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Les outils d’exploration de l’activité des lymphocytes T CD8+


Virologie. Volume 4, Numéro 6, 463-71, Novembre - Décembre 2000, Revues


Résumé   Summary  

Auteur(s) : Y. Rivière, F. Buseyne, D. Scott-Algara, Institut Pasteur, 75724 Paris Cedex 15.

Résumé : Il existe de nombreux exemples d’infections par des micro-organismes à développement intracellulaire chez l’animal et chez l’homme pour lesquels l’activité des lymphocytes T cytotoxiques spécifiques de l’agent infectieux peut être bénéfique pour l’hôte infecté ou au contraire contribuer à la pathogenèse de l’infection. C’est pour ces raisons que la détection de la présence d’effecteurs cellulaires cytotoxiques a fait l’objet de nombreux travaux depuis trois décennies. Dans cet article sont présentées les différentes techniques utilisées aujourd’hui pour évaluer les activités des lymphocytes T CD8+ spécifiques. Les techniques initialement développées étaient des techniques de cytotoxicité, puis des techniques alternatives immuno-enzymatiques (Elispot) et de cytométrie de flux (tétramères et marquage intracellulaire) ont été mises au point. Toutes ont en commun de caractériser les activités des lymphocytes T, mais sont fondées sur des principes différents, à savoir la mesure de la lyse des cellules cibles, de la sécrétion de cytokines ou de l’expression de récepteurs T spécifiques par les lymphocytes T CD8+ spécifiques.

Mots-clés : Lymphocytes T CD8+ – Cytokines – Elispot – Cytométrie.

Illustrations

ARTICLE

Les mécanismes de défense de l'hôte contre un micro-organisme pathogène sont de nature spécifique et non spécifique. La réponse non spécifique est précoce : il s'agit des activités des phagocytes, des cellules tueuses naturelles (NK) ou de réponses médiées par des facteurs solubles comme l'interféron et le complément. La réponse immunitaire spécifique est plus tardive car elle met en jeu des processus d'activation, de prolifération et de différenciation des lymphocytes précurseurs naïfs consécutifs au contact de l'antigène avec son récepteur. Cette composante spécifique est à la fois humorale, médiée par les anticorps, et cellulaire médiée par les effecteurs cytotoxiques. Pour des raisons de simplicité, nous aborderons ici les réponses spécifiques induites lors d'infections par des virus, mais les réponses sont similaires pour d'autres micro-organismes à développement intracellulaire (bactéries, parasites). De plus, l'étude des lymphocytes CD8+ spécifiques des cellules tumorales utilise les mêmes techniques.

Dans le cas d'une infection virale, les anticorps reconnaissent et neutralisent le virus libre, les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) détruisent les cellules infectées par le virus. Les lymphocytes T reconnaissent l'antigène par leur récepteur de surface ou TCR. Ce récepteur ne reconnaît pas l'antigène natif, mais un fragment peptidique, dérivé de l'antigène, de 8 à 12 acides aminés appelé épitope T, complexé à une molécule du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH). Les lymphocytes T cytotoxiques portent à leur surface l'antigène CD8 ou CD4, et leur l'activité est restreinte par les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I ou de classe II, respectivement. La grande majorité des effecteurs cytotoxiques sont des lymphocytes T CD8+. Les lymphocytes T CD4+ sécrètent des cytokines et aident à la production d'anticorps par les lymphocytes B et à l'induction de la réponse cytotoxique des lymphocytes T CD8+.

Lors de la synthèse des protéines virales dans la cellule, une partie va entrer dans le cycle de dégradation des protéines cellulaires par le complexe du protéasome. Les peptides issus de cette dégradation sont présentés en surface par les molécules de classe I du CMH. Après reconnaissance spécifique par leur TCR, les effecteurs CD8+ sécrètent des cytokines comme le facteur de nécrose tumorale alpha (TNFalpha) et l'interféron gamma (IFNgamma). Les CTL lysent la cellule infectée par libération de granules lytiques qui vont générer des canaux dans la membrane de la cellule cible. Il existe une autre voie faisant intervenir l'expression sur la cellule CD8+ activée du ligand de Fas (Fas-L) qui induit la mort par apoptose de la cellule cible exprimant le récepteur Fas en surface.

Les différentes techniques permettant l'évaluation des effecteurs T spécifiques sont fondées sur des procédés in vitro, utilisés ensemble ou séparément. Ils permettent soit l'estimation de la fonction de cytotoxicité par la destruction des cellules cibles marquées avec un radioélément (technique de relargage du chrome), soit l'évaluation de la fonction de sécrétion de cytokines après activation spécifique de l'effecteur par les antigènes viraux (technique Elispot, marquage intracellulaire), soit la mesure de l'expression de surface d'un récepteur T particulier spécifique d'un épitope viral (technique dite des tétramères).

Les techniques fondées sur le marquage des cellules cibles

Il s'agit des premières techniques utilisées. Différents marqueurs radioactifs ou colorés ont été utilisés pour les cellules cibles. Seul sera présenté le test de relargage du chrome par les cellules cibles décrit initialement par Brunner et al., en 1968 [1]. Il s'agit du test le plus couramment employé. Son principe est le marquage des cellules cibles exprimant les antigènes viraux par un élément radioactif, l'isotope 51 du chrome sous forme de chromate de sodium. Une fois incorporé, le chrome change de valence et ne peut plus ressortir spontanément de la cellule cible. En revanche, si la cellule est détruite, il se retrouve dans le surnageant de culture. La mesure de la radioactivité présente dans le surnageant de la coculture de cibles et d'effecteurs permet donc une quantification de l'activité cytotoxique des effecteurs vis-à-vis des cibles mises en présence.

* Description d'un test

L'activité cytotoxique est déterminée par un test dans lequel des quantités variables d'effecteurs sont mises en présence d'un nombre défini de cibles marquées. La figure 1 schématise un test dans lequel des virus recombinants de la vaccine exprimant une protéine du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) sont utilisés pour évaluer les activités spécifiques du VIH chez l'homme à partir de lymphocytes circulants (PBMC) pris comme effecteurs. Au préalable, une lignée autologue aura été obtenue par transformation des lymphocytes B par le virus d'Epstein-Barr. La veille du test, des aliquotes de cellules de cette lignée sont infectées par des virus de la vaccine exprimant une protéine du VIH1 et le virus de la vaccine sauvage pris comme témoin. La multiplicité d'infection est telle que plus de 80 % des cellules sont infectées 16 heures après l'infection. À ce moment les différents lots de cellules cibles sont marqués par une solution de chromate de sodium radioactif, puis répartis après lavages à raison de 5 000 cellules par puits dans une plaque à 96 puits. Les lymphocytes circulants utilisés comme effecteurs sont isolés du sang total et mis en contact des différents lots de cellules cibles à raison de trois rapports effecteurs/cibles pendant 4 heures à 37 °C. Au bout de ce temps, un volume fixe de surnageant est prélevé de chaque puits pour être mis à compter dans un compteur de radioactivité gamma ou bêta. Pour chaque rapport effecteurs/cibles, le pourcentage de lyse spécifique est calculé par la formule suivante : [CPM expérimental ­ CPM spontané]/[CPM totaux ­ CPM spontané]. Le relargage spontané (CPM spontané) correspond au relargage de chrome par les cibles sans effecteurs, et le relargage total (CPM total) représente le relargage maximal obtenu en remplaçant les effecteurs par un détergent.

Un exemple de représentation graphique est montré dans la figure 2. Dans cet exemple, l'activité cytotoxique est exprimée en pourcentage de lyse spécifique en fonction des rapports effecteurs/cibles utilisés. Pour comparer la lyse indépendamment du rapport effecteurs/cibles testé, l'activité cytotoxique peut être exprimée en unité lytique (UL) [2]. Une unité lytique est définie comme la quantité d'effecteurs nécessaire pour obtenir un pourcentage de lyse déterminé, soit par exemple 20 %. Dans l'exemple de la figure 2, les effecteurs sont des lymphocytes circulants frais d'un sujet infecté par le VIH. Le nombre d'unités lytiques est rapporté à un nombre fixe de lymphocytes, par exemple un million de PBMC. Dans cet exemple graphique, une UL correspond à un rapport effecteur/cible de 8/1 pour la cible exprimant la protéine Gag et de 32/1 pour la cible exprimant la protéine Nef. Compte tenu du nombre de cibles (5 000) présentes dans chaque puits, le nombre d'UL rapportées à 1 million d'effecteurs sera donc de 25 pour Gag et de 6,25 pour Nef. Il existe également une variante de la technique de cytotoxicité au chrome fondée sur l'analyse en dilution limite permettant de calculer une fréquence de précurseurs cytotoxiques [3].

* Paramètres du test de relargage au chrome

Choix de la cellule cible. Afin de pouvoir mettre en évidence la fonction cytotoxique, il faut recréer in vitro les modalités de reconnaissance antigénique du TCR, permettant l'activation des CTL, et tenir compte de la restriction de l'activité CTL par le CMH initialement décrite par Zinkernagel et Doherty en 1974 [4]. Pour que les CTL soient actifs, la cellule tueuse et la cellule cible doivent être histocompatibles, c'est-à-dire exprimant les mêmes molécules du CMH. Dans les modèles murins, cette condition n'est pas trop contraignante grâce à l'utilisation de souches de souris avec un CMH bien caractérisé et à l'existence de nombreuses lignées cellulaires dérivées. En revanche, dans le cas d'étude chez l'homme, cette condition nécessite l'obtention de lignée autologue pour chaque sujet étudié. Une solution alternative est d'utiliser des lignées partiellement histocompatibles, ce qui demande soit le typage des molécules du CMH (HLA), soit des cellules transfectées avec des molécules du CMH.

Modalités d'expressions des antigènes viraux. L'expression des antigènes viraux dans des cellules cibles peut se faire par infection par le virus étudié, par des vecteurs d'expression ou par l'utilisation de peptides synthétiques correspondant aux épitopes viraux. Tous les choix sont possibles quand la cellule cible est permissive au virus. Cependant, pour les virus qui ont un tropisme cellulaire restreint, comme dans le cas des virus de l'immunodéficience humaine ou des virus des hépatites B ou C, l'infection de lignées autologues peut être très difficile, voire impossible. C'est pour cette raison que pour les études des CTL spécifiques du VIH, la plupart des expérimentateurs utilisent des vecteurs d'expression. Les virus Pox, et en particulier le virus de la vaccine, sont des vecteurs très couramment utilisés. Quel que soit le mode d'expression retenu, il est important qu'une majorité des cellules cibles expriment les antigènes viraux afin d'avoir une sensibilité suffisante du test de cytotoxicité.

La mesure du relargage du chrome radioactif. La sensibilité du test est liée à la capacité de la cellule cible de fixer le chrome. La majorité des cibles utilisées chez l'homme sont des lignées tumorales. L'isotope 51 du chrome émet des rayonnements de type bêta et gamma. Il est donc possible de mesurer la radioactivité relarguée par des compteurs de type gamma ou bêta.

* Nature des effecteurs

Des techniques de séparation des sous-populations lymphocytaires permettent de mettre en évidence la nature des effecteurs, comme le tri des populations des lymphocytes CD4+ ou CD8+ à l'aide d'anticorps couplés à des billes magnétiques. L'utilisation de cibles autologues, hétérologues ou partiellement histocompatibles permet la caractérisation de la restriction HLA et l'identification de la molécule HLA présentatrice de l'antigène. Comme indiqué en introduction, la majorité des réponses cytotoxiques spécifiques des virus est médiée par les lymphocytes T CD8+.

Les techniques fondées sur la détection de cytokines sécrétées spécifiquement par les effecteurs activés

La technique Elispot

Le principe de la technique Elispot (enzyme-linked immunospot) est la détection des cellules produisant une cytokine, au niveau unicellulaire. La cytokine sécrétée par la cellule est piégée par un anticorps à proximité de la cellule productrice, à une concentration forte. Après révélation de la présence de la cytokine par un deuxième anticorps couplé à une enzyme dont le produit est coloré, chaque point (ou spot) représente l'empreinte d'une cellule productrice de la cytokine.

Cette technique a été décrite en 1988 [5]. Son utilisation pour l'étude des lymphocytes T CD8+ spécifiques d'un antigène ne s'est développée que 10 ans plus tard. En effet, lorsque les lymphocytes T CD8+ reconnaissent leur épitope à la surface d'une cellule cible, ils lysent cette dernière. Cette reconnaissance induit aussi la sécrétion de cytokines. Ainsi, l'Elispot permet de détecter cette seconde fonction des lymphocytes CD8+ spécifiques d'un antigène. Les deux fonctions (cytotoxicité et production de cytokines) sont globalement corrélées et induites par les mêmes interactions moléculaires [6]. Plusieurs groupes ont montré que l'utilisation de cellules sanguines immédiatement après leur isolement comme cellules répondeuses en test Elispot permet la détection de lymphocytes CD8+ spécifiques des peptides viraux, bactériens et tumoraux [7-9]. Théoriquement, la détection de toute protéine sécrétée spécifiquement par les lymphocytes T CD8+ activés peut être utilisée (cytokine, granzyme) pour cette technique. Pratiquement, la grande majorité des techniques Elispot est basée sur la détection d'IFNgamma ou du TNFalpha. Elles ont deux avantages majeurs par comparaison aux techniques de relargage du chrome : elles ne nécessitent pas de cellules cibles et elles sont plus sensibles. Ces premiers travaux ont montré l'intérêt de la technique Elispot, qui se développe pour les études des lymphocytes T CD8+.

* Description d'un test

La figure 3 représente le déroulement détaillé d'un test. Les plaques de culture de 96 puits, dont le fond est une membrane en nitrocellulose ou de nylon, sont recouvertes d'un anticorps reconnaissant la cytokine d'intérêt, dit anticorps de capture (étape 1). Cette étape est réalisée à + 4 °C durant une nuit. Les cellules répondeuses sont ensuite cultivées et stimulées par des antigènes étudiés (peptides viraux ou tumoraux, protéines ou virus vivants). Les cellules reconnaissant l'antigène vont sécréter la cytokine qui sera piégée localement (étape 2). La culture des cellules dure de 6 heures à une nuit. Après élimination des cellules, un deuxième anticorps, dit de révélation, reconnaissant un site de la cytokine distinct de celui reconnu par l'anticorps de capture, est ajouté (étape 3). Il est en général couplé à la biotine. Une enzyme ayant un substrat coloré (phosphatase alcaline, peroxydase ou beta-galactosidase), couplée à la streptavidine qui a une forte affinité pour la biotine, va ensuite se fixer sur l'anticorps de détection. Enfin le substrat de l'enzyme est ajouté. Transformé par l'enzyme, il se colore, précipite et révèle les zones de production de la cytokine (étape 4). Les points qui apparaissent correspondent chacun à une cellule productrice. Les trois étapes de la révélation durent une journée. Après lecture à la loupe binoculaire, la fréquence des cellules répondant à chaque antigène est ainsi déterminée.

* Paramètres de la technique Elispot

Quelle cytokine détecter ? Les cytokines sont divisées en deux groupes, celles favorisant l'immunité à médiation cellulaire (type 1 : IFNgamma, TNFalpha, IL2) et celles favorisant l'immunité humorale (type 2 : IL4, IL5, IL13). Certaines pathologies induisent une modification de l'équilibre entre ces cytokines, ou bien une voie de l'immunité plutôt que l'autre est importante dans le contrôle d'un pathogène donné. Les lymphocytes T cytotoxiques sécrètent essentiellement des cytokines de type 1, l'IFNgamma et le TNFalpha. Aussi en test Elispot, l'IFNgamma et le TNFalpha sont les cytokines utilisées pour l'étude des lymphocytes T CD8+ [7-10]. Mais, il faut garder en mémoire que des lymphocytes T CD8+ peuvent ne pas sécréter d'IFNgamma ou de TNFalpha, mais plutôt des cytokines de type 2. En général, ces cellules ne sont pas cytotoxiques.

Quel doit être la forme de l'antigène stimulateur ? Les cellules CD8+ reconnaissent l'antigène sous forme de peptides de 8 à 11 acides aminés complexés aux molécules du CMH de classe I. Dans la majorité des études, des peptides synthétiques correspondant à des épitopes déjà identifiés ont été utilisés pour détecter les CD8+. Les peptides synthétiques stimulent efficacement les lymphocytes T CD8+ spécifiques, mais cette approche présente l'inconvénient de ne détecter que les lymphocytes T CD8+ dont les épitopes sont connus, et non pas la globalité de la réponse contre le pathogène. De plus, un peptide synthétique ne pourra être utilisé que chez les sujets exprimant la molécule du CMH présentant ce peptide. Des virus recombinants de la vaccine exprimant une protéine complète du VIH ont également été utilisés [11]. Dans ce cas, la réponse peut être étudiée chez tous les sujets, sans connaître leur génotype HLA ni les épitopes reconnus.

Comment compter les spots ? La détermination des spots se fait par comptage manuel sous loupe binoculaire. Cette étape est fastidieuse et imprécise quand le nombre de spots est trop élevé. Par ailleurs, la taille et l'intensité des spots sont extrêmement variables [12, Buseyne et al., résultats non publiés). Herr et al. [12] ont utilisé l'analyse d'image par informatique et ont montré que les CD8+ stimulés avec des peptides antigéniques produisaient plus de spots et que ces spots étaient de plus grande taille que dans les cultures témoins. L'analyse d'image par informatique est une solution intéressante, qui pourrait probablement beaucoup apporter à la précision de la technique.

* Nature des cellules détectées par la technique Elispot

Une différence majeure entre le test de relargage du chrome et les techniques alternatives concerne le stade de différenciation des cellules étudiées. Un lymphocyte T CD8+ spécifique d'un antigène connaît plusieurs phases de développement in vivo. Au stade naïf, il est présent à des fréquences très faibles et n'a pas de fonction effectrice. Lorsqu'il est stimulé par la reconnaissance de son antigène, il prolifère et se différencie en cellule effectrice. Une fois le pathogène éliminé, une fraction importante des lymphocytes activés meurent, et une autre partie se transforment en cellules mémoires, dont la fréquence est plus élevée que la fréquence initiale du lymphocyte au stade naïf, qui s'activeront plus rapidement en présence du pathogène.

Les molécules (perforine, granzymes) impliquées dans la lyse des cellules sont exprimées de façon constitutive dans les lymphocytes au stade effecteur. Ainsi l'activité CTL de cellules immédiatement après leur isolement est celle de CTL activés in vivo. En revanche, un lymphocyte mémoire, lorsqu'il rencontre de nouveau son antigène, a tout de même besoin de plusieurs jours pour se différencier en cellule cytotoxique. Il n'est pas détecté par un test de lyse dans une population de cellules fraîches, mais le sera après culture in vitro.

La synthèse de cytokines par les lymphocytes T CD8+ est régulée de façon différente de celles des protéines impliquées dans la cytotoxicité. Elle n'est pas constitutive, ni chez les effecteurs, ni chez les cellules mémoires. En revanche, elle est induite en quelques heures après la reconnaissance de l'antigène [13], et sa cinétique de production est la même pour des lymphocytes effecteurs ou mémoires [14]. Donc, dans le cas d'utilisation de cellules fraîchement isolées, un test Elispot détectera les cellules effectrices activées et les cellules « mémoires », alors que le test au chrome ne détectera que les lymphocytes activés in vivo [7]. Il en va de même pour les techniques de marquage intracellulaire des cytokines et des tétramères décrites plus loin.

Si les lymphocytes T CD8+ sont testés lors d'une infection aiguë, une partie des cellules détectées sont à un stade de différenciation qui ne leur permet plus de proliférer en réponse à une stimulation. La mise en culture des cellules avant un test au chrome va faire disparaître ces cellules, et le test ne détectera que les lymphocytes spécifiques au stade mémoire. En revanche, le test Elispot, le marquage intracellulaire des cytokines, le marquage par les tétramères détecteront toutes les cellules spécifiques avant la mise en culture, sans donner d'indication sur leur capacité à proliférer. Ainsi, les différences de fréquences obtenues par Elispot et par un test au chrome en dilution limite sont plus fortes en phase d'infection aiguë qu'après élimination du virus [6]. Plusieurs études dans des infections virales chez l'homme et la souris ont montré globalement une bonne corrélation entre les fréquences obtenues par Elispot et celles obtenues par dilution limite avec un test de relargage du chrome [6, 15, 16]. Selon les études, le rapport entre les deux fréquences varie de 5 à 20 en faveur du test Elispot, ce qui est probablement dû en partie à la différence de nature des cellules répondeuses. Quelques exceptions sont parfois observées [7], ce qui n'est pas surprenant du fait de la dynamique complexe des lymphocytes CD8+.

Les techniques de marquage intracellulaire des cytokines

La production des cytokines au niveau d'une cellule T peut être également analysée en utilisant la cytométrie de flux. Dans ce cas, la technique consiste à coupler des marquages avec des fluorochromes différents, ce qui permet d'identifier simultanément des antigènes de surface et des cytokines intracellulaires.

* Description d'un test

La technique est schématisée dans la figure 4. Des cellules T sont stimulées in vitro avec l'antigène en présence de monensine ou de bréfeldine A pour bloquer le transport des cytokines par l'appareil de Golgi, ce qui prévient la sécrétion des cytokines. Après une incubation de 6 à 15 heures, les cellules T sont traitées avec des anticorps spécifiques d'un antigène de surface et marquées par un fluorochrome, puis elles sont lavées, fixées et perméabilisées à la saponine pour permettre aux anticorps spécifiques des cytokines de pénétrer à l'intérieur de la cellule. Les cellules sont alors analysées en cytométrie de flux.

* Intérêt et limite du marquage intracellulaire

Le marquage intracellulaire des cytokines offre plusieurs avantages : 1) un grand nombre de cellules T peuvent être analysées dans une période courte ; 2) l'utilisation de plusieurs anticorps avec des spécificités distinctes et couplés à différents fluorochromes permet l'étude de la coproduction de plus d'une cytokine par une même cellule ; et 3) il est possible de déterminer le phénotype des cellules qui produisent les cytokines grâce à l'utilisation d'anticorps marqués dirigés contre des antigènes de surface des cellules étudiées. Cette méthode a été employée avec succès pour caractériser la production des cytokines par les cellules de T CD4+ dans le sang périphérique de sujets adultes infectés par le VIH [17]. La détection des cytokines intracellulaires présente les mêmes avantages et contraintes que la technique Elispot pour ce qui est de la nature de l'antigène à utiliser.

L'utilisation de tétramères pour la visualisation des cellules T CD8+ spécifiques de l'antigène
par cytométrie de flux

Des progrès technologiques récents ont maintenant rendu possible des analyses par cytométrie de flux identifiant les différentes cellules T CD8+ sur la base de leur capacité de se lier à un complexe de CMH-peptide. Cela n'était pas possible précédemment, à cause de la complexité des mécanismes d'identification des antigènes par les lymphocytes T qui font interagir le TCR, le peptide antigénique, et les chaînes lourdes et légères des molécules CMH de classe I. En outre, cette interaction a une faible affinité : le TCR se dissocie rapidement du complexe de CMH-peptide.

* Principe de la technique des tétramères et description d'un test

Plusieurs groupes ont maintenant prouvé qu'il est possible de produire des complexes constitués de quatre molécules de CMH et du peptide (tétramères), qui peuvent se fixer de façon spécifique sur les cellules T qui expriment des TCR de spécificité correspondante [18-20]. La présence du fluorochrome permet la visualisation par cytométrie de flux des cellules T CD8+ qui ont lié les tétramères (figure 5, B). La méthode de synthèse des tétramères est schématisée dans la figure 5, A. La molécule présentatrice du CMH (la chaîne lourde) est synthétisée sous une forme soluble par une bactérie (Escherichia coli). À la partie (COOH) carboxique terminale de la molécule, une séquence polypeptidique, qui peut être identifiée par l'enzyme BirA, est incorporée. À ce stade, la molécule de CMH n'est pas encore correctement repliée pour permettre la liaison avec le peptide, mais la conformation correcte est induite par l'addition des chaînes légères (la beta2-microglobuline) et du peptide qui représente l'épitope reconnu par le TCR. L'enzyme BirA est alors employée pour attacher la biotine au polypeptide rajouté sur la partie carboxique terminale. Le complexe (par l'intermédiaire de la biotine) peut alors être attaché à une molécule de streptavidine, qui a été précédemment conjuguée avec un fluorochrome. Puisque chaque molécule de streptavidine a quatre sites de liaison avec la biotine, un complexe tétramérique est produit, qui contient quatre molécules de classe I du CMH ; ce complexe a une plus grande affinité pour des cellules de T que les molécules monomériques de classe I du CMH. Nous avons adapté la technique de tétramères pour détecter les cellules T CD8+ spécifiques dans le sang total. Cent microlitres de sang sont incubés avec les anticorps anti-CD8-FITC (marqué à l'isothiocyanate de fluorescéine), anti-CD3-ECD (marqué à la phycoérythrine-texas red), anti-CD16-PC5 (marqué à la phycoérythrine-cyanine5) et les tétramères marqués à la phycoérythrine (PE). Le mélange est incubé pendant 20 à 30 minutes à température du laboratoire. À la fin de l'incubation, les hématies sont lysées par un tampon de lyse standard et les lymphocytes sont fixés. Les cellules sont lavées et reprises dans un tampon PBS et analysées au cytomètre.

* Application, intérêts et limites de la technique des tétramères

La méthode des tétramères a été employée pour étudier des réponses des lymphocytes T CD8+ dans les modèles murins d'infection virale aiguë comme le virus de chorioméningite lymphocytaire, aussi bien que dans le cas d'infections virales humaines, telles que le virus d'Epstein-Barr et le virus de l'immunodéficience humaine, le virus de l'hépatite B et le virus de l'hépatite C [6, 18-21]. Dans ces cas, l'analyse par tétramères montre que l'expansion des cellules T CD8 spécifiques de l'antigène pendant la phase aiguë de la réponse est plus importante que celle précédemment décrite avec le test de relargage du chrome. À la différence des tests de relargage au chrome ou Elispot, des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l'antigène peuvent être analysés directement. Cette technique permet l'analyse directe des cellules dans des échantillons de sang frais sans passer par une phase d'activation in vitro de quelques heures (test de relargage au chrome ou Elispot avec effecteurs frais directement utilisés après séparation des lymphocytes du sang total), ou par des phases d'activation et d'expansion de quelques semaines dans le cas d'utilisation de lignées de lymphocytes T, ce qui peut sélectionner des sous-populations lymphocytaires in vitro. La corrélation entre les fréquences obtenues par Elispot et celles obtenues par tétramères est bonne, et le rapport entre les deux fréquences est d'un facteur 5 à 10 environ, en faveur du test utilisant les tétramères, ce qui pourrait refléter qu'il ne s'agit pas d'un test fonctionnel.

Une des limitations principales de la méthode des tétramères est qu'elle n'est applicable que dans les situations où l'épitope T ainsi que la molécule du CMH présentant cet épitope aux lymphocytes T sont connus. Par conséquent, actuellement, cette technique peut être appliquée seulement à l'analyse d'un nombre relativement restreint de réponses T CD8+. Cependant, l'analyse par tétramères offre beaucoup d'avantages potentiels par rapport aux analyses traditionnelles de relargage du chrome. Cette méthode n'exige pas l'utilisation des radio-isotopes, et elle est rapide, de sorte qu'un grand nombre d'échantillons de sang frais ou de tissu peuvent être analysés. Puisque l'analyse est exécutée en utilisant un cytomètre de flux, les cellules peuvent être marquées avec le tétramère et en même temps avec d'autres anticorps monoclonaux fluorescents qui sont spécifiques pour d'autres molécules de surface ; cela permet la caractérisation de la nature des cellules impliquées dans la réponse. De plus, et à la différence de la méthode de mesure des cytokines intracellulaires (décrite ci-dessus), la méthode d'analyse par les tétramères ne tue pas les cellules marquées ; donc, les cellules peuvent être sélectionnées par cytométrie de flux, et cultivées pour des analyses additionnelles (telles que l'Elispot et la cytotoxicité au chrome) pour étudier leurs capacités fonctionnelles de sécrétion ou de cytotoxicité [22]. Il est aussi possible de coupler cette technique des tétramères avec un marquage de cytokine intracellulaire permettant ainsi de montrer une sécrétion de cytokine après activation spécifique.

CONCLUSION

Différentes techniques permettent l'évaluation de la spécificité des lymphocytes T CD8+. Une seule technique évalue une fonction de cytotoxicité : c'est la technique de relargage du chrome. Cette technique présente de nombreuses contraintes pratiques à cause de l'utilisation d'isotope radioactif et de cultures cellulaires des lignées cibles et effectrices. Elle tend à être remplacée par des techniques alternatives (Elispot, marquage intracellulaire, tétramères) plus sensibles et plus rapides, mais qui mesurent d'autres fonctions ou marqueurs des lymphocytes T CD8+.

L'autre fonction des lymphocytes T CD8+, la sécrétion de cytokines, est mesurée par Elispot et par marquage intracellulaire. La technique Elispot est vraisemblablement la technique la plus sensible et la plus accessible au point de vue de l'équipement de base du laboratoire. Elle ne demande pas l'usage de lignées de cellules autologues pour chaque individu testé. Néanmoins, son développement nécessitera l'utilisation d'un système de lecture informatisé. À ce propos, si des progrès ont été faits pour diminuer la variabilité de la lecture manuelle grâce à la mise au point d'appareils automatisés et couplés à un ordinateur, il reste que la programmation de la lecture des spots est faite par l'expérimentateur. Quelques types de lecteurs automatisés sont disponibles depuis peu de temps en France.

Les techniques des tétramères sont très simples et rapides dans leur réalisation, mais elles demandent l'emploi de réactifs pas encore disponibles dans le commerce et d'infrastructures pour la cytométrie. Actuellement elles sont développées dans des laboratoires spécialisés. Leur usage est limité par la disponibilité des réactifs (molécules HLA complexées sous forme de tétramères avec des épitopes T de séquences connues) et de cytomètres. Il est important, dans la comparaison de ces différentes techniques, de garder en mémoire qu'elles mesurent une liaison spécifique entre un récepteur T et son ligand, et ne sont pas un test fonctionnel. De plus, dans certaines situations, les lymphocytes T CD8+ se liant spécifiquement aux tétramères peuvent ne pas avoir de fonction cytotoxique [22].

En conclusion, chacune de ces techniques présente des caractéristiques propres et le choix de l'une ou l'autre sera guidé par la nature des questions posées et les contraintes propres à chaque expérimentation.

Remerciements. Les travaux du laboratoire sont financés par l'Institut Pasteur, l'ANRS, le CNRS (URA 1930), Sidaction et la Pediatric Aids Fondation.

REFERENCES

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