncytine-A et syncytine-B, nécessaires à la formation du syncytiotrophoblaste placentaire et à la survie embryonnaire (Dupressoir et al, PNAS 2005, 2009, 2011). Ces deux gènes sont présents chez tous les Muroidea, i.e. souris, rat, hamster, gerbille, rat-taupe aveugle (spalax), etc., indiquant que leur intégration a eu lieu il y a plus de 40 millions d’années (Vernochet et al, BOR 2014). En 2017, le criblage d’une banque de cDNA de cerveau de souris, combiné à un test de fusion, a permis à notre laboratoire d’identifier le récepteur spécifique de la Syncytine-A de la souris (Bacquin et al, 2017). Il s’agit d’une protéine à ancre GPI, induite par les interférons, LY6E. Cette protéine est fortement surexprimée dans plusieurs types de tumeurs chez l’homme, et a été identifiée comme facteur de susceptibilité à diverses infections virales. L’identification du récepteur de la Syncytine-A ouvre maintenant la voie à une étude originale visant à évaluer les modalités de la co-évolution de la syncytine-A et de son récepteur LY6E, et à identifier les déterminants moléculaires de leur interaction. En pratique, nous nous employons : i) à caractériser les forces évolutives qui ont agi sur les gènes LY6E et syncytine-A, via l’analyse in silico des variations site-à-site et branche-à-branche du ratio dN/dS ; ii) à tester la conservation de l’interaction fonctionnelle Syncytine-A/LY6E chez les différents Muroidea ; et iii) à identifier les déterminants moléculaires et les sites d’interaction entre la Syncytine-A et son récepteur via la production de protéines chimériques et à la mutagenèse dirigée. Les résultats déjà obtenus révèlent que l’interaction fonctionnelle de la Syncytine-A avec LY6E est conservée chez tous les Muroidea, à l’exception de la branche du Spalax, où la Syncytine-A interagit avec un récepteur distinct qu’il reste à identifier. Ces résultats, possiblement liés aux adaptations moléculaires ayant permis au Spalax de résister à l’hypoxie et à la tumorigenèse, pourraient ouvrir des perspectives inattendues dans la caractérisation d’un nouvel acteur du développement normal et tumoral.

 

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Les propriétés d’entrée virales optimales requises chez l’homme révélées par un changement génomique rapide lors de l’isolement viral

Marion Ferren1,2,3, Sho Iketani2,3, Ryan C. Shean4, Negar Makhsous4, Dolly B. Aquino4, Bert Rima5, Cyrille Mathieu1,2,3, Matteo Porotto2,3,6, Anne Moscona2,3, Alexander Greninger4

1 CIRI, Inserm, U1111, Université Claude-Bernard Lyon 1, CNRS, UMR5308, École normale supérieure de Lyon, Univ Lyon, F-69007, Lyon, France2 Department of Pediatrics, Columbia University Medical Center, New York, États-Unis3 Center for Host-Pathogen Interaction, Columbia University Medical Center, New York, États-Unis4 Laboratory Medicine, University of Washington, Seattle, États-Unis5 Centre for Experimental Medicine, The Queen's University of Belfast, Belfast, Northern Ireland, Royaume-Uni6 Department of Experimental Medicine, University of Study of Campania ‘Luigi Vanvitelli’, Naples, Italie

marion.ferren@inserm.fr

 

Les virus humains para-influenza sont responsables d’un grand nombre de maladies respiratoires. Tandis que la plupart des recherches reposent sur la croissance virale en cultures cellulaires immortalisées, le virus humain para-influenza 3 (HPIV3) évolue rapidement dans ce contexte. De plus, les propriétés requises pour l’infection par les souches circulantes et leur prolifération in vivo diffèrent de celles des souches cultivées en cellules immortalisées. Dans cette étude, les adaptations génomiques de HPIV3 au cours de sa culture en lignées cellulaires ont été évaluées par séquençage nouvelle génération par appariement de bases comparé à des échantillons cliniques et d’isolats de cultures primaires. Des modifications non-synonymes ont émergé dès l’isolement viral initial, principalement dans les gènes codant les deux glycoprotéines de surface, la protéine de liaison au récepteur, l’hémagglutinine-neuraminidase (HN) et la protéine de fusion (F). Les génomes de 95 échantillons de HPIV3 issus de cultures primaires et de 23 échantillons cliniques directement issus de patients ont été analysés comparativement. Les mutations dans HN apparues lors de l’isolement viral primaire consistent en des substitutions au site de dimérisation de HN, un site critique pour l’activation de la fusion virale lors de l’entrée. Les modifications des résidus à l’interface du dimère de HN, connues pour différer entre les souches cultivées en lignées cellulaires et les souches cliniques, apparaissent rapidement, notamment les résidus H552 et N556 qui sont critiques pour l’adaptation. Des nouveaux résidus ont également émergé sur un autre site de l’interface du dimère de HN et leur caractérisation in vivo a permis de montrer leur implication dans la fusion induite par HPIV3. L’analyse fonctionnelle de ces mutations associées à la culture en laboratoire a été réalisée en introduisant les mutations dans le fond génétique d’une souche clinique de référence. Cette caractérisation a permis de caractériser le phénotype fusogène associé aux souches cultivées en laboratoire, présentant un complexe HN-F plus fusogène et une activité de clivage du récepteur fortement réduite. De plus, l’analyse des virus comportant ces mutations générés par génétique inverse renforce le caractère critique de ces résidus pour la croissance virale dans les voies respiratoires. Ces résultats soulignent la nécessité d’un équilibre entre les caractéristiques du complexe HN-F et des sites à l’interface du dimère de HN pour une infection chez l’homme. Cette étude illustre la nécessité de pouvoir séquencer des échantillons directement issus des patients car dès le premier passage du virus en cellules immortalisées les propriétés virales majeures peuvent être affectées.

 

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L’infection par le virus de l’Herpès Simplex de type 1 induit l’apoptose des cellules infectées via la surexpression de la cytidine désaminase APOBEC3A

Noémie Berry1, Rodolphe Suspene2, Simon Wain-Hobson2, Jean-Pierre Vartanian2

1 Rétrovirologie moléculaire, Institut Pasteur, CNRS UMR3569, Département virologie, Paris, France2 Rétrovirologie moléculaire (URM), Institut Pasteur, CNRS : URA3015, France

jean-pierre.vartanian@pasteur.fr

 

Les APOBEC3 (apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like 3; A3AA3C, A3DE, A3F-A3H) sont des cytidines désaminases qui catalysent sur l’ADN simple brin, la désamination des cytidines en uridines, entraînant ainsi la formation de mutations de type GC vers AT. Grâce à cette activité enzymatique, les APOBEC3 sont impliquées dans la réponse immunitaire innée en limitant la réplication de certains virus (virus de l’immunodéficience humaine, virus de l’hépatite B, papillomavirus, etc...). Plus particulièrement, il a été montré que l’enzyme APOBEC3A pouvait être up-régulée par l’interféron de type I et générer des cassures double-brin de l’ADN chromosomique. Dans notre étude, nous avons montré qu’une infection de cellules monocytaires THP-1 par le virus de l’Herpès Simplex de type 1 augmente l’expression de la protéine APOBEC3A d’un facteur 50. En effet, le stress cellulaire provoqué par l’infection virale constitue alors un signal de danger entraînant la production d’interféron β par les cellules infectées. Ainsi, APOBE3A surexprimée par l’interféron de type I induirait en retour une augmentation du nombre de cassures double-brin de l’ADN chromosomique ainsi que des mutations extensives et monotones de type GC vers AT au sein du virus de l’Herpès Simplex de type 1 générant ainsi des virus défectifs. Par le biais de différents inhibiteurs spécifiques de la voie, nous avons montré que ces dommages de l’ADN nucléaire sont à l’origine de l’apoptose des cellules infectées. En conclusion, APOBEC3A, induit par l’infection virale, possède un rôle anti-inflammatoire en induisant la mort des cellules infectées.

 

P16

Modulation du recrutement des protéines FXR et HBx par les ligands de FXR

Benoit Lacombe1, Camille Ménard1, Christophe Ramière1, Vincent Lotteau1, Patrice André

CIRI, ENS Lyon, Université Claude-Bernard Lyon 1, Inserm U1111, CNRS UMR5308, Lyon, France

vincent.lotteau@inserm.fr, patrice.andre@inserm.fr

 

Contexte. La réplication du virus de l’hépatite B (VHB) et le métabolisme des acides biliaires (AB) sont fortement liés. En effet, l’infection des hépatocytes par le VHB augmente l’expression du récepteur nucléaire des AB, le farnesoid X receptor (FXR). FXR est un facteur proviral pour le virus dont l’activité est inhibée, in vitro et in vivo, par des ligands liant le récepteur. Le génome viral, réparé et complété possède 2 sites de fixation pour FXR (FXRE). La présence de FXR favorise l’établissement de l’épisome viral (cccDNA) mais joue également un rôle dans la transcription des gènes viraux, dont l’acteur principal est la protéine virale HBx. Comme il a été démontré que FXR et HBx interagissent physiquement, nous voulons décrypter les rôles respectifs de ces protéines, seules ou interconnectées, dans le contrôle de cette transcription virale.

Méthodes. La lignée cellulaire hépatique Huh7, qui exprime fortement FXR, a été utilisée dans des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). Ces expériences ont été réalisées en présence du promoteur Enh2/Cp du VHB, contenant les séquences FXRE ou alors du génome viral entier. Une lignée Huh7 exprimant un ShRNA dirigé contre FXR a été générée pour étudier l’impact de HBx lors de la fixation de FXR sur le génome viral. Le ligand utilisé pour ces expériences est un ligand synthétique et spécifique de FXR, le GW4064.

Résultats. Alors que l’infection augmente le niveau d’expression de FXR, dans les cellules Huh7, les ligands ont également tendance à augmenter/stabiliser la protéine. La transfection transitoire de la protéine HBx est aussi responsable de l’augmentation de FXR, donnant plus de poids à la forte relation entre ces protéines. Après traitement par le ligand, la fixation de FXR est diminuée au niveau des FXRE du promoteur Enh2/Cp alors que sa présence est augmentée sur le promoteur du gène cellulaire BSEP. En conclusion, le ligand est capable de décrocher FXR du promoteur Enh2/Cp, diminuant ainsi la transcription virale. Afin d’étudier les implications de l’interaction FXR-HBx, nous avons réalisé dans les Huh7 ShFXR des expériences de ChIP en co-transfectant HBx et Enh2/Cp. Nous pouvons dire que la protéine HBx est recrutée sur le génome viral par l’intermédiaire de FXR car cette fixation est abolie dans la lignée ShFXR. La fixation de HBx par FXR et leur décrochage par le ligand sont sûrement un des modes d’action du GW4064 qui fait que la transcription virale diminue suite au traitement. Conclusion: FXR est un facteur proviral qui joue un rôle important pour le VHB, à la fois dans la formation de l’épisome viral (cccDNA) et dans l’expression des gènes viraux. La présence directe de FXR sur le génome viral semble être cruciale pour les différentes fonctions associées à FXR. Concernant la transcription, la fixation de FXR sur les régions FXRE, son interaction avec HBx et son relargage par le ligand, en font un acteur majeur de la transcription du VHB et notamment dans son rôle de lien physique qui maintient HBx dans les régions régulatrices des gènes viraux.

 

P17

Contrôle immunitaire de l’infection du virus Nipah

Mathieu Iampietro1, Kévin Dhondt1, Noémie Aurine1, Cyrille Mathieu1, Karl Lang2, Branka Horvat1

1 CIRI, Inserm, U1111, CNRS, UMR5308, Université Lyon 1, ENS Lyon, CERVI, 69007 Lyon, France2 Institute of Immunology, Medical Faculty, University of Duisburg-Essen, Hufelandstr. 55, D-45147, Essen, Allemagne

branka.horvat@inserm.fr

 

Le virus Nipah (NiV) est un paramyxovirus zoonotique et neurotrope hautement pathogène appartenant au genre Henipavirus responsable d’épidémies en Asie du Sud-Est. Ces épisodes ont jusqu’ici été sporadiques et n’ont affecté qu’un nombre limité d’individus, néanmoins, la capacité de transmission interhumaine du virus ainsi que la distribution large de son hôte réservoir, la chauve-souris frugivore, lui confère un potentiel pandémique important. L’immunopathogenèse associée à ce virus est très peu caractérisée. Alors que les lymphocytes ne sont pas susceptibles à une infection par les Henipavirus, nous avons démontré dans une étude précédente que le virus peut s’attacher à ces cellules sans les infecter et se servir des lymphocytes pour infecter des cellules avoisinantes permissives via un mécanisme de transinfection. De plus, il a été décrit que les cellules dendritiques (DC) matures pouvaient capturer des particules pseudo-virales composées de protéines de matrice dérivées de NiV ayant bourgeonné à partir des microdomaines enrichis en glycosphingolipides (GSL) de la membrane cellulaire. Les mécanismes d’attachement et d’internalisation sont dépendants de l’interaction entre les GSL présents sur la particule virale et le récepteur CD169/Siglec-1 présent sur les DC. En outre, les cellules THP1 qui expriment CD169 pourraient favoriser une liaison spécifique du pseudovirus aux cellules via ce récepteur, sa capture subséquente et ainsi permettre d’étudier les mécanismes de défenses développés par les cellules CD169+ dans le contrôle immunitaire d’une infection par NiV. Les lignées de souris génétiquement modifiées sont des outils très importants qui permettent d’étudier différents mécanismes de régulation du système immunitaire et de fournir des informations très précises sur l’immunobiologie d’une infection par NiV. Les voies du système immunitaire pouvant être impliquées dans la pathogenèse du virus ont été étudiées à l’aide de lignées déficientes pour certains gènes spécifiques de différentes cascades. Nos études récentes ont démontré un rôle primordial du système des interférons de type I (IFN-I) dans le contrôle de l’infection par NiV. Cependant, d’autres facteurs impliqués dans des mécanismes moléculaires et cellulaires utilisés pour la production d’IFN-I en périphérie ou dans le système nerveux central durant l’infection demeurent obscurs. La déplétion des cellules présentatrices d’antigènes (CPA) dans des souris transgéniques a permis une propagation systémique rapide du virus et aboutit à un très haut taux de mortalité, mettant ainsi en avant le rôle critique de ces cellules dans le contrôle d’une infection par NiV. Plus particulièrement, la présence de CPA CD169+ était essentielle démontrant leur fonction importante dans la maîtrise de l’expansion virale. Enfin, la protéine peptidase spécifique de l’ubiquitine 18 (USP18), caractérisée comme contrôlant la production des IFN-I dans les macrophages CD169+ s’est montrée dispensable dans la régulation de l’infection par NiV dans les souris. Par ailleurs, la présence des lymphocytes T est critique afin d’assurer la résistance à l’infection contrairement aux lymphocytes B, de plus, cet effet est indépendant de la production de perforine. En conclusion, ces résultats révèlent de nouveaux aspects dans la régulation d’une infection de NiV par le système immunitaire qui pourraient aboutir au développement de nouvelles stratégies antivirales contre cet agent infectieux hautement pathogène.

 

P18

Cribles CRISPR-Cas9 à l’échelle du génome humain pour l’identification de nouveaux inhibiteurs du VIH-1 induits par l’interféron

Boris Bonaventure, Olivier Moncorgé, Antoine Rebendenne, Caroline Goujon

Institut de recherche en infectiologie de Montpellier (IRIM), CNRS UMR9004, Université de Montpellier CNRS, UM 1919 Montpellier, France

boris.bonaventure@irim.cnrs.fr

 

Le système interféron (IFN) constitue une des premières lignes de défenses de l’organisme face aux infections virales. Après détection de pathogènes intracellulaires, les cellules infectées sécrètent de l’IFN qui induit l’expression de plusieurs centaines de gènes (les interferon-stimulated genes, ou ISG) dans les cellules infectées et avoisinantes. Les ISG établissent un état antiviral, car ils codent notamment des effecteurs antiviraux, capables d’inhiber la réplication virale. Il est connu depuis longtemps que les cellules cibles du VIH-1 deviennent réfractaires à l’infection suite à un traitement par de l’IFN. Cette inhibition est en partie exercée par un membre de la superfamille de la Dynamine, la GTPase MxB. MxB inhibe l’import nucléaire et l’intégration de l’ADN viral dans le génome de la cellule hôte. Cependant, l’IFN inhibe également l’accumulation de l’ADN viral et les facteurs responsables restent inconnus. Afin d’identifier ces effecteurs antiviraux ainsi que de potentiels régulateurs de ces effecteurs, nous avons développé un crible fonctionnel à l’échelle du génome humain basé sur la technologie CRISPR-Cas9. Nous avons utilisé la banque d’ARN guides GeCKO qui cible plus de 19 000 gènes humains, à raison de 6 ARN guides par gène. Employant deux lignées cellulaires modèles différentes, nous avons généré des populations de cellules KO pour la majorité des gènes humains. Afin de sélectionner les cellules dont la réponse IFN est altérée, les populations mutantes ont été traitées avec de l’IFN pour induire l’expression des ISG et l’établissement de l’état antiviral. Puis les cellules ont été mises en présence du VIH-1 et celles qui ont été infectées en dépit du traitement IFN ont été sélectionnées et amplifiées. Des populations de cellules mutantes, incapables d’inhiber efficacement la réplication du VIH-1 après traitement IFN, ont ainsi été sélectionnées 3 fois de façon successive, afin de minimiser le nombre de faux-positifs. Les ARN guides exprimés au sein des populations sélectionnées ont été identifiés par séquençage haut débit et les gènes candidats ordonnés par analyse MaGECK. Les gènes appartenant à la cascade de signalisation de l’IFN font partie des meilleurs hits, validant ainsi la stratégie du crible. De façon intéressante, le crible nous a permis d’identifier plusieurs gènes dont l’invalidation permet de restaurer partiellement l’infection par le VIH-1, dans le contexte de l’état antiviral induit par l’IFN. Ces gènes peuvent être des régulateurs de la voie de réponse à l’IFN, des inhibiteurs du VIH-1 ou encore des régulateurs de ces inhibiteurs. Afin d’étudier la spécificité de l’action ces gènes, l’effet de leur KO est étudié sur d’autres virus modèles sensibles à l’IFN, tels que le virus de la stomatite vésiculaire et le virus influenza A. Des travaux sont en cours pour caractériser le rôle des gènes dont l’action est spécifique du VIH-1, en déterminant notamment l’étape du cycle de réplication à laquelle ils agissent. En résumé, l’utilisation de cribles CRISPR-Cas9 à l’échelle du génome peut permettre d’apporter une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires mis en jeu lors de l’induction de l’état antiviral par l’IFN, que ce soit dans le cas du VIH-1 ou d’autres virus sensibles à l’IFN.

 

P19

Etude de co-infections virales IDV et BCoV dans le cadre des bronchopneumonies infectieuses chez le bovin

Adrien Lion, Elias Salem, Justine Oliva, Mariette Ducatez, Gilles Meyer

Interactions hôtes-agents pathogènes (IHAP), École nationale vétérinaire de Toulouse ENVT, INRA-Toulouse, France

g.meyer@envt.fr

 

La fréquence des affections respiratoires, principalement les bronchopneumonies infectieuses (BPI), et leur impact économique représentent un obstacle majeur dans l’élevage des jeunes bovins. Le plus souvent, ces affections sont multifactorielles et font intervenir d’une part des agents pathogènes (virus et bactéries) et d’autre part, des facteurs liés à l’animal, à l’environnement et à la conduite d’élevage. Le virus respiratoire syncytial bovin (VRSB) et Mannheimia haemolytica sont les agents pathogènes les plus fréquemment associés à la BPI. Les prévalences de Mycoplasma bovis, de Pasteurella multocida et du coronavirus bovin (BCoV) sont également très élevées, mais leur rôle dans la BPI est plus controversé. La découverte récente du virus influenza D (IDV) suggère que ce virus pourrait aussi participer aux BPI. Par des approches de PCR et NGS, nous avons confirmé des associations entre IDV, BCoV et VRSB chez des jeunes bovins présentant des BPI (Salem et al, manuscrit en préparation). Peu d’études décrivent, chez les bovins, les effets d’une association entre deux virus, comme BCoV et IDV, qui partagent pourtant le même tropisme tissulaire et cellulaire, sur les BPI. Individuellement, des infections expérimentales ont montré qu’IDV et BCoV induisent une symptomatologie modérée chez les veaux. Notre hypothèse est que l’apparition et la sévérité des BPI pourraient-être accentuées par des co-infections virales comme IDV et BCoV. Pour répondre à cette hypothèse nous avons eu pour objectif de caractériser la réplication virale en cultures cellulaire (in vitro) et organotypique (ex vivo) bovines mono ou co-infectées par IDV et BCoV. Le virus influenza D (D/bovine/France/5920/2014) a une réplication productive sur les différents types cellulaires (« Bovine Turbinate cells » BT, « Madin-Darby Bovine Kidney Epithelial cells » MDBK et « Bovine esophagus cells » KOP-R) et Precision-Cut Lung Slices (PCLS) de bovin. Le coronavirus bovin (BCoV/Bov/Fr/9822/2015) se réplique par contre uniquement sur cellules MDBK. Les expériences de co-infections ont montré un titre d’IDV augmenté sur cellule MDBK et sur PCLS par rapport aux mono-infections. De plus, une compétition est observée en faveur d’IDV lors des co-infections sur cellules MDBK et sur PCLS. La présence de BCoV dans l’appareil respiratoire bovin est peut-être liée à un changement de tropisme intestinal vers respiratoire, induit par différents facteurs dont la présence d’autres agents pathogènes, conduisant à une réplication productive d’IDV plus importante. Ce constat pourrait favoriser la BPI chez les jeunes bovins.

 

P20

Découverte d’une nouvelle protéine impliquée dans le cycle réplicatif des lentivirus de primates par une double approche évolutive et fonctionnelle

Mégane Wcislo, Andrea Cimarelli, Lucie Etienne

Centre international de recherche en infectiologie (CIRI), ENS Lyon, Université Claude-Bernard Lyon I (UCBL), CNRS : UMR5308, Inserm U1111, Lyon, France

megane.wcislo@ens-lyon.fr

 

Le VIH (virus de l’immunodéficience humaine) responsable du sida (syndrome d’immunodéficience acquise) est un lentivirus issu de la transmission du singe à l’homme de virus SIVs infectants naturellement les primates non-humains. Les virus pathogènes ont joué un rôle prédominant dans l’évolution des protéines cellulaires avec lesquelles ils interagissent. D’une part, les virus interagissent avec des protéines appelées « cofacteurs » pour mener à bien leur propre réplication (par ex. le récepteur CD4 des lentivirus). D’autre part, les virus interagissent avec des protéines cellulaires aux fonctions antivirales, appelées « facteurs de restriction ». Ces interactions entre protéines antagonistes sont à l’origine d’un conflit évolutif entre le virus et l’hôte. Il a ainsi été découvert a posteriori que la plupart des gènes codant des cofacteurs ou des facteurs de restriction portent les stigmates de conflits évolutifs avec les lentivirus, comme un taux de substitutions non-synonymes supérieur à celui de substitutions synonymes (sélection positive), des duplications et délétions fréquentes de gènes et des recombinaisons. Ici, notre objectif est de détecter a priori ces signatures de conflits évolutifs sur des gènes de l’hôte afin de prédire et de découvrir de nouvelles protéines clefs interagissant avec le VIH. À partir d’une liste de 80 gènes surexprimés dans des macrophages primaires infectés par le VIH-1 dans des conditions expérimentales de résistance partielle à l’infection, nous avons notamment identifié un gène candidat avec de fortes signatures de conflits évolutifs chez les primates. Ce gène est issu de la duplication ancestrale d’un gène unique chez les mammifères. Cependant, certains primates n’ont plus qu’un seul paralogue. La perte de paralogue s’est faite à plusieurs reprises au cours de l’évolution des primates et selon des modifications génétiques distinctes, par perte de la région génomique entière ou par pseudogénisation. Les deux paralogues présentent des sites spécifiques sous sélection positive, ainsi que des marques de recombinaison. Des expérimentations fonctionnelles guidées par les résultats évolutifs sont actuellement en cours et semblent mettre en évidence que le gène candidat code une protéine ayant une activité de cofacteur pour le VIH-1. En effet, in vitro, la surexpression de la protéine entraîne une augmentation importante de la production de particules virales chez différentes souches virales de VIH-1. Cet effet potentiateur est moindre pour un lentivirus infectant le singe vert d’Afrique (SIVagm) et de manière notable, il n’y a pas d’effet sur un rétrovirus non lentiviral infectant la souris (MLV). Ces résultats soulignent la spécificité de ce cofacteur pour les lentivirus et plus particulièrement pour le VIH-1. Nos travaux se concentrent à présent sur la caractérisation fine du mécanisme d’action de cette protéine qui semble être un nouvel acteur positif du cycle réplicatif des lentivirus.

 

P21

Role of I-BAR1, a cellular I-BAR protein, in HIV-1 assembly

Kaushik Inamdar1, Aurore Deporet1, Melanie Amigues1, Peggy Merida1, Cyril Favard1, Philippe Roingeard2,3, Delphine Muriaux1

1 Institut de recherche en infectiologie de Montpellier (IRIM), CNRS UMR9004, Université de Montpellier CPBS, Montpellier, France2 Morphogenèse et antigénicité du VIH et du virus des hépatites (Mavivh), Université de Tours, CHRU Tours, Inserm U966, Faculté de Médecine, Tours, France3 Université de Tours, Inserm U1259, Tours, France

delphine.muriaux@irim.cnrs.fr

 

The I-BAR proteins are a family of proteins known to sense and induce negative curvature at the cell plasma membrane. They also act as scaffold proteins for several signalling pathways at the cell membrane. Our lab have revealed that I-BAR1 is an I-BAR protein involved in HIV-1 assembly via an actin-modulating small GTPase Rac1 signalling pathway using siRNA mediated strategy (Thomas et al, 2015). Hence, the specific role of I-BAR1 in HIV-1 assembly was to examine. During HIV-1 assembly and budding, the viral structural Gag proteins are targeted to the plasma membrane where they oligomerize on the viral genome, leading to the virus budding from the cell membrane. Here, we first studied the effect of siRNA mediated gene inhibition of I-BAR1 on Gag VLP production in 293T cells and wild-type HIV-1 production in host CD4 T cells. Second, we analysed the possible interactions between Gag and IRSp53 by immunoprecipitation. Then we examined the incorporation of the IBAR-1 protein in infectious wild-type HIV-1 as well as Gag VLPs produced in 293T cells. We further tested the specificity of this incorporation across other I-BAR family of proteins. Our results show that inhibition of IBAR-1 leads to a significant reduction in VLP production. A direct or indirect interaction between Gag and I-BAR1 was established, and we also reported an increased cell membrane localization of I-BAR-1 upon Gag expression which is dependent on active Rac1. Our results also show that I-BAR1 is specifically incorporated into Gag VLPs as compared to other proteins of the I-BAR family, and is likewise incorporated in the wild-type HIV-1 particle. We further examined the presence of I-BAR1 at the virus budding site by immuno-electron microscopy and dual colour super resolution microscopy. Finally, the dynamic recruitment of I-BAR1 at Gag assembling site was examined by live cell TIRF-M. Imaging analysis indicated the presence of IBAR-1 at Gag assembly sites. Taken together, our results point towards a conclusive and specific new role of IBAR-1 in the assembly of HIV-1 particles.

 

P22

Role of Rac1 dependent actin cytoskeleton cofactors in IAV particle production and infection

Shantoshini Dash1, Adeline Kerviel1, Mathilde Hénaut1,2, Peggy Merida1, Kaushik Inamdar1, Olivier Moncorgé1, Delphine Muriaux1,2

1 Institut de recherche en infectiologie de Montpellier (IRIM), CNRS UMR9004, Université de Montpellier, CPBS Montpellier, France2 CEMIPAI UMS3725, CNRS, University of Montpellier, Montpellier, France

delphine.muriaux@irim.cnrs.fr

 

Enveloped RNA viruses, such as influenza A virus (IAV), assemble and bud from the host cell plasma membrane. This process requires the assembly of the viral components and most likely host cell factors, such as the underneath actin cortex. Actin filaments are known to play a crucial role in cellular membrane dynamics and protrusions. Actin reorganization can be done by ras-related superfamily of small GTPases. Here, we studied the implication of two main GTPases, Rac1 and RhoA, and some of their effectors, on IAV replication. Based on a minireplicon nanoluciferase assay, we report here that the small interfering RNA (siRNA) mediated gene inhibition of these small GTPases and effectors, in A549 pulmonary alveolar human cells, were having an effect on the late steps of IAV infectivity. In addition, we previously set up a minimal system for influenza VLP production. In this study, we show that IAV VLP release decreases in pulmonary A549 cells treated with siRNA targeting Rac1 or some actin related cofactors. Furthermore, since the viral matrix protein M1 is the major linker protein which binds to both the viral RNP and the cell plasma membrane, and initiates viral assembly and budding, we tried to identify any actin-related cellular proteins that specifically interact with M1. By an immunoprecipitation assay on the previously set minimal system for VLP production, we pulled M1 protein with an anti-M1 antibody, and analyzed it by mass spectrometry. The proteomic data show an enrichment of M1 with the actin regulator Cofilin protein that belongs to Rac1 dependent actin regulation signaling pathways, which are linked to, at least, Pak/Cofilin and Wave2 pathways. Thus, our study highlights a potential role for branched actin cytoskeleton dynamics during the late phases of IAV infection.

 

P23

Dynamique intracellulaire et fonctions de la protéine NS1 du virus de la grippe

Ait Yahia Lynda, Christiane De Voreix, Daniel Marc, Francois Lefevre

Unité de virologie et immunologie moléculaires (VIM), INRA, Centre de Jouy-en-Josas, France

aityahia.lynda@gmail.com

 

Les virus influenza du groupe A (VIA) appartiennent à la famille des Orthomyxoviridae (virus enveloppés à génome ARN segmenté de polarité négative) et sont responsables des grippes animales et humaines. La protéine non structurale NS1, facteur de virulence majeur des VIA, est une protéine multifonctionnelle, nucléaire et cytoplasmique, fortement exprimée dans la cellule infectée. Elle favorise la réplication virale par de nombreux mécanismes et constitue la protéine majeure d’évasion immune de ces virus principalement via sa capacité à bloquer la réponse innée antivirale. Toutefois, on sait peu de choses sur sa dynamique fine dans le cytoplasme et le noyau de la cellule infectée, sur ses sites de localisation préférentiels au cours du cycle viral, et en quoi cette dynamique conditionne les fonctions de NS1. Afin d’étudier ces phénomènes par des approches microscopiques, nous avons modifié par génétique inverse le huitième segment génomique de la souche de VIA WSN pour qu’elle exprime au cours du cycle viral la protéine NS1 fusionnée en C-terminal au tag fluorescent tRFP. De façon inattendue, nous avons observé que dans le cytoplasme des cellules humaines A549 infectées par ce virus, la protéine NS1-tRFP se concentre rapidement dans des structures granulaires mobiles, de taille croissante, qui se concentrent progressivement dans la zone périnucléaire. Ces structures n’ont jamais été décrites auparavant. Nous avons montré par immunofluorescence que dans les cellules infectées par la souche WSN sauvage, NS1 se concentre dans des structures analogues. Ces structures, visibles dans toutes les lignées sensibles à WSN, sont sans colocalisation significative avec les mitochondries, le réticulum endoplasmique, le corps de Golgi ou les granules de stress. Curieusement, certaines souches proches de WSN ne forment pas ces structures, NS1 restant diffus dans le cytoplasme au cours du cycle. Via la construction de réassortants, hybrides et mutants ponctuels entre une telle souche (phénotype diffus) et la souche WSN (phénotype agrégatif), nous avons montré que la formation de ces structures implique le segment NS (certains résidus de NS1) mais également d’autres gènes viraux. D’autre part, nous avons mis en évidence un lien entre la localisation de NS1 dans le cytoplasme des cellules infectées et la réponse immunitaire. Ces études en cours permettront de comprendre l’importance fonctionnelle de ces structures et leur rôle comme facteur de virulence in vivo.

 

P24

Contrebande de gènes de la magnétotaxie par un bactériophage tempéré chez Magnetospirillum magnetiucm AMB-1

Nicolas Ginet, Mireille Ansaldi

CNRS/Aix-Marseille Université, UMR7283 Laboratoire de chimie bactérienne Aix-Marseille Université, AMU, Marseille, France

nginet@imm.cnrs.fr

 

Le transfert horizontal de gènes (HGT) permet l’acquisition et l’évolution rapide de nouvelles compétences en provenance d’autres organismes, parfois phylogénétiquement très éloignés. Parmi les différents vecteurs du HGT chez les bactéries, les virus (ou bactériophages) jouent un rôle prééminent en transférant du matériel génétique entre individus par transduction (spécialisée ou généralisée) ou bien, dans le cas des bactériophages tempérés, via la lysogénisation (association stable du génome du phage – appelé alors prophage – avec le génome de l’hôte). La lysogénie peut être bénéfique à l’hôte, par exemple en accroissant chez Vibrio la pathogénicité vis-à-vis des humains (la cytotoxine CtxAB responsable du choléra est encodée dans le génome du phage filamenteux CTX). Le prophage est alors répliqué passivement avec le génome de l’hôte jusqu’à ce que des changements dans les conditions environnementales induisent son excision et la reprise du cycle lytique ; alternativement il peut être définitivement domestiqué dans le génome bactérien via des mutations, des délétions ou des réarrangements génétiques. La magnétotaxie bactérienne – navigation des bactéries dans la colonne d’eau le long des lignes du champ géomagnétique est permise par une série de gènes spécifiques partagés par toutes les bactéries magnétotactiques (MTB). Ces microorganismes forment un groupe polyphylétique et plusieurs évidences pointent sur la participation du HGT à cette diversité. Nous présentons ici des résultats qui suggèrent que le prophage FRODO qui réside dans le génome de la MTB modèle Magnetospirillum magneticum AMB-1 peut s’exciser du génome de son hôte et former des particules virales. Son génome transportant chez AMB-1 des gènes de la magnétotaxie, nous mettons en évidence que FRODO est un vecteur potentiellement actif pour la diffusion et la diversification de la magnétotaxie bactérienne.

 

P25

La déstabilisation des dimères d’ARN du VIH par l’hélicase DDX3 interroge sur son rôle au cours de l’infection

Grégoire De Bisschop, Nathalie Chamond, Bruno Sargueil

Laboratoire de cristallographie et RMN biologiques (LCRB), Université Paris Descartes-Paris 5, CNRS UMR8015, Faculté des sciences pharmacologiques et biologiques, Paris, France

bruno.sargueil@parisdescartes.fr

 

Comme la plupart des rétrovirus, le VIH-1 contient deux molécules d’ARN (ARN génomique ou ARNg) qui sont assemblées sous forme de dimères par le biais d’interactions non covalentes. L’ARNg du VIH-1 peut soit être adressé aux particules virales en cours d’assemblage, soit aux ribosomes où il permet la production des protéines Gag et Gag-Pol. On ignore pourquoi certaines copies de cet ARN sont encapsidées dans des virions alors que d’autres sont traduites. Il est suggéré que les monomères sont efficacement traduits tandis que les dimères sont sélectionnés pour l’encapsidation. La dimérisation de l’ARNg est donc une étape qui doit être finement régulée au cours de l’infection. Plusieurs facteurs cellulaires sont impliqués dans la régulation du cycle viral du VIH ; parmi eux, l’hélicase à boîte DEAD DDX3 est vraisemblablement détournée par le virus pour faciliter l’export et la traduction de l’ARN viral. Nous avons découvert que DDX3 était capable de défaire des dimères stables d’ARN viral avec une efficacité sans précédent. Ici, nous étudions l’interaction de DDX3 avec l’ARN du VIH-1 et nous analysons le réarrangement structural induit par DDX3 par la technique de SHAPE résolue en temps. Ceci nous permet de suivre les événements moléculaires conduisant des dimères d’ARN aux monomères. Nous évaluons actuellement l’effet de ce réarrangement structural sur la traduction virale.

 

P26

Étude des mécanismes moléculaires de la compétence vectorielle d’Ixodes ricinus pour deux flavivirus

Manon Lemasson1, Grégory Caignard1, Yves Unterfinger1, Houssam Attoui1, Lesley Bell-Sakyi2, Damien Vitour1, Jennifer Richardson1, Sandrine A. Lacour1

1 UMR 1161 Virologie, Anses-INRA-ENVA, France2 Department of Infection Biology, Institute of Infection and Global Health, University of Liverpool, Royaume-Uni

manon.lemasson@vet-alfort.fr

 

À l’échelle mondiale, l’émergence de maladies virales transmises par les tiques est en nette augmentation depuis le début du xxie siècle. En Europe, la tique est le premier arthropode capable de transmettre la plus large variété de pathogènes à l’homme et à l’animal. Ixodes ricinus, espèce majoritairement représentée en Europe, transmet 2 flavivirus, le virus de l’encéphalite à tique (TBEV) et le virus Louping ill (LIV). Bien que la transmission de virus par la tique soit connue depuis une centaine d’années, les mécanismes qui permettent à la tique de répliquer les virus et de les transmettre à un hôte (compétence vectorielle) sont encore méconnus. La compétence vectorielle repose en partie sur des interactions protéiques établies entre les virus et la tique. Notre stratégie a consisté à établir une cartographie d’interactions entre les protéines virales de TBEV et LIV et les protéines cellulaires d’I. ricinus par crible double-hybride en levure. L’ADNc de chacune des protéines virales (4 protéines structurales et 7 protéines non structurales pour chacun des virus) a alors été cloné puis criblé contre une banque d’ADNc de tique établie au laboratoire à partir de 3 lignées cellulaires d’I. ricinus. Nous avons analysé 320 colonies de levures et identifié les protéines cellulaires par BLAST automatique à l’aide de la base des génomes VectorBase. Les interactions identifiées ont ensuite été confirmées par une méthode permettant de tester spécifiquement une interaction entre une protéine virale et une protéine cellulaire. Ainsi, 22 protéines d’I. ricinus ont été identifiées pour interagir indifféremment avec les protéines de TBEV et LIV. L’identification et l’annotation de gène ontologie (GO) ont été effectuées à partir de la base de données DAVID en se référant au génome de tique à ce jour le plus exhaustif, Ixodes scapularis. Les 22 protéines cellulaires de tique semblent impliquées dans des processus biologiques mis en jeu lors d’une infection virale telle que la réponse immunitaire ou bien la maturation de ribosomes. En conclusion, nous avons établi pour la première fois une cartographie d’interactions protéiques entre LIV, TBEV et leur vecteur I. ricinus à partir d’un matériel biologique original. Ce travail sera poursuivi par la caractérisation in vitro du rôle de chaque interacteur sur le cycle viral par extinction de l’expression de ces interacteurs. L’extinction de l’expression de ces mêmes interacteurs chez la tique vivante permettra de déterminer leur rôle dans la compétence vectorielle de la tique pour TBEV et LIV. Ces travaux devraient permettre d’identifier des facteurs impliqués dans l’infection et la dissémination de TBEV et LIV chez leur vecteur et ainsi d’apporter de nouvelles connaissances quant aux déterminants moléculaires de la compétence vectorielle. La comparaison d’un tel réseau d’interactions protéiques avec des réseaux préalablement établis entre d’autres arbovirus et leur vecteur permettrait de prédire la compétence vectorielle d’I. ricinus pour ces arbovirus dans le but d’anticiper leurs introductions en Europe et limiter ainsi leurs impacts sociétaux.

 

P27

Identification d’un nouveau motif indispensable à la restriction du virus de la grippe par la protein MX1

Olivier Moncorgé1, Laurent Chaloin1, Laura Graf2, Marine Tauziet1, Joe Mckellar1, Charlotte André1, Wendy Barclay3, Georg Kochs2, Caroline Goujon1

1 Institut de recherche en infectiologie de Montpellier (IRIM), CNRS UMR9004, Université de Montpellier, CPBS, Montpellier, France2 Institut fuer Virologie, Hermann-Herder-Strasse 11, Allemagne3 Imperial College London, St Mary's Campus, London W2 1PG, Royaume-Uni

caroline.goujon@irim.cnrs.fr

 

Suite à la détection d’agents pathogènes, les interférons (IFN) de type I sont produits par les cellules infectées et induisent l’expression de plusieurs centaines de gènes, à la fois dans les cellules infectées et dans les cellules environnantes. Les produits de ces gènes plongent les cellules dans un état dit antiviral dans le but de limiter la réplication virale. Il s’agit de la première ligne de défense mise en place au niveau cellulaire contre les infections. Les protéines MX1 et MX2, des GTPases de haut poids moléculaire et membres de la famille des dynamines, jouent un rôle important dans l’inhibition induite par l’IFN de la réplication de certains virus. MX1 humain, également nommé MxA, est un facteur de restriction à large spectre, capable d’inhiber la réplication du virus influenza A (FLUAV) ainsi qu’une grande diversité de virus à ARN mais aussi à ADN et ce, à différents stades de leurs cycles de réplication. MX2 humain (ou MxB) est quant à lui capable de bloquer le VIH-1 ainsi que les herpes virus. Bien que l’activité antivirale d’MX1 ait été intensément étudiée depuis les années 80, son ou ses modes d’actions sont encore largement incompris. MX1 et MX2 partagent 63 % d’identité au niveau de leurs séquences peptidiques. L’organisation des différents domaines est identique entre les deux protéines et leurs structures tridimentionnelles sont quasiment superposables. En utilisant des chimères entre MX1 et MX2 pour lesquelles différents domaines ont été échangés, ainsi que des mutants ponctuels, nous avons cherché à identifier de nouveaux motifs indispensables à l’activité antivirale de MX1 contre le virus de la grippe. Nous avons notamment identifié une séquence clé pour la restriction de FLUAV mais aussi d’autres virus comme Thogotovirus (Orthomyxovirus) et LaCrosse encephalitis virus (Bunyavirus). Cette étude, ainsi que d’autres approches développées au laboratoire, ont pour but d’élucider le ou les modes d’action de MX1 et d’inspirer de nouvelles approches thérapeutiques.

 

P28

Identification de nouveaux modulateurs de la réplication virale du VIH par des approches évolutives et fonctionnelles

Lea Picard1, François Gindraud, Andrea Cimarelli1, Julien Dutheil, Laurent Guéguen2, Lucie Etienne1

1 Centre international de recherche en infectiologie (CIRI), École normale supérieure (ENS) Lyon, Université Claude-Bernard Lyon I (UCBL), CNRS : UMR5308, Inserm U1111, Lyon, France2 Laboratoire de biométrie et biologie évolutive (LBBE), CNRS : UMR5558, Université Claude-Bernard Lyon I, Villeurbanne, France

laurent.gueguen@univ-lyon1.fr, lucie.etienne@ens-lyon.fr

 

En tant que parasites intracellulaires obligatoires, les virus interagissent au cours de l’infection avec de nombreuses protéines des cellules de l’hôte, appelées protéines d’interaction virale. De nombreuses mutations s’accumulent aux sites d’interaction entre protéines de l’hôte et du virus, ce qui permet à chacune des deux parties de surmonter le plus récent avantage acquis par l’autre. Au cours du temps évolutif, cette course à l’armement amène à l’établissement de signatures d’innovations génétiques et de sélection positive sur les gènes de l’organisme hôte (fort taux de substitutions non-synonymes/synonymes, duplications/délétions/ recombinaisons). La réponse immunitaire innée, médiée par la production de molécules telles que l’interféron I, constitue notamment la première ligne de défense contre les pathogènes viraux à travers la transcription de milliers de gènes, dont une grande partie est impliquée directement dans la réponse antivirale. Notre but est donc d’identifier de nouvelles protéines d’interaction virale parmi celles codées par des gènes stimulés par l’interféron, via la détection de signatures d’innovations génétiques et de sélection positive sur leurs séquences. À cette fin, nous avons développé un pipeline bioinformatique permettant l’alignement de séquences orthologues chez les primates, la détection de gènes paralogues, la détection d’événements de recombinaison, et l’identification de sites sous sélection positive. Nous avons validé ce pipeline évolutif et prédictif sur un jeu de données de 20 gènes avec des histoires évolutives à la fois connues et variées. Nous avons ensuite criblé 80 gènes précédemment identifiés comme surexprimés dans des macrophages primaires infectés par le VIH-1. Parmi ces gènes, nous avons identifés deux gènes stimulés par l’interféron présentant un intérêt particulier du fait des importantes signatures de sélection positive portées par leurs séquences. Notre travail actuel porte sur la caractérisation fonctionnelle de ces deux gènes d’intérêt afin de déterminer s’ils présentent des activités antivirales contre le VIH ou d’autres rétrovirus. À moyen terme, nous étenderons nos analyses évolutives à plus grande échelle pour cribler les 2500 gènes de l’interférome afin d’identifier des protéines d’interaction virale additionnelles. Ce projet interdisciplinaire associe analyses évolutives et fonctionnelles pour identifier de nouveaux gènes immunitaires avec de potentielles activités contre de multiples pathogènes.

 

P29

Évaluation de la diversité génétique du virus de l’hépatite E au cours de passages successifs en cellules hépatocytaires HepaRG

Virginie Doceul1, Edouard Hirchaud2, Marie Pellerin1, Pierrick Lucas2 Aurélie Leroux2, Yannick Blanchard2, Nicole Pavio1

1UMR 1161 Virologie, INRA UMR1161, Anses, École nationale vétérinaire d’Alfort, Maisons-Alfort, France2 Ploufragan/Plouzané Laboratory, Unit of Viral Genetics and Bio-security, Anses, PRES Université Européenne de Bretagne [UEB], Ploufragan, France

nicole.pavio@vet-alfort.fr

 

Le virus de l’hépatite E (HEV) est un petit virus quasi-enveloppé doté d’un génome composé d’un ARN simple brin de polarité positive codant pour 3 cadres de lecture ouverts (ORF). À l’instar des virus à ARN, des erreurs d’incorporation nucléotidiques sont commises lors de la réplication du HEV, ce qui génère une grande population de virus apparentés à chaque cycle. À ce jour, peu de données sont disponibles au regard de cette variabilité chez le HEV et en particulier sur la sélection potentielle de mutations, dans les réservoirs animaux, qui pourrait moduler la virulence chez l’homme. Au laboratoire, nous avons développé un système de culture du HEV en cellules hépatocytaires HepaRG. Après infection par le HEV, ces cellules produisent du virus dans le surnageant pendant plusieurs mois et des passages successifs du HEV peuvent être réalisés sur de nouvelles cultures. Après plusieurs passages, une augmentation des titres viraux a pu être observée. Afin de déterminer s’il existait un lien entre cette augmentation de la production virale et la diversité des populations, la variabilité génétique du HEV a été déterminée à différents passages. Des cellules HepaRG différenciées en hépatocytes ont été infectées par une souche de HEV génotype 3f (JN906974). Sept passages successifs ont été réalisés à différents temps post-infection. Des surnageants sélectionnés aux passages 2, 6 et 7 ont été soumis à un séquençage haut débit (Ion Proton). Les séquences ont été nettoyées avec le Trimmomatic puis alignées sur le génome de référence avec BWA et les SNP (single nucleotide polymorphism) identifiés avec Varscan. Dans les 3 échantillons étudiés, 58 points de polymorphisme ont été sélectionnés le long des ORF1 et -2 du HEV. Aucun polymorphisme n’a été identifié dans les ORF3. Sur ces 58 sites, 45 ne sont présents qu’à un seul passage. Les 13 autres points de polymorphisme sont observés au passage 6 et maintenus au passage 7. Pour chaque ORF, les valeurs des paramètres Pi (p), dn/ds, ont été déterminées. Les valeurs de Pi sont similaires aux passages 6 et 7 mais supérieures à celles du passage 2. Les valeurs des dn/ds sont inférieures à 1. Au cours de l’infection des cellules HepaRG par le HEV, des sites de polymorphisme sont sélectionnés dans les ORF1 et 2. La diversité des populations augmente avec les passages, selon une sélection négative. Ces mutations pourraient conférer au HEV un avantage de multiplication dans les cellules HepaRG et moduler sa virulence.

 

P30

Interactomes of HPV E6 proteins: targets and molecular pathways

Murielle Masson

CNRS/université de Strasbourg (UMR 7242), ESBS, Illkirch, France

murielle.masson@unistra.fr

 

HPV (human papillomavirus) are double-strand DNA viruses that infect cutaneous or mucosal keratinocytes. Among the 200 identified HPVs, only few of them are associated with cancers. Mucosal high-risk HPVs (such as HPV16, 18, 33, 45...) are associated with cervical cancer, anogenital cancers, and head-neck cancers. Infection with some cutaneous HPV (such as HPV 5,8, 38...) has been associated with the development of non-melanoma skin cancer, especially in immunosuppressed patients and patients with epidermodisplasiverruciformis disease. The oncogenic potential of HPV is due to the expression of two viral proteins E6 and E7. Here, we will present and discuss interactomic data showing distinct cellular proteins and pathways targeted by E6 proteins from different HPV types.

 

P31

Impact de la balance hémagglutinine/neuraminidase sur les événements de co-infection pour les virus influenza A

Nicolas Malausse, Sylvie Van Der Werf, Nadia Naffakh, Sandie Munier

Unité de génétique moléculaire des virus à ARN, Institut Pasteur, CNRS UMR 3569, Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Paris, France

nicolas.malausse@pasteur.fr, sandie.munier@pasteur.fr

 

Les phénomènes de co-infections jouent un rôle majeur dans l’évolution des virus influenza A, en permettant d’une part la complémentation génétique entre particules dont le génome est défectif, et d’autre part le réassortiment, c’est-à-dire l’échange de segments génomiques entre plusieurs particules distinctes, aboutissant à la formation de nouveaux génotypes viraux. À ce jour, les facteurs cellulaires et viraux affectant la fréquence des événements de co-infection chez les virus influenza A sont largement méconnus. L’un des déterminants viraux pourrait être l’équilibre entre les activités enzymatiques des deux glycoprotéines de surface du virus, l’hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA), appelé balance HA-NA. La HA, en se liant aux acides sialiques (AS) présents à la surface de l’enveloppe virale, favorise l’agrégation entre particules virales. La NA, par son activité sialidase, clive les AS et permet la libération des virions néo-formés et limite leur agrégation. Les données publiées indiquent que la balance HA-NA module la capacité de multiplication et de transmission des virus influenza A. Nous faisons l’hypothèse que la balance HA-NA, en contrôlant le degré d’agrégation des particules virales, est déterminante pour la fréquence des co-infections. Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons mis au point un système novateur de mesure de la fréquence des co-infections basé sur de la cytométrie en flux. Pour mettre au point le système expérimental, nous avons produit et caractérisé un couple de virus influenza A/WSN/33 recombinants exprimant chacun un rapporteur fluorescent (GFP et mCherry, qui ont des spectres d’émission distincts) à partir du même segment PB2. Afin de quantifier les événements de co-infection, des cellules A549 ont été co-infectées en condition de cycle unique par des dilutions en série d’un mélange équiproportionnel des deux virus. La fluorescence des cellules infectées a été analysée par cytométrie en flux et la proportion des cellules positives pour l’une ou l’autre des protéines fluorescentes (GFP+ ou mCherry+), doublement positives, ou doublement négatives, a été mesurée. Nous avons démontré que ce système permettait la quantification relative des événements de co-infection matérialisés par la proportion des cellules doublement positives (GFP+, mCherry+). Afin d’appliquer ce système à l’étude de la balance HA-NA, nous avons choisi comme modèle des variants naturels de virus H1N1 saisonniers qui ont co-circulé durant l’hiver 2007/2008 et présentaient une balance HA-NA distincte. Nous avons donc produit et caractérisé des virus recombinants présentant à leur surface la même HA (A/Paris/0644/2007) en combinaison avec une NA possédant soit une forte activité enzymatique (A/Paris/0497/2007), soit une faible activité enzymatique (A/Paris/1170/2008) du fait de la mutation H275Y de résistance à l’oseltamivir. Pour chacune des combinaisons HA-NA, un couple de virus GFP/mCherry a été produit. Les expériences de quantification relative des événements de co-infection avec l’un ou l’autre des couples de virus sont en cours. Ces données fourniront une première évaluation de l’impact de la balance HA-NA sur la fréquence des événements de co-infection pour les virus influenza A.

 

P32

An RNA-Centric Dissection of Host Complexes Controlling Flavivirus Infection

Karim Majzoub1,2, Yaw Shin Ooi1, Ryan Flynn3, Miguel Mata1, Jonathan Diep1, Jason Kenichi Li4, Nicholas Van Buuren4, Neil Rumachik3, Alex Johnson5, Andreas Puschnik1, Caleb Marceau1, Luwanika Mlera6, Jeffrey Grabowski66, Karla Kirkegaard4, Marshall Bloom6, Peter Sarnow1, Caroly Bertozzi3,7, Jan Carette1

1 Department of Microbiology and Immunology, Stanford University, Stanford, CA 94305, États-Unis2 Institut de recherche sur les maladies virales et hépatiques, Université de Strasbourg, Inserm UMRS1110, Strasbourg, France3 Department of Chemistry, Stanford University, Stanford, CA 94305, États-Unis4 Department of Genetics, Stanford University, Stanford, CA 94305, États-Unis5 Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University, Stanford, CA 94305, États-Unis6 Biology of Vector-Borne Viruses Section, NIAID/NIH, Hamilton, MT 59840, États-Unis7 Howard Hughes Medical Institute, Stanford University, Stanford, CA, 94305, États-Unis

raflynn@stanford.edu, carette@stanford.edu

 

Flaviviruses including dengue virus (DENV) and Zika virus (ZIKV) cause significant human diseases. Co-opting cellular factors for viral translation and viral genome replication at the endoplasmic reticulum (ER) is a shared replication strategy, despite different clinical outcomes. While the protein products of these viruses have been studied in depth, how the RNA genomes operate inside human cells is poorly understood. Using comprehensive identification of RNA binding proteins by mass spectrometry (ChIRP-MS), we took an RNA-centric viewpoint of flaviviral infection and identified several hundred proteins associated with both DENV and ZIKV genomic RNA in human cells. Genome-scale knockout screens assigned putative functional relevance to the RNA-protein interactions observed by ChIRP-MS. ER RNA binding proteins such vigilin and RRBP1 directly bound viral RNA and each acted at distinct stages in the life cycle of flaviviruses. Thus, this versatile strategy can elucidate features of human biology that control pathogenesis of clinically relevant viruses.

 

P33

Etude des interactions de l’ARN-polymérase des virus influenza avec l’ARN-polymérase II

Jessica Morel, Laura Sedano, Nathalie Lejal, Bruno Da Costa, Ronan Le Goffic, Bernard Delmas

Unité de recherche virologie et immunologie moléculaires (VIM) INRA, Jouy-en-Josas, France

jessica.morel@inra.fr, bernard.delmas@inra.fr

 

Les virus influenza sont les agents causaux de la grippe saisonnière et peuvent être responsables de pandémies comme celles de 1918 ou de 2009. De par leur capacité à se multiplier dans différentes espèces et à franchir les barrières d’espèce, ces virus représentent une menace pour la santé humaine. L’ARN-polymérase des virus influenza (FluPol) est constituée de trois sous-unités (PA, PB1 et PB2) et assure la transcription et la réplication du génome viral dans le noyau des cellules infectées. FluPol possède une fonction « vol de coiffe » qui lui permet de se fixer à l’extrémité 5’ des ARNm de l’hôte et de les cliver afin de s’en servir d’amorce pour la synthèse des ARNm viraux. Pour se faire, FluPol interagit avec l’ARN-polymérase II cellulaire (Pol II) en se fixant à la forme phosphorylée de la Ser5 du motif répété YSPTSPS du domaine C-terminal de la sous-unité POLR2A. Dans cette étude, nous avons cherché à identifier de nouvelles interactions entre les sous-unités de FluPol et l’ensemble des 12 sous-unités du complexe Pol II. Pour se faire, nous avons utilisé deux systèmes de complémentation (split-Gaussia luciférase et split-venus) qui permettent respectivement de quantifier et de localiser dans la cellule les interactions protéine-protéine. Dans une première étape de validation de ces tests, le système split-luciférase a révélé de fortes interactions entre les sous-unités PA et PB1 de FluPol (NLR [rapport signal/bruit de fond] compris entre 300 et 800) et ainsi qu’entre sous-unités contigües de Pol II, comme POLR2C avec POLR2J (NLR voisin de 1000) et POLR2D avec POLR2G (NLR voisin de 100). Entre sous-unités de Pol II distantes, le test ne permet pas d’identifier d’interaction, suggérant que les signaux détectés marquent une forte proximité dans les couples de protéines analysées. L’analyse des interactions entre sous-unités de FluPol et Pol II montre que, prises isolément, PB1 et PB2 interagissent avec POLR2C, POLR2D, POLR2H avec des NLR compris entre 15 et 20 alors que le dimère PA+PB1 et le trimère FluPol valident des interactions de magnitude similaire à POLR2C (NLR voisin de 45), POLR2D (NLR voisin de 40) et POLR2G (NLR voisin de 30). Le système de complémentation split-venus permet de valider les interactions POLR2D/POLR2G et POLR2C/POLR2J qui étaient révélées par des NLR élevés, dans le noyau et le cytoplasme, mais aussi des interactions de FluPol avec certaines sous-unités de Pol II. Des expériences de co-immunoprécipitation nous permettront de valider les interactions identifiées par ces deux tests de complémentation. Nous présenterons également les résultats obtenus avec des formes tronquées de sous-unités de FluPol afin de mieux définir les domaines d’interaction entre sous-unités de FluPol et Pol II. Nous anticipons que ces travaux nous permettrons de mieux appréhender les relations structurales et fonctionnelles entre ces deux complexes lors de la transcription virale.

 

P34

Exploration du contrôle des virus de la dengue et Zika par la protéine de liaison à l’ARNdb Loqs2 chez Aedes aegypti

Antinéa Babarit1, Roenick Proveti Olmo1, Christina Piermaria1, Johana Chicher2, Lauriane Kuhn2, Philippe Hammann2, Eric Marois1, Jean-Luc Imler1, João Trindade Marques1,3

1 Institut de biologie moléculaire et cellulaire (IBMC), CNRS : UPR9022, Strasbourg, France2 Plateforme protéomique Strasbourg-Esplanade (IBMC), FRC 1589 Strasbourg, France3 Department of Biochemistry and Immunology, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), Av. Antônio Carlos, 6627 -Pampulha -Belo Horizonte -MG, Brésil

jtm@ufmg.br

 

Les virus transmis par les moustiques, tels que la dengue (DENV), le Chikungunya ou Zika (ZIKV) représentent un problème majeur de santé publique. On estime que près de 390 millions de personnes sont infectées par DENV chaque année et près de 40 % de la population mondiale est considérée comme « à risque ». Selon l’OMS, la dengue constitue une des dix plus grandes menaces pour la santé de l’humanité en 2019. Les vaccins et traitements actuels contre DENV manquent d’efficacité et les mesures de santé publique reposent principalement sur le contrôle des vecteurs de cette maladie. Une meilleure compréhension de la résistance antivirale est essentielle pour le développement de nouvelles stratégies permettant le contrôle de la transmission des arbovirus par leurs vecteurs. Chez les insectes, la réponse antivirale repose sur la voie des petits ARN interférents (small-interfering RNA, siRNA), qui reconnait les intermédiaires ARN de réplication viraux et s’en sert comme matrice afin de produire des petits ARN responsables du clivage des génomes viraux. Récemment, notre équipe a observé que la voie des siRNA chez les moustiques Aedes n’est pas capable de contrôler l’infection par DENV dans l’intestin, malgré la production de siRNA dérivés de ce virus. En revanche, la voie des siRNA est essentielle au contrôle de la dissémination du virus à d’autres tissus. Ces observations ont mené à l’identification d’un nouveau composant de la voie des siRNA, la protéine de liaison à l’ARN double-brin Loqs2, paralogue de R2D2 et Loquacious (Loqs) et spécifique des moustiques du genre Aedes. Ce gène n’est pas exprimé dans l’intestin et est nécessaire au contrôle de la dissémination systémique de DENV et ZIKV. En outre, l’expression ectopique de Loqs2 dans l’intestin est suffisante à restreindre la réplication virale dans ce tissu. L’expression transitoire de Loqs2 dans la lignée cellulaire d’Aedes aegypti, Aag2, a permis l’identification de ses deux interactants principaux par spectrométrie de masse: R2D2 et Loqs, tous deux étant d’importants partenaires de la voie des siRNA. Afin de confirmer ces résultats in vivo, nous avons réalisé une analyse par spectrométrie de masse sur des moustiques exprimant Loqs2 de manière ectopique dans l’intestin. Loqs2 a été co-immunoprécipité à partir de moustiques entiers et d’intestins disséqués, suivi par l’identification des partenaires protéiques. Les résultats de cette analyse concordent avec ceux obtenus précédemment par l’approche ex vivo, en particulier l’interaction avec Loqs et AAEL012964, dont l’orthologue chez Drosophila melanogaster semble contribuer à la réponse antivirale. Nos résultats commencent à définir l’interaction de Loqs2 avec la voie des siRNA et d’autres mécanismes antiviraux permettant le contrôle des virus de la dengue et Zika chez les moustiques. À long terme, une meilleure compréhension des mécanismes des propriétés antivirales de Loqs2 pourrait mener au développement d’outils et de stratégies afin de contrôler la transmission des arbovirus.

 

P35

Tropisme et dissémination de ZIKV de la mère à l’enfant au cours de l’allaitement maternel

Mathieu Hubert1, Aurélie Chiche2, Vincent Legros1, Patricia Jeannin1, Antoine Gessain1, Pierre-Emmanuel Ceccaldi1, Aurore Vidy-Roche1

1 Unité épidémiologie et physiopathologie des virus oncogènes, UMR CNRS 3569, Département virologie, Institut Pasteur, Paris France2 Groupe à 5 ans Plasticité cellulaire et modélisation des maladies, Institut Pasteur, Paris, France

pierre-emmanuel.ceccaldi@pasteur.fr, aurore.vidy@pasteur.fr

 

Le virus Zika (ZIKV) est un arbovirus appartenant à la famille Flaviviridae et au genre Flavivirus. Découvert en 1947 dans la forêt de Zika (Ouganda), les premières épidémies de ZIKV furent observées dans les îles du Pacifique, à Yap (2007) et en Polynésie française (2013-14). Plus récemment, en 2015-16, ZIKV a émergé sur le continent américain. Outre l’augmentation explosive de l’incidence de syndromes congénitaux liés à Zika, cette dernière épidémie fût caractérisée par le nombre important de transmissions interhumaines (pseudo-verticalement par voie transplacentaire et horizontalement par voie sexuelle) et par l’isolement de particules infectieuses dans de nombreux fluides biologiques humains. Parmi ceux-ci, le lait maternel de plusieurs femmes infectées a été décrit comme contenant de fortes charges virales, y compris après 30 jours de lactation. Cependant, l’origine de ces particules infectieuses ainsi que leur potentiel de transmission au nouveau-né restent inconnus. Dans ce travail, nous nous sommes intéressés aux interactions virus-hôte entre ZIKV, la glande mammaire et la barrière intestinale pour répondre à ces deux problématiques, respectivement. Dans un premier temps, nous avons démontré la dissémination de ZIKV dans les glandes mammaires de souris systémiquement et localement infectées. De plus, des expériences in vitro ont montré que des cellules épithéliales primaires de glande mammaire humaine ainsi que différentes lignées cellulaires étaient sensibles et permissives à l’infection ZIKV, suggérant un potentiel rôle des cellules épithéliales mammaires dans l’excrétion de ZIKV dans le lait maternel. Nous avons dans un second temps montré que de jeunes souriceaux étaient susceptibles à l’infection par voie orale, illustrant la plausibilité de ce mode de transmission. Enfin, nous avons démontré que ZIKV était capable d’infecter et de franchir un modèle in vitro d’épithélium intestinal humain sans altérer sa fonction de barrière, suggérant un potentiel rôle de cet épithélium dans la transmission orale de ZIKV. Ces résultats retracent chronologiquement des processus impliqués dans une éventuelle transmission de ZIKV au cours de l’allaitement et permettent de mieux comprendre l’origine et le devenir de particules infectieuses véhiculées par le lait maternel.

 

P36

Translational control of APOBEC3G via HIV-1 VIF-regulated upstream open reading frame

Camille Libre, Tanja Seissler, Julien Batisse, Santiago Guerrero, Benjamin Stupfler, Orian Gilmer, Fabrice Jossinet, Roland Marquet, Jean-Christophe Paillart

Architecture et réactivité de l’ARN (ARN), CNRS : UPR9002, Université de Strasbourg, IBMC, Strasbourg, France

jc.paillart@ibmc-cnrs.unistra.fr

 

The HIV-1 viral infectivity factor (Vif) is essential for viral fitness and pathogenicity. Vif targets cellular cytosine deaminases, APOBEC3G (A3G), A3F, A3D and A3H which inhibit HIV-1 replication by inducing extensive mutation (G to A) in the (-) strand DNA during reverse transcription and by reducing the efficiency of reverse transcription and integration. Vif counteracts A3G (1) by recruiting an E3-ubiquitin complex and inducing its degradation through the proteasome pathway, (2) by reducing A3G transcription, and (3) by inhibiting its translation at the mRNA level, thus preventing its incorporation into viral particles. We recently showed that two distal stem-loop structures in the 5’ untranslated region (5’UTR) of A3G mRNA are important for the Vif-mediated translational inhibition of A3G1. Interestingly, detailed analysis of this region showed the presence of a small upstream open reading frame (uORF), a well known motif considered to be inhibitor of downstream translation initiation at the main protein coding sequence. We thus generated a panel of A3G and A3F 5’UTR mutants and analyzed their expression after transfection of HEK293T cells in presence or absence of Vif. These experiments were also performed with proteasome inhibitors in order to distinguish proteasomal degradation from translational inhibition. First, we showed that disruption of the uORF (deletion or substitution of the uORF initiation codon) intrinsically increases the expression of A3G/F. This uORF is however required to allow the Vif-mediated downregulation of A3G/F translation. Moreover, the uORF is functional (strong Kozak context) but its peptide sequence, contrary to its length, does not seem to be important. Furthermore, increasing or decreasing the length between the two ORFs suggests that the mechanism of A3G/F translation involves a mix of leaky-scanning and re-initiation. Finally, in stress conditions, the targeting of A3G mRNA in stress granules is dependent not only on Vif but also on the uORF. Taken together, we showed for the first time that A3G/F translation is regulated by a small uORF embedded in their 5’UTR and that Vif uses this specific motif to repress their translation and target A3G mRNA to stress granules. Regulating the translation of A3G/F could thus be considered as a new target to restore a functional expression of A3G/3F and viral restriction. This work is supported by grants from the French National Agency for Research on AIDS and Viral Hepatitis (ANRS) and Sidaction. [1] Guerrero S.X., et al. Scientific Reports 2016 ; 6 : 39507.

 

P37

Induction of Proinflammatory Multiple Sclerosis-Associated Retrovirus Envelope Protein by Human Herpesvirus-6A and CD46 Receptor Engagement

Benjamin Charvet1,2, Josephine Reynaud2, Geraldine Gourru-Lesimple2, Hervé Perron1, Patrice Marche3, Branka Horvat2

1 Geneuro Innovation (GeNeuro), Geneuro Innovation, Lyon, France2 CIRI, CIRI, Inserm, U1111, Université Claude-Bernard Lyon 1, CNRS, UMR5308, École normale supérieure de Lyon, Univ Lyon, Lyon, France3 Institute for Advenced Biosciences, Institute for Advanced Biosciences, Inserm U1209, CNRS UMR5309, Université Grenoble-Alpes, Grenoble, France

branka.horvat@inserm.fr

 

The aberrant expression of human endogenous retrovirus (HERV) elements of the HERV-W family has been associated with different diseases, including multiple sclerosis (MS). In particular, the expression of the envelope protein (Env) from the multiple sclerosis-associated retrovirus (MSRV), a member of HERV-W family known for its potent proinflammatory activity, is repeatedly detected in the brain lesions and blood of MS patients. Furthermore, human herpesvirus 6 (HHV-6) infection has long been suspected to play a role in the pathogenesis of MS and neuroinflammation. We show here that both HHV-6A and stimulation of its receptor, transmembrane glycoprotein CD46, induce the expression of MSRV-Env. The engagement of extracellular domains SCR3 and SCR4 of CD46-Cyt1 isoform was required for MSRV-env transactivation, limiting thus the MSRV-Env induction to the CD46 ligands binding these domains, including C3b component of complement, specific monoclonal antibodies, and both infectious and UV-inactivated HHV-6A, but neither HHV-6B nor measles virus vaccine strain. Induction of MSRV-Env required CD46-Cyt-1 signaling and was abolished by the inhibitors of protein kinase C. Finally, both membrane-expressed and secreted MSRV-Env trigger TLR4 signaling, displaying thus a proinflammatory potential, characteristic for this viral protein. These data expand the specter of HHV-6A effects in the modulation of the immune response and support the hypothesis that cross-talks between exogenous and endogenous viruses may contribute to inflammatory diseases and participate in neuroinflammation. Furthermore, they reveal a new function of CD46, known as an inhibitor of complement activation and receptor for several pathogens, in transactivation of HERV env genes, which may play an important role in the pathogenesis of inflammatory diseases.

 

P38

Identification of host HIV-1 Vif RNA targets by PAR-CLIP

Benjamin Stupfler1, Tanja Seissler1, Fabrice Jossinet1, Sarah Gallois-Montbrun2, Roland Marquet1, Jean-Christophe Paillart1

1 Institut de biologie moléculaire et cellulaire (IBMC), CNRS : UPR9002 Strasbourg, France2 Institut Cochin, CNRS : UMR8104, Inserm : U1016, Université Paris V-Paris Descartes, PRES Sorbonne Paris Cité, Paris, France

b.stupfler@ibmc-cnrs.unistra.fr

 

Host cells respond to viral infections thanks to specific antiviral proteins referred as restriction factors. In the case of HIV-1, APOBEC3G (A3G) is a key restriction factor, as it catalyzes C to U deamination on the (-) cDNA strand during viral genome reverse transcription, leading to hyper-mutation and stop-codon generation on proviral DNA. HIV-1 co-evolves by expressing Vif (Viral infectivity factor), which hinders A3G expression at the transcription, translation and protein level. Vif inhibitory activities on A3G expression was first characterized at the protein level, as Vif recruits an E3-ubiquitin ligase complex leading to A3G redirection to the proteasome after ubiquitination. Beside, we showed that Vif presents a strong inhibitory activity on A3G mRNA translation and more recently that stem-loops 2 (SL2) and SL3 within the A3G 5’UTR are required for the Vif-mediated A3G translational inhibition (Guerrero et al, 2016). While the molecular mechanism is still unknown, it seems that Vif directly interacts with A3G mRNA to inhibit its translation. The aim of my study is to investigate other Vif RNA targets. My objective is to perform PAR-CLIP experiments in order to identify and map cellular RNAs regulated by Vif. This work should lead to the identification and further characterization of unknown cellular factors involved in viral replication (negative or positive regulation), giving new insight on therapeutic targets for HIV-1 treatments. This work is supported by grants and fellowship from the French National Agency for Research on AIDS and Viral Hepatitis (ANRS) and Sidaction Guerrero SX, et al. Scientific Reports 2016 ; 6 : 39507.

 

P39

Clonage Gateway R@ de la région précoce pour étudier les interactions système immunitaire humain -MCPyV dans le carcinome de Merkel

Junchao Miao1, Hélène Valentin1, Thibault Kervarrec2,3, Antoine Touze2, Christine Delprat1

1 Centre de recherche en cancérologie de Lyon (CRCL), Inserm U1052, CNRS : UMR5286, Université Claude-Bernard Lyon I, UnivLyon, Lyon, France2 Équipe biologie des infections à polyomavirus, ISP, Institut national de la recherche agronomique (INRA) : UMR1282, Université de Tours, Tours, France3 Département d’anatomopathologie, CHU de Tours, Chambray-lès-Tours, France

christine.delprat@univ-lyon1.fr

 

Le polyomavirus à cellule de Merkel (MCPyV ou HuPyV5, anciennement MCV) est un virus à ADN double brin non-enveloppé de la famille des Polyomaviridae. Il a été découvert en 2008 dans des patients atteints du carcinome à cellules de Merkel (MCC), une tumeur cutanée rare et agressive de la personne âgée, mais dont la fréquence a augmenté jusqu’à devenir la deuxième cause de mortalité liée aux cancers de la peau. 80 % des MCC ont intégré le génome de MCPyV dans les cellules cancéreuses. La population humaine est majoritairement séropositive donc MCPyV est un oncovirus opportuniste. L’ADN génomique viral double brin circulaire présente une région précoce et une région tardive séparées par un promoteur bidirectionnel. La région tardive code les protéines virales structurales (VP1, VP2 et VP3) ; la région précoce code des protéines virales régulatrices telles que l’antigène grand T (LT), petit T (sT) ou d’autres protéines aux rôles méconnus (57KT, ALTO). LT et sT sont des protéines impliquées dans la réplication virale qui contribuent aussi à l’oncogenèse et à la progression du MCC. Elles sont capables d’initier la transformation cellulaire en fixant et inactivant certains suppresseurs de tumeur comme pRb et PP2A. L’antigène sT favorise aussi les métastases en induisant la dissociation et la mobilité des cellules. Nous nous intéressons aux interactions MCPyV, système immunitaire humain. Nous étudions le rôle des antigènes viraux de la région précoce dans la régulation de la réponse immunitaire contre le MCC. La réponse immunitaire participe au contrôle du développement et de l’agressivité des cancers qu’il est désormais possible de moduler par des traitements immuno-thérapeutiques. Les plus prometteurs impliquent les inhibiteurs de contrôles immunitaires (immune checkpoints). Les anticorps biothérapeutiques étudiés dans le MCC sont ipilimumab (anti-CTLA-4), nivolumab (anti-PD-1), pembrolizumab (anti-PD-1) et avelumab (anti-PD-L1). Nous faisons l’hypothèse que les antigènes viraux du MCPyV agissent sur ces points de contrôle et la régulation de l’inflammation pour favoriser l’immunosuppression dans le microenvironnement tumoral et ainsi promouvoir le MCC. Nous avons cloné les gènes de la région précoce de MCPyV en système GatewayR@ dans des vecteurs capables d’exprimer ces gènes dans des cellules humaines afin d’étudier la modification de leur biologie.

 

P40

Le criblage d’une banque d’exoribonucléases cellulaires interagissant avec la polymérase des virus influenza permet d’identifier l’implication de la protéine cellulaire ERI1 dans le cycle viral

Marion Declercq, Elise Biquand, Marwah Karim, Caroline Demeret, Cyril Barbezange, Sylvie Van Der Werf

Génétique moléculaire des virus à ARN-Molecular Genetics of RNA Viruses, Institut Pasteur, Université Paris Diderot-Paris 7, CNRS UMR3569, Département de virologie, Paris, France

marion.declercq@pasteur.fr, sylvie.van-der-werf@pasteur.fr

 

Les virus influenza de type A sont des virus enveloppés présentant un génome segmenté à ARN monocaténaire de polarité négative pouvant infecter un large spectre d’hôtes. Chaque segment d’ARN viral est encapsidé par la nucléoprotéine (NP) et associé au complexe polymérase, formant une ribonucléoprotéine virale (RNPv) qui assure la transcription et la réplication. La nature segmentée de leur génome et la faible fidélité de leur polymérase confèrent à ces virus une grande flexibilité génétique qui contribue à leur adaptation à de nouveaux hôtes. La polymérase virale est un facteur critique de restriction d’hôte et est connue pour interagir avec un réseau particulièrement étendu de protéines cellulaires. Des mutations dans la polymérase virale ont été rapportées comme affectant la fidélité de la réplication. Cependant, aucune étude ne s’est encore intéressée au rôle des protéines cellulaires dans cette dernière. Nous avons sélectionné 98 protéines cellulaires portant des activités exo(ribo)nucléases et, à l’aide d’un test de complémentation protéique, nous avons étudié l’interaction de ces protéines cellulaires avec 7 protéines virales de 2 souches différentes de virus influenza : A/Paris/650/2004 (H1N1 saisonnier) et A/Bretagne/7608/2009 (H1N1pdm09). Nous avons ainsi identifié 21 protéines cellulaires interagissant avec une ou plusieurs protéines virales. Les profils d’interaction obtenus sont très similaires pour les 2 souches testées, indiquant l’existence de potentielles interactions conservées parmi les virus influenza. L’extinction de 12 des 21 protéines par traitement siRNA conduit à une diminution significative de la production virale pour les souches H1N1 saisonnier ou H1N1pdm09, soulignant la pertinence fonctionnelle de ces facteurs. L’effet le plus fort est observé avec l’extinction de l’exoribonucléase cellulaire ERI1, dont l’interaction a été détectée avec plusieurs protéines de la RNPv : PB1, PB2 et NP. L’analyse en cycle unique de réplication virale indique que l’accumulation des ARN messagers viraux et des protéines virales est retardée aux temps précoces de l’infection dans des cellules où l’expression de ERI1 est diminuée. Par ailleurs, nous avons détecté l’interaction entre la protéine ERI1 et les RNPv dans les cellules infectées par des expériences de co-immunoprécipitation. Cette interaction est perdue après traitement des lysats cellulaires avec de la RNAse, indiquant une implication de l’ARN dans l’interaction ERI1/RNPv en contexte infectieux. Enfin, l’analyse des ARNs viraux co-immunoprécipités avec ERI1 a montré un enrichissement d’ARN messagers viraux par rapport aux segments génomiques d’ARN viraux. Ce résultat suggère une interaction préférentielle de ERI1 avec les ARN messagers viraux, sous-tendant potentiellement l’effet de l’extinction de ERI1 sur la transcription virale.

 

P41

Implication potentielle des granules de stress dans la réponse inflammatoire induite par la réplication du virus de la fièvre jaune

Guillaume Beauclair, Daniela Bruni, Felix Streicher, Salomé Bourgeau, Segolene Gracias, Frédéric Tangy, Nolwenn Jouvenet

Unité de génomique virale et vaccination (G2V), Institut Pasteur, CNRS : UMR3569 Paris, France

guillaume.beauclair@pasteur.fr, nolwenn.jouvenet@pasteur.fr

 

L’infection par le virus de la fièvre jaune (YFV), qui appartient au genre des Flavivirus, induit une production excessive de cytokines pro-inflammatoires, telles que IL6 et TNFα. Cela se traduit par des dommages des cellules endothéliales et des fuites vasculaires, entraînant parfois une fièvre hémorragique. Lors de l’analyse de la réponse pro-inflammatoire induite par la réplication d’une souche pathogène (Asibi) ou vaccinale (17D) de YFV dans les cellules humaines de foie nous avons observé que la production et la sécrétion des cytokines IL6 et TNFα sont dépendantes du senseur cytoplasmique RIG-I, qui fait partie de la famille des RLR (récepteurs similaires à RIG-I). La réponse pro-inflammatoire induite par la réplication de la souche Asibi est plus élevée que celle induite par la souche vaccinale. Des analyses d’immunofluorescence montrent que RIG-I se relocalise dans des structures ponctiformes dans le cytoplasme lors de la réplication de la souche Asibi. Cette redistribution de RIG-I se produit plus tardivement dans les cellules infectées par la souche vaccinale. Grâce à des co-marquages, nous avons déterminé que ces structures sont des granules de stress. Ces agrégats cellulaires de 100 à 200 nm servent à protéger les ARN messagers lors de conditions de stress cellulaire. Ils jouent également un rôle régulateur de la réponse immunitaire innée lors d’infections virales, notamment par celle du virus de la grippe. Par des techniques d’extinction génique par petits ARN, nous cherchons à valider l’implication des granules de stress dans l’induction des signaux entraînant la production excessive de cytokines pro-inflammatoires lors de la réplication du virus de la fièvre jaune

 

P42

Role of Hepatitis B core protein on Hepatitis B virus transcription

Barbara Quioc, Eugénie Moulin, Christine Neuveut

Département de virologie, Institut Pasteur, Paris, France

barbara.quioc@pasteur.fr

 

Chronic HBV carriers (CHB) are at high risk of developing hepatocellular carcinoma. Although antiviral treatments of chronic HBV carriers control effciently virus replication and improve liver functions, they cannot lead to a complete viral clearance. This failure is due to the inability of the treatment to eliminate the viral DNA present in the nucleus as a covalently closed circular DNA (cccDNA). cccDNA persists in infected cells through its transcription therefore deciphering the mechanisms involved in cccDNA transcriptional regulation is a crucial step toward the development of new antiviral targets. In addition to its role in capsid formation, HBV core protein (HBc) has been shown to modulate transcription of cellular and HBV genes in vitro. HBc has been shown to be associated with the cccDNA and to modulate its structure, yet the impact of this modification on HBV transcription is not yet fully understood. To better understand the role of HBc in the context of infection, we constructed a virus deficient for HBc expression (HBV HBc-) and used three different mode of purification (ie: sucrose cushion, purification on heparin column and iodixianol gradient) to prepare viral stock. After infection of HepG2-NTCP cells with HBV wt or HBV HBc-, we observed a clear decrease of HBV transcription after infection with HBc-deficient virus independently of the method used to prepare the virus suggesting an important role of HBc on viral transcription. In order to understand the mechanism underlying HBc activity, we isolate HBc nuclear partner using affinity purification. We thus identified proteins involved in DNA regulation and transcription (such as proteins of the FACT complex: SPT16 and SSRP1, Brg1), DNA repair (among them: DNA Topoisomerase 2a, Parp-1, H2AX, USP3, HUWEI), and RNA processing (SF2, RBMX). Our preliminary experiments using siRNA suggest that FACT complex is involved in HBV transcription regulation. Throught ChIP-qPCR experiments we have observed that SPT16h is present on the cccDNA only in HBV WT infection and not during HBV HBc-infection, indicating a role of HBc on the FACT recruitment. We are also using silencing approaches to test the role of HBc partners isolated in our screen on HBV transcription. Taken together our results suggest an important role of HBc protein in HBV transcription and should help to understand the molecular mechanism involved in HBc transcriptional activities.

 

P43

Un crible à haut débit identifie des gènes stimulés par l’interféron capables de moduler la réplication du virus Zika

Sarah Lesage1,2, Maxime Chazal2, Guillaume Beauclair2, Aurianne Lescure3, Elaine Del Nery3, Frédéric Tangy2, Nicolas Manel4, Nolwenn Jouvenet2

1 ED 157-Bio Sorbonne Paris Cité, Sorbonne Université, France2 Unité de génomique virale et vaccination (G2V), Institut Pasteur, CNRS : UMR3569, Paris, France3 Plateforme BioPhenics, Institut Curie, PSL Research University, CNRS, France4 Unité Immunité et Cancer, Institut Curie, PSL Research University, CNRS, France

sarah.lesage@pasteur.fr

 

La réponse immunitaire est rapidement induite suite à une infection virale. Elle est initiée par la reconnaissance des génomes viraux par des protéines cytosoliques appartenant à la famille des « RIG-I-like-receptors (RLR) ». Ces interactions vont déclencher des cascades de signalisation aboutissant à l’expression d’interféron de type I (IFN). Les IFN sécrétés se fixent sur leurs récepteurs et activent la cascade de signalisation Jak/STAT. Ce mécanisme abouti à l’expression de plusieurs centaines de gènes stimulés par l’interféron (ISG), qui ont des propriétés antivirales. Le virus Zika est un virus émergent transmis par les moustiques qui appartient à la famille des Flaviviridae et au genre flavivirus. Il est responsable d’épidémies récentes, dont la dernière recensée en 2016 qui a conduit à la propagation du virus à travers 48 pays d’Amérique. Les patients infectés développent généralement un syndrome grippal. Cependant, l’infection Zika peut être associée à des complications neurologiques et/ou ophtalmiques, incluant des syndromes de Guillain-Barré chez l’adulte et de microcéphalie chez les fœtus et les nouveau-nés. Il a été mis en évidence que le virus Zika est un puissant inducteur d’IFN et que cette cytokine joue un rôle critique dans le contrôle de la réplication et de la pathogenèse virale. Afin de comprendre les mécanismes moléculaires, nous avons criblé une banque de siRNA ciblant indépendamment 388 ISGs par des analyses d’imagerie à haut débit effectuées sur des cellules microgliales traitées aux IFN et infectées par le virus. Nous avons ainsi mis en évidence 14 ISGs capables de moduler la réplication virale. Nous avons validé le rôle de ces candidats par des méthodes de cytométrie de flux. Nous concentrons actuellement nos efforts sur un ISG dont l’expression semble nécessaire à la réplication du virus Zika. Cette protéine semble intervenir dans les phases précoces de l’infection. Elle est également nécessaire à la réplication du virus de la dengue et du virus du Nil occidental. Par contre, son importance est moindre pour la réplication du virus de la rougeole (Paramyxoviridae). Ces résultats laissent supposer un rôle spécifique de cet ISG pour la réplication des Favivirus. Des expériences sont en cours pour déterminer les mécanismes moléculaires impliqués. Ces travaux permettent de mieux comprendre la réponse immunitaire innée induite lors de la réplication du virus Zika et comment celui-ci peut la contourner.

 

P44

Interaction de la protéine nsP1 du virus Chikungunya avec les membranes de l’hôte

Bakhache William1, Mathilde Decourcelle2, Eric Bernard1, Aymeric Neyret1, Patrick Eldin1, Laurence Briant1

1 IRIM Institut de recherche en infectiologie de Montpellier, CNRS : UMR9004, CNRS, Université de Montpellier, France2 FPP, Institut de génomique fonctionnelle, CNRS, Inserm, Université de Montpellier, France

laurence.briant@irim.cnrs.fr

 

Le virus Chikungunya (CHIKV) est un alphavirus transmis par les moustiques qui a récemment réapparu, notamment sur le territoire français de la Réunion avant de se propager mondialement. Il génère des symptômes comprennent une forte fièvre et une éruption pétéchiale, avec un pourcentage important de patients souffrant d’arthralgie chroniques. Aucun vaccin ni traitement antiviral n’existe actuellement. La réplication du CHIKV se réalise dans des structures membranaires particulières appelées sphérules, produites par déformation de la membrane plasmique. Les mécanismes responsables de la formation de ces compartiments sont inconnus. La capacité de la protéine virale nsP1 des alphavirus, à déformer les membranes cellulaires pour créer des structures analogues à des filopodes hors contexte d’infection, désigne cependant cette protéine comme acteur essentiel de la formation des sphérules. Notre étude a donc caractérisé les mécanismes permettant à nsP1 de déformer les membranes cellulaires. Nous avons ainsi cartographié les domaines d’interaction membranaires de nsP1. Nous avons ensuite démontré la capacité de de cette protéine à générer des structures dynamiques enrichies en filaments d’actine, mais dépourvus des marqueurs conventionnels des filopodes. Nous avons finalement développé une stratégie protéomique MS/MS visant à caractériser les interactions nsP1/facteurs cellulaires participant à la capacité de déformation membranaire de cette protéine. L’identification des mécanismes permettant à nsP1 de remodeler les membranes cellulaires constitue une étape clé dans la compréhension de la biogenèse des compartiments de réplication du CHIKV, cible potentielle pour le développement d’antiviraux.

 

P45

L’activation de la voie NF-κB par l’oncoprotéine Tax du virus HTLV-1 modifie l’épissage alternatif en recrutant RelA à la chromatine des exons

Lamya Ben Ameur1, Morgan Thenoz1,2, Guillaume Giraud1, Emmanuel Combe1, Jean-Baptiste Claude1, Hélène Polveche3, Nicolas Fontrodona1, Marine Bastien1,4, Antoine Gessain5, Eric Wattel1, Cyril F. Bourgeois1, Didier Auboeuf1 and Franck Mortreux1

1 Univ Lyon, ENS de Lyon, Univ. Claude-Bernard, CNRS UMR 5239, Inserm U1210, Laboratory of Biology and Modelling of the Cell, Lyon, France2 Faculty of Medicine and Health Sciences Department of Pediatrics and medical genetics, Gent, Belgium3 CECS, I-Stem, Corbeil-Essonnes, France4 School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, Liverpool John Moores University, Liverpool, United Kingdom5 Unité d’épidémiologie et physiopathologie des virus oncogènes, Institut Pasteur, Paris, France

lamya.benameur@ens-lyon.fr

 

Le rétrovirus HTLV-1 est l’agent étiologique de la leucémie T de l’adulte et de nombreuses maladies inflammatoires. La réplication du virus repose sur l’expansion clonale des cellules infectées à travers des modifications transcriptionnelles et post-transcriptionnelles qui participent à la pathogenèse. L’oncoprotéine TAX, et ses capacités à activer de façon constitutive la voie NF-κB, ont largement été décrites dans les mécanismes de dérégulations transcriptionnelles, mais leurs impacts sur l’épissage alternatif restent inexplorés. Les analyses récentes de la distribution chromatinienne de la sous-unité RelA de NF-κB indiquent que ce facteur est majoritairement retrouvé dans des régions intragéniques (exons et introns). Dans ce contexte, nos travaux révèlent que l’activation de la voie NF-κB par TAX induit le recrutement de RelA à proximité d’exons alternatifs et régule leur épissage. Les analyses intégratives des profils d’épissage et du remodelage de la chromatine, combinées à des essais de ciblage expérimental (TALE) de la chromatine, démontrent que la fixation intragénique de RelA permet de recruter le régulateur d’épissage DDX17 et de réguler au niveau de l’ARN l’inclusion de l’exon ciblé de façon dépendante de l’activité hélicase du facteur DDX17. Cet axe NF-κB/DDX17 est responsable de la majorité des modifications d’épissage alternatif induites par TAX et affecte essentiellement des gènes engagés dans des processus oncogènes. Ces données démontrent une implication physique de NF-κB dans la régulation de l’épissage alternatif, et revisite nos connaissances sur la pathogenèse liée à HTLV-1 et d’autres pathologies liées à l’activation chronique de la voie NF-κB.

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