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Fibrinolyse, nouveaux concepts : vésicules et cross-talk fibrinolytiques


Hématologie. Volume 17, Numéro 6, 423-34, Novembre-Décembre 2011, Revue Picto_transfusion

DOI : 10.1684/hma.2011.0656

Résumé   Summary  

Auteur(s) : Laurent Plawinski, Tiphaine Dejouvencel, Eduardo Anglés-Cano, UMR6232-CNRS, CiNaps, Centre d’imagerie et neurosciences appliquées à la pathologie, Inserm U919 Serine proteases in neurovascular physiopathology, GIP Cyceron, bd Henri Becquerel, 14074-cdx, Caen, rance.

Résumé : La phase lytique d’un caillot hémostatique résulte d’un nombre restreint de réactions enzymatiques localisées à la surface de la fibrine ou des membranes cellulaires. Un défaut fonctionnel, ou une insuffisance de cette activité fibrinolytique peut conduire à la consolidation d’un thrombus dont les conséquences ischémiques au niveau coronaire ou cérébral sont sévères, voire fatales. Nonobstant ce constat, l’évaluation du fonctionnement de ce système demeure un véritable défi en hémostase, et ce malgré une progression réelle dans la connaissance individuelle des molécules agissant autour du système plasminogène/plasmine : activateurs, inhibiteurs, récepteurs et leurs régulateurs. La nécessité d’un assemblage moléculaire restreint la formation de plasmine à une surface (fibrine, membrane) et limite son activité à la lyse du caillot. L’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) et la plasmine active libérés dans le sang suite à la lyse de la surface d’attache sont immédiatement neutralisées par des inhibiteurs ( plasminogen activator inhibitor 1 [PAI-1], α 2-antiplasmine). Il est donc difficile, voire impossible, de détecter ce phénomène fibrinolytique à l’aide des méthodes actuellement utilisées. Si le caillot de fibrine n’est pas accessible pour déterminer le degré ou l’intensité de la réponse fibrinolytique, il a été récemment démontré qu’il existe dans la circulation des vecteurs pouvant diffuser cette information. En effet, la récente découverte de l’activité fibrinolytique des microvésicules membranaires suggère que ces dernières seraient un indicateur de la réponse fibrinolytique face à un processus inflammatoire ou prothrombotique. Ces microvésicules fibrinolytiques, issues de cellules parentales productrices d’activateurs du plasminogène, porteraient à leur surface la molécule synthétisée par la cellule maternelle (cellules endothéliales : tPA ; leucocytes : urokinase [uPA]). Ces molécules, localisées à la membrane cellulaire sur des sites spécifiques, conservent leur capacité d’activation du plasminogène et sont donc capables de générer de la plasmine à la surface des microvésicules. Plus intéressant encore, il a été également découvert que ces microvésicules fibrinolytiques interviennent dans un nouveau mécanisme de formation de plasmine au cours duquel la plasmine formée est le résultat de l’interaction entre deux surfaces distinctes : il s’agit donc d’un cross-talk fibrinolytique. Une des surfaces réactionnelles porte le plasminogène, c’est le cas de la fibrine, de la membrane plaquettaire ou encore de la matrice extracellulaire. La deuxième surface porte l’activateur du plasminogène intervenant dans ce cross-talk. Il s’agit de l’uPA retrouvée sur la membrane des leucocytes ou des microvésicules. Ces nouveaux acteurs et concepts d’activation du plasminogène ouvrent de nouvelles voies dans la compréhension de la fibrinolyse et de leur étude en pratique clinique.

Mots-clés : fibrinolyse, microvésicule, plasminogène, activateurs du plasminogène, cross-talk fibrinolytique

Illustrations

ARTICLE

hma.2011.0656

Auteur(s) : Laurent Plawinski, Tiphaine Dejouvencel, Eduardo Anglés-Cano Eduardo.Angles-Cano@inserm.fr

UMR6232-CNRS, CiNaps, Centre d’imagerie et neurosciences appliquées à la pathologie, Inserm U919 Serine proteases in neurovascular physiopathology, GIP Cyceron, bd Henri Becquerel, 14074-cdx, Caen, rance

Tirés à part : E. Anglés-Cano

Introduction

L’activité fibrinolytique du compartiment intravasculaire est un mécanisme majeur de défense contre la thrombose. Elle permet la lyse spécifique de l’excédent de fibrine formée après une lésion vasculaire afin de restaurer l’intégrité vasculaire et le flux sanguin. Son efficacité repose sur le fonctionnement du réseau de fibrine, à la fois comme :

  • -. support du caillot hémostatique,
  • -. surface d’assemblage d’un complexe ternaire formé avec le plasminogène et son activateur tissulaire (tPA),
  • -. surface d’activation du plasminogène,
  • -. substrat de la plasmine engendrée par ce complexe [1].


Le tPA est synthétisé par l’endothélium [2]. Libéré au contact du caillot, en réponse à la stimulation par la thrombine, il se lie à la fibrine mais peut également engendrer de la plasmine sur la surface endothéliale [3]. D’autres composants cellulaires intervenant dans la formation du thrombus participent également à sa dissolution. Ainsi, les leucocytes qui forment des agrégats avec les plaquettes libèrent un deuxième type d’activateur du plasminogène : l’urokinase (uPA), qui peut, sous certaines conditions, activer le plasminogène lié à la fibrine [4]. Cependant, l’activation du plasminogène par l’uPA se fait principalement au niveau de la membrane cellulaire [5]. Si la membrane des cellules endothéliales et des leucocytes est une surface d’assemblage pour la production de plasmine, les plaquettes jouent un rôle profibrinolytique en apportant du plasminogène membranaire au sein du thrombus [6]. Les plaquettes peuvent aussi développer une activité régulatrice en libérant du PAI-1, l’inhibiteur majeur des activateurs du plasminogène [7].

Récemment, nous avons montré qu’au-delà de cette participation cellulaire, un mécanisme similaire d’activation du plasminogène était présent à la membrane de microvésicules issues de la lignée HMEC-1 (pour human microvascular endothelial cells) [8]. Au demeurant, des études plus récentes nous ont permis de montrer l’existence d’un nouveau mécanisme de formation de plasmine, le cross-talk fibrinolytique, requérant une première surface portant le plasminogène et une deuxième surface portant l’activateur uPA [9]. La formation de plasmine sur la fibrine ou sur les membranes cellulaires est donc fondée sur la relation étroite existant entre la conformation moléculaire du plasminogène adsorbé sur une surface et sa reconnaissance par les activateurs immobilisés sur la même surface, ou sur une surface mobile.

Ces deux nouveaux mécanismes, l’activité fibrinolytique de microvésicules membranaires et le cross-talk fibrinolytique, constituent une nouvelle voie d’approche de la fibrinolyse. Ils seront analysés dans cette revue après avoir défini le rôle majeur que jouent les changements de conformation du plasminogène dans le mécanisme de production de plasmine.

Structure du plasminogène et changements de conformation

Les changements de conformation du plasminogène constituent un mécanisme clé de la fibrinolyse [10]. Cette glycoprotéine de 92 kDa est composée de 791 acides aminés (Glu1-Asn791, Glu-plasminogène) qui sont regroupés en cinq modules, appelés kringles, et une région catalytique ; ces éléments modulaires sont précédés d’un peptide aminoterminal (Glu1-Lys77) (figure 1A, tableau 1). Les kringles 1 et 4 contiennent des sites de liaison aux résidus lysine (LBS pour lysine-binding site) de la fibrine qui permettent une interaction et une liaison efficaces du plasminogène. Le kringle 5 contient un LBS modifié dont l’affinité pour les résidus lysine du peptide aminoterminal favorise l’adoption d’une conformation fermée en spirale (figure 1B) [11]. Cette forme fermée du plasminogène prédomine dans la circulation. La libération du peptide aminoterminal après son clivage par la plasmine caractérise une forme tronquée (Lys-plasminogène) ayant une conformation ouverte dépliée. L’apparition d’une forme ouverte semblable à celle-ci se produit quand le LBS est occupé par les analogues de la lysine, comme l’acide epsilon aminocaproïque (EACA) ou l’acide tranexamique (TXA) [12]. En effet, l’invalidation de la fonction LBS par ces molécules empêche l’interaction entre le kringle 5 et le peptide aminoterminal. Cette invalidation prévient également la liaison du plasminogène à la fibrine, et de ce fait son activation par le tPA. De façon surprenante, il a été constaté que cette forme ouverte (figure 1B) induite par des faibles doses d’EACA est reconnue et transformée en plasmine par l’uPA. Ces transitions du plasminogène, entre forme ouverte (obtenue par clivage protéolytique ou par induction pharmacologique) et configuration fermée, ont été mises en évidence par microscopie électronique [13], par la mesure de la fluorescence intrinsèque [14] et par la réactivité différentielle d’anticorps monoclonaux spécifique de l’une ou de l’autre forme [15]. Par homologie, il est couramment accepté que l’interaction directe du plasminogène natif (Glu-plasminogène) avec les résidus lysine de la fibrine ou des glycoprotéines membranaires conduit à une transition de la forme fermée vers la forme ouverte. Cette forme est efficacement activable par le tPA lié à la fibrine ou par l’uPA lié à son récepteur. En résumé, la liaison du plasminogène à la fibrine ou aux membranes cellulaires et sa transition en forme ouverte sont des conditions nécessaires à sa transformation en plasmine par des activateurs du plasminogène localisés à proximité

Tableau 1 Principaux composants du système d’activation du plasminogène.

Plasminogène Plasmine suPAR uPA tPA
Concentration plasmatique 0.12-0,18 mg/mL 0 < 1 ng/mL 3,6 ± 0,9 ng/mL 7,5 ± 2,5 ng/mL
Molarité plasmatique 1,5 à 2 μm 0 < 1,5 pM 50 à 85 pM 70 à 140 pM
Poids moléculaire 92 kDa 84 kDa 65 kDa 54 kDa 70 kDa
Site de clivage Arg561-Val562 - - Lys158-Ile154 Arg275-Ile274
Domaines P-K1-5-SP K1-5-SP D1-3 EGF-K1-SP F-EGF-K1-2-SP
Séquence polypeptidique
1 chaîne 2 chaînes 1 chaîne 1 chaîne → 2 chaînes 1 chaîne → 2 chaînes
Activité enzymatique - ++++ - +/- → ++++ ++++ → ++++

suPAR : uPAR soluble ; P : peptide N-terminal ; K : domaine kringle ; SP : domaine sérine protéase ; D : LU (Ly-6 uPAR) domaine ; EGF : domaine EGF ; F : domaine finger

Structure des activateurs du plasminogène

Le tPA et l’uPA possèdent, comme le plasminogène, une structure en mosaïque constituée par plusieurs domaines [16]. Les caractéristiques de ces molécules sont signalées dans le tableau 1. La principale fonction de la région catalytique des activateurs du plasminogène est la transformation du plasminogène en plasmine par clivage de la liaison peptidique Arg561-Val562. Le tPA est sécrété par les cellules endothéliales sous forme monocaténaire, laquelle a un très faible index de zymogénicité [2]. Ceci indique, fait exceptionnel, que la molécule monocaténaire est aussi active que la forme bicaténaire produite après clivage de la liaison Arg275-Ile276 par la plasmine. Cependant, l’adsorption de ces deux formes à la surface de la fibrine via une interaction entre leur module finger et le domaine D de la fibrine est une condition sine qua non pour leur activité [1, 17]. Dans certains tissus comme le cerveau, le kringle 2 du tPA interagit avec la sous-unité R1 du récepteur au NMDA. Cette interaction serait à l’origine de la neurocytotoxicité du tPA décrite dans un modèle murin [18]. On ne connaît pas de récepteur spécifique au tPA.

L’uPA libérée par les leucocytes est une sérine protéase classique, sécrétée sous forme de zymogène monocaténaire (sc-uPA), qui doit être activée afin de manifester son activité protéase intégrale sous forme double chaîne (tc-uPA) [5]. Ce clivage, au niveau de la liaison peptidique Lys158-Ile, est principalement réalisé par la plasmine. La thrombine, en revanche, inactive le sc-uPA en le clivant en deux résidus, en amont du site de clivage par la plasmine [19]. En position NH2-terminale de l’uPA, se trouve le module EGF, lequel contient une séquence d’interaction permettant sa liaison au récepteur uPAR, lui-même ancré à la membrane via le groupement glycosylphosphatidylinositol, qui possède une large mobilité transmembranaire. Au-delà de cette fonction, l’uPAR active, avec ses corécepteurs transmembranaires, plusieurs voies de signalisation intracellulaire intervenant dans la migration et la survie cellulaire [20].

La plasmine est formée au niveau d’une surface

Dès la formation d’un caillot de fibrine, le plasminogène et le tPA se lient à sa surface et acquièrent la conformation moléculaire nécessaire à la composition d’un complexe enzyme/substrat aboutissant à la production de plasmine in situ [17]. La plasmine formée reste liée à la fibrine par l’intermédiaire de son site LBS, ce qui l’engage dans une fonction exclusivement fibrinolytique tout en la protégeant de l’α2-antiplasmine. En effet, la formation d’un complexe entre la région catalytique de la plasmine et le site réactif de l’α2-antiplasmine requiert une interaction avec le site LBS du kringle 1 de la plasmine. Tant que la plasmine reste adsorbée à la fibrine, elle ne peut pas être inhibée [21]. Ainsi, à cette réaction de surface, génératrice de plasmine active, on peut opposer la réaction d’inhibition par l’α2-antiplasmine qui se déroule en phase soluble circulante. La lyse d’un caillot est donc le résultat d’une réaction de surface de haute spécificité, depuis la formation initiale de la plasmine jusqu’à la phase d’accélération et d’amplification de la fibrinolyse.

Surfaces d’assemblage et jeux d’interactions

Le plasminogène est fixé aux résidus lysine de la fibrine par l’intermédiaire des LBS des kringles 1 et 4. Le tPA, bien que possédant un module kringle 2 avec un LBS actif, est adsorbé à la fibrine par l’intermédiaire de son domaine finger, dont l’affinité pour la région D est 1 000 fois supérieure à celle du kringle 2 pour le résidu lysine. C’est précisément ce phénomène d’interaction avec la fibrine qui permet l’expression de l’activité du tPA. En absence de fibrine, le tPA ne possède qu’une très faible capacité à activer le plasminogène. Les changements de conformation du plasminogène et du tPA après adsorption sur leurs sites, et leur proximité sur la surface de fibrine, permettent la composition d’un complexe enzyme/substrat aboutissant à la production de plasmine et in fine à la lyse du polymère de fibrine. Dans la paroi vasculaire, la production de plasmine à la surface de macromolécules de la matrice extracellulaire suit le même principe : le plasminogène est immobilisé, via ses domaines kringle, sur la fibronectine ou la laminine où il est activé par l’uPA libéré par les cellules inflammatoires [5].

Sur les membranes cellulaires, l’assemblage moléculaire se fait sur des sites récepteurs pour le plasminogène (α-énolase [22], complexe tétramérique annexine A2-S100A10 [23], histone H2B [24] ou le Plg-RKT [25]), qui est activé par l’uPA immobilisé sur son récepteur uPAR. Sur certaines cellules, comme la cellule endothéliale, la cellule musculaire lisse ou encore les neurones, c’est le tPA fixé à certaines protéines transmembranaires qui transforme le plasminogène en plasmine [26, 27].

Accélération et amplification de la fibrinolyse

La plasmine formée in situ peut amplifier l’activation du plasminogène en générant des nouveaux sites de liaison pour le plasminogène [28]. En effet, les premières molécules de plasmine produites à la surface de la fibrine hydrolysent des ponts lysyl et font apparaître des résidus lysine en position carboxyterminale (Lys-C), qui représentent des nouveaux sites de liaison [29]. Le plasminogène lié aux sites Lys-C adopte une conformation ouverte permettant sa reconnaissance et son activation par le tPA adsorbé à proximité, ou par l’uPA libéré par les leucocytes. L’uPA ne se lie pas à la fibrine, mais reconnaît spécifiquement le plasminogène lié à ces sites [4]. La liaison accrue de plasminogène multiplie le nombre de molécules de plasmine formées par les activateurs et amplifie le processus de dégradation de la fibrine et la lyse du caillot. C’est la multiplication du nombre de sites de liaison du plasminogène et les changements de conformation de celui-ci qui constituent les facteurs majeurs d’amplification de la fibrinolyse. La transformation de l’uPA monocaténaire en uPA bicaténaire active constitue un deuxième facteur d’accélération dans la formation de plasmine [30].

Régulation

Le système d’activation du plasminogène est finement régulé (1) par des inhibiteurs de sérine protéases (serpines), et (2) par compétition ou (3) élimination des sites Lys-C de liaison du plasminogène. La régulation par les serpines intervient directement au niveau de la plasmine (principalement l’α2-antiplasmine) ou des activateurs (principalement le PAI-1). En cas d’excès de tPA ou de plasmine, des inhibiteurs plasmatiques ayant une spécificité moins restreinte peuvent également agir (l’α2-macroglobuline ou l’inhibiteur de la C1 estérase) [31]. Dans le système nerveux central, des inhibiteurs spécifiques des activateurs du plasminogène comme la neuroserpine et la protéase nexine 1 (PN-1) ont été identifiés [32]. La PN-1 inhibe également la plasmine et la thrombine ; des données récentes suggèrent que la PN-1 stockée dans les plaquettes pourrait jouer un rôle important dans le système vasculaire [33]. PAI-2 est particulièrement produit par les syncytiotrophoblastes et les monocytes. Son rôle physiologique comme inhibiteur de l’uPA et du tPA reste encore une énigme ; il semblerait surtout avoir de fonctions intracellulaires [34]. Il est à noter que dans tous les cas l’inhibition des activateurs ou de la plasmine se fait dans la phase circulante, et que de manière générale la plupart des acteurs du système d’activation du plasminogène liés à leur récepteur se trouvent partiellement protégés de leurs inhibiteurs.

La lipoprotéine(a), notée Lp(a), peut exercer un effet antifibrinolytique, et de nombreux travaux attestent de la pertinence clinique de ce mécanisme en pathologie cardio-vasculaire [35]. Le mécanisme antifibrinolytique de cette lipoprotéine peut s’expliquer par sa structure particulière : un composant semblable aux lipoprotéines de faible densité (LDL) et une glycoprotéine, l’apolipoprotéine(a), ou Apo(a), structuralement proche du plasminogène mais sans activité enzymatique [36]. L’Apo(a) possède une copie non activable de la région catalytique, une copie du kringle 5 et un nombre variable de copies du kringle 4 ayant une forte affinité pour la fibrine. Ainsi, une compétition entre le plasminogène et l’Apo(a) pour la liaison à la fibrine limite la quantité de plasminogène lié, diminue la formation de plasmine et inhibe la fibrinolyse [37].

Enfin, le zymogène TAFI (pour thrombin-activated fibrinolysis inhibitor ; procarboxypeptidase U) peut être activé par la thrombine ou par la plasmine en TAFIa. Cette exopeptidase clive les résidus Lys-C de protéines, limitant ainsi la liaison du plasminogène aux surfaces d’activation [38]. Son activité in vitro est bien établie [39] mais TAFIa ne semble pas jouer un rôle physiologique dans la fibrinolyse in vivo (modèle murin) [40]. Les nombreuses études, témoins du vif intérêt clinique pour ce régulateur de la fibrinolyse, n’ont pour l’instant aboutit qu’à des résultats associationnels [41].

À l’opposé de ce mécanisme de régulation de récepteurs du plasminogène par le TAFIa, se trouve l’utilisation d’inhibiteurs de la liaison du plasminogène qui bloquent les sites LBS. Il s’agit des analogues de la lysine comme l’EACA et le TXA mentionnés plus haut. Ces composés interagissent avec le LBS des kringles et bloquent ainsi de façon compétitive la liaison du plasminogène à la fibrine ou aux cellules. Leur utilisation en clinique comme antifibrinolytiques et antihémorragiques a été récemment évoquée dans plusieurs situations clinicochirurgicales et dans une large étude multicentrique [42, 43].

Fonctions du système d’activation du plasminogène

On distingue les fonctions du système d’activation du plasminogène (fibrinolyse et protéolyse péricellulaire) selon la nature de la surface sur laquelle cette réaction a lieu.

La fibrinolyse

Le clivage par la plasmine des ponts lysyl et arginyl de la fibrine conduit à sa dissolution et à la libération de produits de dégradation. Les fragments D-dimères retrouvés dans la circulation témoignent à la fois de la formation d’un caillot et de sa dissolution par la plasmine [1]. Une fibrinolyse efficace permet la recanalisation du vaisseau obstrué. L’utilisation d’agents thrombolytiques pour le traitement des accidents ischémiques cérébraux ou coronaires est calquée sur ce modèle physiologique.

La protéolyse péricellulaire

Elle a lieu lorsque la formation de plasmine se fait à la surface des membranes cellulaires ou de la matrice extracellulaire [26, 27, 44]. Au niveau cellulaire, la plasmine active les récepteurs transmembranaires (PAR, protease-activated receptor 1 et 4) et induit une signalisation intracellulaire [45] et une réponse phénotypique caractérisée initialement par une vésiculation membranaire [46]. Les microvésicules générées portent les activateurs du plasminogène de la cellule parentale [46]. La plasmine formée in situ induit, directement ou via l’activation de prométalloprotéases (MMP-3, 9 et 12), la protéolyse des protéines matricielles : fibronectine, laminine ou vitronectine [47]. Cette protéolyse entraîne des modifications de l’adhérence cellulaire conduisant à différents phénomènes physiologiques (remodelage cellulaire, angiogenèse, migration cellulaire) [39]. La plasmine formée en excès ou par manque de régulateurs (inhibiteurs) produit une dégradation in extenso de la matrice extracellulaire. Ce processus peut entraîner la perte d’adhésion cellulaire et la mort par apoptose, comme observé dans certaines situations pathologiques (mort cellulaire, fragilisation/rupture de la plaque d’athérome, anévrisme) [48-50]. Ce processus d’apoptose induit par le détachement cellulaire peut être déjoué par des inhibiteurs comme le PAI-1 et la PN1 [49, 51, 52]. Il est important de différencier ces étapes d’activation cellulaire et d’apoptose afin d’évaluer les effets des médiateurs, inhibiteurs et agents thérapeutiques.

Fibrinolyse, cas particuliers : les plaquettes, les microvésicules

La voie classique d’activation du plasminogène présentée précédemment requiert le coassemblage du plasminogène et de son activateur (uPA ou tPA) sur la même surface afin d’enclencher le processus fibrinolytique ou protéolytique. Des surfaces mobiles comme celles des plaquettes et des microvésicules requièrent des conditions particulières pour la production de plasmine.

Les mécanismes de liaison du plasminogène aux plaquettes

Comme d’autres membranes cellulaires, les plaquettes peuvent adsorber le plasminogène à leur surface par des interactions dépendantes de résidus Lys-C dont le nombre est multiplié par 5 sur les plaquettes activées (liaison spécifique, saturable et réversible) [6]. Cette liaison se fait par l’intermédiaire de la GPIIb/IIIa (αIIb β3) et du fibrinogène (fibrine) des plaquettes activées par la thrombine [53, 54]. Ce plasminogène adopte une conformation ouverte plus facilement activable par l’uPA. Les plaquettes pourraient ainsi contribuer à localiser et augmenter la concentration du plasminogène – et potentiellement de la plasmine – au sein du caillot, malgré leur activité procoagulante.

Les microvésicules et le système d’activation du plasminogène

Les microvésicules sont des vésicules membranaires émises par les cellules activées ou en apoptose [55]. De taille comprise entre 0,1 et 1 μm, portant de la phosphatidylsérine à leur surface et ne contenant pas de fragments d’ADN, les microvésicules ne doivent pas être confondues avec les corps apoptotiques ou les exosomes (figure 2) [56]. La formation et la libération des microvésicules se font suite à un stimulus extracellulaire (physique, chimique ou biologique) qui entraîne une entrée massive de calcium dans la cellule. L’augmentation de calcium intracellulaire modifie l’activité des transporteurs des phospholipides et stimule les calpaïnes. Il en résulte une externalisation de la phosphatidylsérine, des modifications de l’intégrité du cytosquelette et une contraction cellulaire conduisant au bourgeonnement des microvésicules à partir de la membrane cellulaire [57]. De nombreuses pathologies telles que les maladies cardio-vasculaires, le diabète, le cancer ou les maladies inflammatoires ont été associées avec une augmentation du nombre de microvésicules [58, 59].

Ces microvésicules portent à leur surface et dans leur cytoplasme des protéines de la cellule parentale. Outre les clusters de différenciation (CD, spécifiques du type cellulaire), différentes biomolécules, dont le facteur tissulaire et des cytokines inflammatoires, peuvent être vectorisées par les microvésicules [60, 61]. En 2007, il a été montré que des microvésicules produites par des cultures cellulaires issues de la lignée HMEC-1 (lignée singularisée par la production d’uPA et de son récepteur uPAR), stimulées au TNFα, étaient capables de générer de la plasmine [8]. En effet, ce type de microvésicules portent à leur surface des complexes uPA/uPAR et des sites uPAR disponibles pouvant fixer de l’uPA exogène (figure 2). La formation de plasmine à cette « nouvelle » surface mobile est impliquée de façon dose-dépendante dans la réponse angiogénique des progéniteurs endothéliaux in vitro.

La liaison du plasminogène à la surface des microvésicules implique également les résidus Lys-C. Un anticorps sélectif dirigé contre l’α-énolase a permis de confirmer que ce récepteur majoritaire du plasminogène à la surface cellulaire était impliqué dans la liaison du plasminogène à la surface des microvésicules endothéliales. Récemment il a été démontré qu’une protéine intracellulaire, l’histone H2B, était impliquée dans la liaison du plasminogène à la surface des microparticules [24]. L’histone H2B serait localisée au niveau de la membrane cellulaire via une interaction avec la phosphatidylsérine exposée dans le feuillet externe de la membrane [62]. Ainsi, ce phospholipide procoagulant permettrait également d’accroître le nombre des sites de liaison du plasminogène et de favoriser la fibrinolyse.

Nous avons confirmé la présence de microparticules fibrinolytiques dans la circulation (travaux en cours). Ces microparticules présentent des caractéristiques fonctionnelles semblables à celles précédemment décrites et portent l’activateur du plasminogène synthétisé par la cellule parentale (leucocytes : uPA, cellule endothéliale : tPA). Ces résultats soulignent la signification physiopathologique que ce type de microparticules pourraient avoir in vivo.

Nouvelle voie d’activation du plasminogène : le cross-talk fibrinolytique

Le plasminogène adsorbé sur la fibrine ou sur les membranes cellulaires adopte la conformation moléculaire ouverte, dont le site de clivage est facilement accessible aux activateurs situés à proximité sur la même surface. C’est le cas de la formation du complexe ternaire plasminogène-fibrine-tPA, ou de l’assemblage plasminogène-membrane-uPAR/uPA. Il a cependant été constaté que l’uPA en solution était un activateur efficace du Lys-plasminogène et du Glu-plasminogène complexé à l’EACA, alors que celui-ci est un inhibiteur de la fibrinolyse par le tPA. Ces observations nous ont permis d’émettre l’hypothèse de l’existence d’une interaction mettant en jeu deux surfaces portant distinctement l’activateur ou le plasminogène [9]. Il a ainsi été possible de montrer que le plasminogène porté par les plaquettes peut être reconnu par de microvésicules ou des cellules portant le complexe uPA/uPAR. Une réaction semblable a permis de montrer que le plasminogène lié à la fibrine ou à des protéines matricielles pouvait être activé en plasmine par l’uPA/uPAR porté par des microvésicules d’origine leucocytaire. Ce nouveau mécanisme d’activation du plasminogène, appelé cross-talk fibrinolytique (figure 3), est caractéristique de l’uPA et n’est pas donc pas sensible aux microvésicules portant du tPA. Cette spécificité pourrait s’expliquer par des arrangements structuraux imposés par les différents domaines du tPA (finger-EGF-K1-K2-SP) et de l’uPA (EGF-K1-SP) (tableau 1). Cette réaction d’activation possède donc toutes les caractéristiques d’une réaction spécifique et saturante dont l’efficacité dépend du nombre de microvésicules actives agissant sur les plaquettes ou la fibrine. Cette nouvelle voie d’activation pourrait avoir un rôle physiologiquement pertinent. En effet, l’activation du plasminogène à la surface des plaquettes par de l’uPA microvésiculaire génère deux fois plus de plasmine que l’uPA en solution. Des études récentes réalisées par des laboratoires indépendants ont confirmé notre hypothèse et nos résultats [63-65]. Deux études ont rapporté l’activation du plasminogène lié à la fibrine par l’uPA porté par les leucocytes [63, 65], quand une troisième étude s’est focalisée sur l’activation de sc-uPA par la plasmine formée à la surface de plaquettes [64].

Conséquences du cross-talk fibrinolytique

Ce nouveau mécanisme d’activation du plasminogène en plasmine à la surface des plaquettes et des microvésicules par l’activateur de type uPA pose la question de l’implication de ce processus en différentes situations physiopathologiques.

La fibrinolyse

La liaison du plasminogène aux plaquettes au cours de la formation d’un caillot, et la présence de microvésicules portant de l’uPA, conduiraient à la formation de plasmine et permettraient une recanalisation ad hoc du vaisseau. Est-ce ce phénomène qui explique la recanalisation spontanée observée chez 10 à 15 % des patients ayant eu une occlusion aiguë des artères coronaires ? A contrario, est-ce un défaut de microvésicules fibrinolytiques qui aboutirait à l’obstruction ischémique ? Une étude récente suggère que l’activation du plasminogène lié à la fibrine par des leucocytes portant de l’uPA joue un rôle dans la fibrinolyse endogène [65]. Au niveau de la fibrine, la transformation du plasminogène en plasmine par des leucocytes ou ses microvésicules produirait un effet antiadhésif pour les leucocytes et les plaquettes sur le caillot [63].

La migration cellulaire et l’angiogenèse

Outre son profil fibrinolytique, le système d’activation du plasminogène par le système uPA/uPAR est impliqué dans le remodelage tissulaire en activant des proMMP et joue un rôle critique dans la migration cellulaire et l’angiogenèse [20]. En effet, la régénération vasculaire implique à la fois l’angiogenèse et la vasculogenèse dépendant des progéniteurs endothéliaux. La capacité des microvésicules endothéliales à être des supports pour la génération de plasmine influence et module les processus de réparation des cellules endothéliales progénitrices. Une faible quantité de microvésicules porteuses du système d’activation du plasminogène favorise la migration cellulaire et augmente l’angiogenèse, tandis qu’à de fortes concentrations, l’excès de plasmine conduit à la dégradation de la matrice, à l’altération de l’adhérence de la cellule à la matrice et à son apoptose [8, 39].

La dissémination des cellules cancéreuses

La dissémination des cellules cancéreuses est une conséquence de la dégradation de la matrice et de la perte d’adhérence cellulaire. De hautes quantités d’uPA/uPAR ont été associées avec des cancers métastasés avancés [66]. Il est intéressant de noter que le mécanisme de cross-talk décrit n’est possible qu’en présence d’un activateur de type uPA. Cet activateur est impliqué dans la progression tumorale et a été retrouvé sur les microvésicules émises par de cellules cancéreuses. En outre, des microvésicules directement relarguées par des plaquettes peuvent promouvoir les métastases et favoriser l’angiogenèse [67].

Conclusion et applications potentielles

Grâce aux travaux sur l’origine, la structure et la fonction des molécules du système d’activation du plasminogène, son rôle dans le maintien de l’hémostase et la prévention des thromboses est maintenant bien établi. Cependant, la détection ou la mise en évidence d’une dysfonction de ce système restent des défis majeurs pour l’hématologie et la biologie vasculaire. La concentration circulante des activateurs du plasminogène est extrêmement faible, par rapport aux concentrations actives requises sur le site de la lésion dans la microcirculation. D’ailleurs, les activateurs circulent sous la forme d’un complexe inactif avec le PAI-1, et seules les formes localisées sur la membrane cellulaire (uPA, tPA) ou sur la fibrine (tPA) sont actives. Il est donc impossible de quantifier une insuffisance de tPA/uPA pouvant être à l’origine d’un défaut fibrinolytique, d’autant plus que toutes les mesures se font en milieu plasmatique et font abstraction de l’apport cellulaire d’activateurs du plasminogène. La découverte récente de microvésicules cellulaires fibrinolytiques et celle d’un nouveau mécanisme de formation de plasmine, le cross-talk fibrinolytique, ouvrent de nouvelles perspectives [8, 9]. Ces microvésicules agiraient au sein même du caillot, ce qui permettrait d’expliquer l’absence de fibrinolyse systémique comme démontré in vivo dans le modèle de plaquettes fibrinolytiques murines [68]. Nous proposons que l’activité fibrinolytique de ces microvésicules compense localement l’activité ubiquitaire procoagulante de l’ensemble des microvésicules. Ainsi, l’équilibre fonctionnel entre ces deux types de microvésicules se traduirait par une réponse hémostatique physiologique, alors que le manque de microparticules fibrinolytiques pourrait favoriser la constitution d’un thrombus. L’existence d’un syndrome hémorragique (platelet Quebec disorder) provoqué par des plaquettes profibrinolytiques ayant une expression anormale d’uPA est compatible avec cette hypothèse [69]. À l’aide d’un modèle murin de cette maladie autosomique dominante, il a été possible de démontrer que ces animaux sont résistants à la thrombose artérielle, et que la transfusion de ces plaquettes prévient la formation de thrombi artériels occlusifs chez la souris contrôle [69].

Dans ce contexte, la présence de plasminogène et de son activateur, l’uPA, sur des surfaces mobiles (plaquettes, microparticules), et l’identification du cross-talk fibrinolytique, suggèrent la possibilité d’utiliser ces supports comme des vecteurs de fibrinolyse et de protéolyse péricellulaire afin d’induire localement les effets de la plasmine.

Les microvésicules, initialement apparentées à des débris cellulaires, semblent capables d’influencer un large panel de processus physiologiques et pathologiques. L’existence des processus physiopathologiques dans lesquels les microvésicules seraient impliquées (purpura thrombotique thrombocytopénique, coagulation intravasculaire disséminée, atteintes vasculaires, processus inflammatoires) permet de proposer leur utilisation (a) comme des outils thérapeutiques et des médiateurs pour un large nombre de maladies, et (b) pour la réparation et le génie tissulaire.

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