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Iron metabolism : recent aspects of biochemical tools


Hématologie. Volume 2, Number 1, 45-56, Janvier - Février 1996, REVUES ET MINI-REVUES


Résumé   Summary  

Author(s) : Jean-Claude Rymer, Laboratoire central de biochimie, laboratoire associé de médecine nucléaire, Centre hospitalier universitaire Henri-Mondor, 94010 Créteil..

Summary : Parameters classically used to study iron metabolism include measures of sideremia and total iron binding capacity of transferrin. Other biological tools provide a precious help in the investigation of iron disorders. In this setting seric ferritin assays allow to specify the tissue iron content. More recently, the determination of ferritin levels in erythrocystes (these levels are closely related to the amount of iron available for erythropiesis) and soluble transferrin receptors assays have been available in current practice. Moreover, these two last tests are not yet been approved by the reglementory authorities and should be reserved in a second time of the investigation process. Ferritin assays in erythrocytes is especially used for the diagnosis and follow-up in iron overload patients. Soluble transferrin receptor assay is helpfull tool for the diagnosis of iron deficiency and notably when an acute phase syndrom is associated and lead to a difficult interpretation of ferritinemia results. Different proteins which have been recently identified such as mucins, integrins, mobiferrin… highlight the molecular mechanisms of iron absorption by enterocytes. Likewise, the discovery of an identical untranslated sequence in mRNA (IRE : iron responsive element) of both H and L chains of ferritin, in mRNA of delta-ALA synthase and in mRNA of TfR have led to a better understanding of the regulation pathways. A soluble cytoplasmic protein (IRF : iron regulatory factor) binds to IRE in case of cellular iron deprivation ; this binding inhibits delta-ALA synthase and ferritin synthesis as well as transferrin receptors mRNA degradation. TfR synthesis is then enhanced and iron uptake increased. On the contrary, growing iron level induces IRF conformational changes which produces a release of IRF from IRE ; as a consequence, delta-ALA synthase and ferritin are produced again, and cellular iron uptake is reduced. So, we may consider IRF as an intracellular sensor and regular of iron. Such proteins let us hope that we will be able to specify how iron enters the cell and how this mechanism is regulated according to cellular needs. Furthermore the identification of hemachromatosis gene and the protein encoded will help to explain how iron works in human cells.

Keywords : iron metabolism, ferritin, transferrin, mobilferrin, IRE, IRF.

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ARTICLE

Le fer a certainement été l'élément inorganique le plus étudié au cours des cinquante dernières années ; son métabolisme conserve encore quelques mystères, notamment en ce qui concerne l'absorption digestive ; l'espoir d'aboutir à une meilleure compréhension de sa régulation réside aujourd'hui dans la biologie moléculaire de l'hémochromatose primitive, quand on aura identifié le ou les éléments défectueux qui permettent une absorption du fer au-delà des besoins nécessaires. C'est une des caractéristiques remarquables du métabolisme martial que d'être en équilibre instable, sans réelle possibilité de régulation par une voie excrétrice.
Un équilibre instable est défini par une situation à partir de laquelle toute perturbation accroît le déséquilibre. Les besoins quotidiens en fer de l'organisme humain sont de l'ordre de 1 à 2 mg, apportés dans les pays développés, par les quelque 10 mg d'une alimentation normalement diversifiée. Cet apport compense exactement les pertes urinaires, fécales, sudorales... [1] qui représentent le « bruit de fond » de la déperdition martiale physiologique. Il est admis que les mécanismes régulateurs ne s'exercent qu'au niveau des entrées digestives ; la seule méthode efficace dont l'organisme dispose pour éliminer du fer est la spoliation sanguine : dans les conditions physiologiques normales, 1 ml de sang contient 0,4 à 0,5 mg de fer.
Outre des conditions nutritionnelles insuffisantes (qui sont à l'origine de carences touchant plus de la moitié de la population mondiale), la physiologie de la femme peut, à elle seule, être responsable de carences martiales constatées effectivement chez plus de 60 % d'entre elles, de la puberté à la ménopause. La grossesse, des comportements « sociaux » (régimes, stérilet...) font que même dans les pays à haut niveau de vie, ces facteurs se conjuguent pour faire des femmes en âge de procréer et de leurs enfants, des sujets à risque de carence. On sait faire maintenant le diagnostic biologique précoce de ces carences martiales, avant que n'apparaisse un signe hématologique ; une prévention adaptée permet d'éviter l'apparition de l'anémie hypochrome microcytaire qui en représente le stade ultime.

Vision macroscopique du métabolisme martial

Presque tous les organismes vivants semblent avoir besoin de fer ; dans les conditions physiologiques habituelles, le fer existe sous forme oxydée ferrique Fe(III) ; comme la plupart des sels de fer sont hydrolysés à pH neutre sous forme d'hydroxydes ferriques insolubles, tous les ions Fe(III) dont la concentration est supérieure à environ 10-18M précipitent. Pour résoudre ce problème physico-chimique, l'évolution a sélectionné des mécanismes de capture et de transport propres aux micro-organismes (sidérophores) ou aux vertébrés, en « inventant » pour ceux-ci des molécules particulières, circulant dans le sérum et ayant une haute affinité pour l'ion fer. Chez l'homme, un schéma simplifié du métabolisme martial peut être représenté comme sur la figure 1.

Les compartiments étudiés. Les paramètres représentés

Pour les principaux compartiments du modèle illustréfigure 1, anatomiquement distincts mais en étroite interrelation, un ensemble de données hématologiques et biochimiques peut être recueilli :

- Le compartiment du fer érythrocytaire, où le fer est lié à l'hémoglobine, est exploré sur un simple prélèvement de sang qui fournit les paramètres érythrocytaires connus ; leur sensibilité diagnostique pour la carence martiale a fait l'objet d'une mise au point toujours d'actualité [2] ; la TCMH est le premier paramètre à s'abaisser, suivie par le VGM lui-même précédant la diminution du taux d'hémoglobine. L'étude biochimique s'est enrichie ici d'un examen trop peu prescrit (sans doute parce qu'il ne figure pas encore à la nomenclature des actes de biologie) : le dosage de la ferritine intra-érythrocytaire dont nous préciserons ultérieurement l'intérêt.
- Le compartiment circulant est étudié avec les dosages du fer sérique et de la transferrine (sidérophiline). Les méthodes actuelles déterminent la quantité de protéine présente dans le sérum, directement et non plus par l'intermédiaire de sa fonction principale de fixation et de transport du fer. L'intérêt de ces nouvelles méthodes, plus précises et mieux standardisées, compense largement le risque faible de quantifier une protéine, trouvée en concentration normale mais ayant un site fonctionnel altéré. Dans certaines situations pathologiques (histiocytoses, hémochromatoses...) des transporteurs inhabituels du fer ont été décrits ; en cas de cytolyse tissulaire massive (hépatites aiguës) des quantités notables de fer peuvent être trouvées dans le sérum, liées à des molécules de ferritine. Ces situations anormales ont amené à préciser la terminologie des paramètres étudiés et à parler de capacité totale de fixation du sérum et non plus de la transferrine qui demeure, en règle générale, le transporteur majoritaire du fer circulant [3].
- Le compartiment de réserve est le plus informatif car c'est là que débute une carence ou une surcharge martiale. Il a longtemps résisté aux investigations simples : de la prise alimentaire d'une dose traceuse de 59Fe à la ponction biopsie hépatique en passant par la phlébotomie quantitative, toute une gamme d'examens relativement agressifs a été utilisée, certains (PBH) conservant une valeur diagnostique irremplaçable. L'observation faite, que la quantité de molécules de ferritine relarguées ou sécrétées dans le sérum était proportionnelle à l'importance des réserves tissulaires, a permis un progrès dont le malade bénéficie directement [4] ; l'estimation des réserves est devenue possible sur un simple prélèvement sanguin obtenu sans contraintes particulières. Cependant, bien que le principe de la mesure soit élémentaire, la complexité de la molécule étudiée (une famille d'isoformes) fait que les résultats de laboratoire demandent à être interprétés d'une façon très critique, même après vingt-cinq années de développements analytiques [5]. Une « équivalence » traîne encore dans la littérature, considérant que 1 mcg/l de ferritine sérique est le reflet de 8 à 12 mg de fer de réserve ; cette notion historique est à oublier, la fourchette des valeurs étant comprise entre 2,5 et 20 mg et la relation n'étant linéaire que dans une étroite gamme de concentration. La ferritinémie fournit donc bien une estimation indirecte des réserves et non une mesure quantitative directe.
Une étude complète du métabolisme martial devrait logiquement comporter un bilan des entrées, de l'absorption réelle et des sorties. En fait, les études nutritionnelles publiées concernent des échantillons (souvent dans le tiers-monde) [6] et rarement l'analyse diététique a été utilisée au plan individuel. Les sorties sont évaluées dans des cas pathologiques, par le dosage du fer urinaire éliminé après injection d'un chélateur (Desféral®) ; ni la sidérurie des vingt-quatre heures, ni le fer fécal, pourtant important (excrétion biliaire, exfoliation intestinale), n'ont trouvé leur place dans l'arsenal des examens de routine.
D'autres examens complémentaires ont vu leurs indications se restreindre ou être précisées en se limitant à des cas particuliers : cinétiques d'incorporation du fer radio-actif, imagerie (scannographie avec mesure du coefficient d'atténuation du rayonnement X par le parenchyme hépatique) [7].
Le fer des macrophages de la moelle osseuse ou le fer tissulaire dosé sur des « carottes » hépatiques recueillies par ponction biopsie, conservent des indications limitées à des cas complexes pour lesquels les paramètres biochimiques dont nous détaillerons les méthodes de mesure, n'ont pas apporté toutes les réponses attendues.

Vision microscopique du métabolisme martial

Absorption intestinale

Une assez bonne compréhension du processus de captation et d'assimilation du fer à partir du milieu ambiant a d'abord été acquise chez un micro-organisme simple. Escherichia Coli, placé dans un milieu pauvre en fer, synthétise des molécules de faible masse molaire, capables de fixer le fer (sidérophores) ; ces chélateurs vont lier fortement le métal pour former un complexe Fe(III)-sidérophore. Par une cascade de transporteurs spécifiques, ce complexe est amené depuis la face externe de la membrane, dans le cytoplasme où le fer sera libéré, probablement par une réaction d'oxydoréduction catalysée par une ferri-réductase [8].
Toujours chez E. Coli, un gène Fur (Ferric iron uptake regulation) code une protéine (fur repressor) qui réprime la transcription des gènes impliqués dans l'absorption du fer après qu'elle se soit liée à son co-répresseur, en l'occurence Fe(II). La métalloprotéine ainsi formée se fixe à l'ADN sur des séquences proches du promoteur des gènes contrôlés par Fur. Lorsque la concentration intracellulaire en Fe(II) s'abaisse en dessous d'un certain seuil, l'inhibition est levée et la synthèse des molécules impliquées dans la captation du fer, repart. Nous avons là un modèle moléculaire simple de régulation par boucle négative de l'absorption du fer en fonction des besoins de la cellule.
Chez l'homme, au cours des trente dernières années, de nombreuses protéines liant le fer ont été isolées, en général à partir de broyats d'intestin [9] ; certaines d'entre elles ont été identifiées récemment et leurs rôles respectifs suffisamment précisés pour que l'on puisse bâtir un modèle moléculaire de l'absorption intestinale du fer non héminique. Le fer apporté par l'alimentation est libéré au pH acide de l'estomac puis fixé dans un complexe par des mucines ; celles-ci sont des glycoprotéines captant plusieurs atomes de fer par molécule en le déplacant à partir d'autres complexes moins stables (histidine, fructose, ascorbate...) et maintenant le fer à l'état soluble malgré l'élévation du pH dans le duodénum. À la surface apicale de la cellule muqueuse intestinale, l'absorption est médiée par une intégrine, molécule appartenant à une famille de récepteurs membranaires [10]. Cette intégrine facilite le transfert intracellulaire du fer de la mucine vers un complexe intégrine-mobilferrine-flavine. La mobilferrine est une molécule de masse molaire (MM) 56 000 g.mol-1, présente dans la cellule intestinale, liant un atome de fer par molécule et dont la fonction a été décrite comme celle d'une véritable « navette » de transport du fer à l'intérieur de la cellule ; la flavine associée au complexe est une oxygénase qui réduit le fer à l'état ferreux [11]. À l'opposé, sur la face baso-latérale de la cellule, des récepteurs de la transferrine sont présents dans la bicouche lipidique membranaire ; le fer est déplacé de la mobilferrine vers la transferrine sérique, probablement avec le concours d'une intégrine encore non identifiée. Ainsi peut-on se représenter, au niveau moléculaire, l'absorption duodénale du fer depuis la lumière intestinale jusqu'au plasma, par une succession de transports d'une molécule moins affine vers une molécule plus affine à des pH donnés : mucine => mobilferrine => transferrine (figure 2).
Le fer héminique représente une forme particulièrement assimilable de fer alimentaire ; il pénètre dans la cellule muqueuse intestinale sous la forme de la métalloporphyrine soluble à pH alcalin dont le métal est libéré par une hème-oxygénase intestinale. Ce fer est ensuite transféré par la mobilferrine vers le compartiment circulant.

Transport plasmatique

Les transferrines constituent une classe de protéines liant le fer, existant chez beaucoup d'espèces vivantes, vertébrés et invertébrés compris [12].
La sérotransferrine humaine est une glycoprotéine monomérique, de masse moléculaire ~ 80 000 g.mol-1, migrant en électrophorèse avec les ß1-globulines ; sa synthèse a lieu essentiellement dans le foie, sa demi-vie plasmatique est d'environ une semaine et elle possède deux sites de fixation du Fe(III) caractérisés par des constantes différentes mais de très haute affinité (~ 10-22). Cette molécule dérive d'un ancêtre (- 500 MA) [13] à partir duquel, par duplication et mutations géniques, s'est développée la famille actuelle (sérotransferrine, lactoferrine) [14]. La structure complète (primaire, secondaire, tertiaire) de la sérotransferrine a été élucidée [15] : l'apotransferrine est déployée dans l'espace, formant deux lobes (domaines N et C) qui adoptent une conformation « ouverte » ; en présence de fer et d'ions carbonates, la molécule se replie autour de l'atome de métal en une conformation «fermée». La découverte d'un variant hétérozygote 394 (Gly => Arg) à affinité réduite pour son récepteur [16] et ne fixant qu'un atome de fer (domaine N fermé, domaine C ouvert) laisse penser que la conformation fermée participe aux conditions nécessaires de reconnaissance de la transferrine saturée par son récepteur cellulaire (figure 3).
Cette hypothèse stéréochimique donne une explication moléculaire de la fixation préférentielle de la transferrine di-ferrique qui est un fait connu depuis longtemps. Des variants altérant totalement la fonction de fixation du fer sont probablement incompatibles avec la vie. La transferrine peut d'ailleurs être considérée comme un facteur de croissance nécessaire pour des cellules malignes [17] ou pour des parasites [18]. Une importance relative est accordée aux chaînes glycosylées de la transferrine ; leur étude trouve des applications qui n'entrent pas réellement dans le cadre de notre sujet (désialo-transferrines et imprégnation oenolique).

La sérotransferrine, mono- ou di-ferrique, reste le transporteur majoritaire du fer dans le sérum, passage obligé entre les sites d'absorption et de mise en réserve, et les sites d'utilisation.

Passage intracellulaire

Pratiquement toutes les cellules des mammifères, et en particulier les cellules à taux de prolifération élevé, présentent à la surface de leurs membranes des récepteurs pour la transferrine (TfR) ; un réticulocyte peut ainsi incorporer 106 atomes de fer par minute grâce à ses 300 000 récepteurs. TfR est une molécule dimérique faite de l'enchaînement de 760 acides aminés (AA) avec un pont disulfure en position 101 [19] ; elle est ancrée dans la bicouche lipidique de la membrane cellulaire et comporte un domaine N-terminal intracytoplasmique de 61 acides aminés (figure 4). Le récepteur TfR et la transferrine Tf sont codés par des gènes situés sur le bras long du chromosome 3.
Schématiquement, on peut distinguer deux grandes familles de récepteurs membranaires : la première comprend des récepteurs qui, après fixation de leur ligand, transmettent une information qui va modifier le métabolisme de la cellule ; l'internalisation du récepteur n'est pas nécessaire (HCG, insuline, cytokines...) ; la deuxième, à laquelle appartient TfR, comprend des récepteurs qui migrent avec leur ligand à l'intérieur de la cellule (LDL, transcobalamine II...). Dans ce cas, le nombre de récepteurs présents à la surface peut être un facteur limitant, régulateur de l'entrée du ligand (la plupart des récepteurs ont une grande affinité pour leur ligand avec une KD ~ 10-9M ; on se rappelle que la constante de dissociation du complexe KD représente la concentration du ligand pour laquelle la moitié des sites de fixation est occupée).
Le gène codant pour TfR a été cloné et sa séquence est entièrement connue [20]. Un élément promoteur contrôlant la transcription du gène de structure de TfR a été identifié ainsi qu'un groupe de protéines nucléaires qui semblent se lier à lui. Des homologies de séquences trouvées entre les mRNA de Tf et de TfR et concernant seulement les parties extramembranaires de TfR, permettent de penser que celles-ci correspondent aux sites de liaison de Tf à son récepteur.
La comparaison de la constante KD citée plus haut (~ 10-9M) et de la concentration sérique de Tf (~ 2.10-5M) montre, par la simple application d'une loi d'action de masse, que les TfR doivent être en permanence saturés par leur ligand, celui-ci étant préférentiellement présenté sous sa forme « fermée » di-ferrique pour laquelle l'affinité est la plus grande au pH physiologique. C'est ce rapport de concentrations particulier qui permet d'envisager une régulation dépendante du nombre de TfR présents à la surface de la cellule.
Le passage dans le milieu intracellulaire du fer apporté par la transferrine se fait par un « cycle de la transferrine » mettant en jeu un mécanisme d'endocytose comparé par certains, d'une façon imagée, à un escalier roulant : le complexe Tf-TfR est internalisé par suite de l'invagination de la membrane cellulaire qui adopte une organisation en puits recouverts par une couche de molécules de clathrine [21]. L'invagination, se poursuivant, donne naissance en se refermant sur elle-même, à une « vésicule recouverte » qui perdra progressivement sa couche de clathrine (figure 5) ; la vésicule fusionne alors avec un endosome dont le pH ~ 5,5 facilite le détachement du fer du complexe Tf-TfR et son passage à l'extérieur de l'endosome où il est réduit à l'état Fe(II) puis mis « en attente », encagé dans des molécules de ferritine, ou utilisé pour la synthèse mitochondriale de molécules d'hèmes [15].
La vésicule, reformée, remporte alors le complexe apoTf-TfR vers la membrane cellulaire (exocytose) où il sera disponible pour débuter un nouveau cycle d'endocytose ; la liaison réversible de l'apotransferrine à son récepteur se faisant avec une affinité moindre à pH neutre, celle-ci peut être rapidement libérée dans le milieu extracellulaire. Dans le réticulocyte, un tel « cycle de la transferrine » se déroule en trois minutes environ [22].

Régulation de l'entrée du fer dans la cellule

De nombreux arguments expérimentaux montrent qu'une régulation de cette activité peut s'exercer par le biais d'un contrôle du nombre de TfR asservi aux besoins de la cellule. Les précurseurs érythroïdes, dans lesquels la synthèse de l'hémoglobine (Hb) est importante, lient de grandes quantités de Tf ; à l'opposé, les érythrocytes mûrs n'ont plus de TfR. Le fer lui-même intervient dans cette régulation, mais des molécules d'hème, libres, pourraient également exercer un contrôle. Des progrès importants dans la compréhension de ces mécanismes ont été accomplis : une séquence non codante très conservée, appelée IRE (pour Iron Responsive Element) a été identifiée à la fois à l'extrémité 5' du mRNA de la ferritine et à l'extrémité 3' du mRNA de TfR [23]. Elle a permis la découverte d'une protéine cytoplasmique de 98400 g.mol-1 qui se lie spécifiquement à elle et appelée IRF (pour Iron Regulatory Factor) [24] ; IRF agit comme un capteur moléculaire sensible aux variations de concentrations intracytoplasmiques du fer, analogue donc à la protéine FUR de E. Coli évoquée plus haut [25]. En outre, un même IRE existe à l'extrémité 5' du mRNA de la delta-amino-lévulinate synthase (delta-ALA synthase) qui est la première enzyme sur la voie de la synthèse de l'hème [26].
Des arguments autorisent à postuler que la protéine IRF existe sous deux conformations : à basse affinité pour IRE quand la concentration intracellulaire de Fe(II) est suffisante, permettant alors les synthèses de la ferritine et de l'hème ; à haute affinité pour IRE quand la concentration intracellulaire de Fe(II) tombe en dessous d'un certain seuil, bloquant alors la transcription des mRNA de la ferritine et de la delta-ALA synthase et permettant la synthèse du TfR en se liant à son messager, le protégeant contre une rapide dégradation. L'ensemble de ces interactions réalise une boucle de régulation par rétro-action négative destinée à assurer l'homéostasie martiale du milieu intérieur (figure 6) [27].
Ce schéma de régulation permet de compléter la vision microscopique de l'absorption intestinale du fer exposée plus haut : au pôle basal de la cellule muqueuse intestinale, une entrée de fer médiée par Tf, TfR dans le « cycle de la transferrine » a lieu comme pour toutes les cellules de l'organisme ; le fer libéré du complexe Tf-TfR est transféré à la mobilferrine et cette entrée de fer par le pôle basal pourrait bien être le « capteur » informant la cellule du statut martial de l'organisme ; en cas d'élévation du fer muqueux intestinal, le déclenchement d'une synthèse accrue de ferritine permettrait à la cellule de se soustraire aux effets toxiques qu'occasionnerait un excès de fer libre [28].

Mise en réserve du fer dans la cellule

Identifiée dès 1946 par Granick [29] comme la molécule assurant la fonction de réserve intracellulaire du fer, présente dans toutes les cellules de l'organisme des mammifères (et également d'autres ordres vivants), la ferritine est une molécule complexe, de MM ~ 440 000 g.mol-1, dont il existe de nombreux variants dans les tissus et dans le sérum (séroferritines). Ayant grossièrement la forme d'une sphère creuse aplatie de 120 x 80 Å, percée de « canaux » par où transitent de petites molécules, la ferritine contient à l'intérieur de sa cavité jusqu'à 4 500 atomes de fer sous forme d'un « cristal » de polyhydroxyphosphate ferrique. L'apoferritine est un assemblage de 24 sous-unités protéiques appartenant à deux types : H (pour Heart) et L (pour Liver), codées par des gènes situés respectivement sur les chromosomes 19 et 11. On peut donc imaginer une famille de molécules HnL24-n (0 <= n <= n 24) dont différents membres co-existent effectivement dans les tissus et dans le sérum. Principaux organes de réserve martiale, le foie et la rate ont des molécules de ferritine « basiques » comportant une majorité de sous-unités L ; les proportions s'inversent dans les ferritines « acides » du coeur ou du placenta. Le profil d'iso-électrofocalisation des ferritines sériques est normalement proche du profil hépato-splénique mais des distributions variables ont été signalées dans certaines situations pathologiques [30].

Les séquences et les conformations spatiales de ces molécules ont été déterminées [15]. L'établissement de la structure 3D a également montré que les canaux d'accès se répartissaient en deux groupes : canaux « polaires » et canaux « hydrophobes », voies de transit vers ou hors de la cavité interne pour des composants de nature différente [31].
Une autre espèce moléculaire intervient pour le stockage tissulaire lorsque l'organisme est en situation de saturation : l'hémosidérine dont la mise en évidence est obtenue facilement par la réaction de Perls. L'hémosidérine est une structure insoluble, de MM ~ 4.106 g.mol-1, faite principalement de formes dégradées de la ferritine ; elle peut être très riche en atomes de fer assemblés en différentes formations cristallines [32] ; le fait important est la faible disponibilité du métal qui pourrait correspondre à une réponse évolutive destinée à pallier le risque augmenté de peroxydation catalytique lorsque le fer est en excès dans l'organisme [33].
En raison de l'importance dynamique et quantitative du compartiment martial de réserve, il faut comprendre comment le fer apporté à la cellule y est déposé dans un cristal de polyhydroxyphosphate. La première étape doit être une réaction d'oxydoréduction Fe(II) => Fe(III) catalysée par un site ferroxydasique de l'apoferritine ; ceci permet l'amorce d'un noyau de cristallisation de Fe(III) qui croîtrait ensuite par voie autocatalytique [15]. L'entrée de Fe(II) se ferait par les canaux polaires, pour gagner les sites d'oxydation situés sur les sous-unités H [34].
Finalement, cette cascade d'événements explique la régulation initialement exercée par le nombre de TfR présents à un instant donné à la surface des cellules, sur la chaîne d'interactions moléculaires dont la finalité est l'assimilation du fer. En situation de surcharge cependant, d'autres voies d'entrée, non dépendantes de la transferrine et de ses récepteurs, peuvent être utilisées nopamment dans les hépatocytes [35].

Les dosages disponibles

La sidérémie

Décrit au début du siècle comme une fraction de fer circulant lié à une protéine autre que l'hémoglobine (la transferrine ne sera identifiée que beaucoup plus tard), le fer sérique a longtemps été au coeur des explorations biochimiques en hématologie. L'organisme gère de façon économe son pool de fer, en recyclant continuellement la quasi-totalité de ses atomes ; la sidérémie représente le « bruit de fond » de la récupération du fer lorsque l'hémoglobine des érythrocytes, arrivés au terme de leurs cent-vingt jours de durée de vie, est métabolisée. Dans des circonstances pathologiques (cytolyse, hémolyse, hémochromatose, histiocytose...), le fer sérique peut être lié à des molécules diverses (ferritines tissulaires, hémoglobine, protéines X...) mais à l'état physiologique et dans son acception première, le fer sérique désigne le fer lié à la transferrine. Comme tel, sa détermination isolée n'a aucun sens et doit toujours être accompagnée par celle de la transferrinémie.

La mesure de la sidérémie a été source de difficultés analytiques ; une méthode de dosage a été standardisée par l'ICSH. Elle est une méthode à laquelle on peut se référer mais comme telle, elle n'est guère utilisée en grande routine, le dosage étant maintenant assez bien maîtrisé sur la plupart des automates. Un cycle nycthéméral accusé peut cependant fausser l'interprétation des valeurs mesurées, maximales le matin, minimales le soir ; l'amplitude des variations atteint couramment 30 à 40 % mais parfois 200 % chez quelques rares individus ; les travailleurs habituels de nuit, avec repos diurne efficace, inversent leur cycle.

Les valeurs habituellement admises sont (intervalles pour 95 % des sujets témoins) :

  • Chez l'homme :
    • 9-30 mcmol.L-1
    • (0,5-1,75 mg.L-1)
  • Chez la femme :
    • 8-28 mcmol.L-1
  • Chez l'enfant : 1
    • 1-22 mcmol.L-1
  • (mcmol x 0,0558 => mg) (mc = micro)

Le dosage s'effectue sur sérum (environ 200 mcL) recueilli par prélèvement de sang veineux en tube sec, à 8 heures le matin. Sa réalisation demande quelques minutes ; elle est codifiée B 30 (B = 1,80 F), B 50 lorsqu'elle est accompagnée par la mesure de la capacité de fixation.

La transferrinémie

Ce dosage inclut de fait les calculs de la capacité totale de fixation du transporteur et, compte tenu de la sidérémie, de son coefficient d'occupation (capacité latente). On mesure la transferrinémie en quantifiant la protéine par méthode immunologique et non plus par l'intermédiaire de sa fonction de fixation d'un ajout de fer au sérum ; selon les recommandations de la SFBC, cette dernière méthode doit être abandonnée car très imprécise, non standardisée et sous-évaluant toujours la capacité de fixation de la transferrine. Déduites maintenant de la connaissance de la quantité pondérale de transferrine, la capacité de fixation et la capacité latente sont devenues des grandeurs théoriques calculées.
Dans le sérum, on trouve des molécules d'apotransferrines, de transferrines mono-ferriques et de transferrines saturées di-ferriques. L'ensemble de ces formes donne un coefficient global moyen de saturation habituellement de 20 à 40 % chez l'homme et de 15 à 35 % chez la femme. Les valeurs de la transferrinémie varient peu avec l'âge et le sexe, entre 2,4 et 3,8 g.L-1, ce qui correspond à des capacités totales théoriques de fixation du fer de 60 à 95 mcmol.L -1. Chez la femme en âge de procréer, la grossesse, la prise d'hormones à visée contraceptive (composante oe56;strogénique) sont des causes habituelles d'augmentation de la transferrinémie ; sa concentration sérique sera appréciée en fonction de l'existence ou non d'une pathologie hépatique (insuffisance hépatocellulaire), d'une maladie rénale (syndrome néphrotique entraînant une fuite protéique urinaire) ou d'un problème nutritionnel majeur (polycarence, oenolisme). Dans ce dernier contexte, la mesure des fractions désialylées de la transferrine (qui comporte normalement plusieurs chaînes glycosylées poly-antennées) présente un intérêt relatif : réservée à l'authentification biologique d'un oenolisme actif non avoué, elle n'entre pas dans le cadre de l'exploration martiale stricte.
Sa cotation B 50 est couplée avec celle de la sidérémie.

Le récepteur soluble de la transferrine

sTf-R dérive de la partie extramembranaire du récepteur de la transferrine. Il résulte d'un clivage protéolytique entre l'arginine en position 100 et la leucine en 101. Ce clivage a lieu postérieurement à l'ancrage du récepteur dans la membrane cellulaire [36].

De nombreux récepteurs possèdent une fraction soluble do
t le rôle physiopathologique en fait des paramètres en plein développement ; certains récepteurs solubles sont ainsi des inhibiteurs de l'action de leur ligand ou, au contraire, sont nécessaires à la manifestation de cette action. Tel ne semble pas être le cas de sTf-R : aucun rôle particulier ne lui a encore été reconnu. Des pronormoblastes aux érythrocytes, le nombre de Tf-R décroît et au cours de cette différenciation, les remaniements de la structure membranaire font que certaines protéines intrinsèques sont relarguées ; c'est ce mécanisme passif, sans autre finalité métabolique, qui est à l'origine des formes solubles de Tf-R. Celles-ci, néanmoins, représentent dans le sérum la richesse en Tf-R des précurseurs, richesse directement dépendante des besoins cellulaires en fer et des disponibilités correspondantes des réserves. Ainsi se justifierait l'intérêt analytique de ce paramètre dont l'élévation est le témoin sensible et précoce d'une carence martiale pouvant perturber l'érythropoïèse. Le dosage de sTf-R mesure à l'état physiologique, l'adéquation de la sécrétion d'érythropoïétine (Epo) régulée par la masse globulaire et agissant sur les précurseurs de la moelle. Ce dosage a donc une signification qui déborde du cadre du métabolisme martial, puisqu'il donne en fait une mesure quantitative de l'érythropoïèse [37].
Un dosage de sTf-R est disponible, techniquement satisfaisant (R & D System) ; par méthode ELISA en microplaques, on mesure la quantité de sTf-R, forme principale circulante, mais aussi des Tf-R intacts et des récepteurs liés à la transferrine.
Examen hors nomenclature ( ~ 100 F).

La ferritinémie

On mesure un mélange d'isoformes circulantes par une méthode radio ou enzymo-immunologique ; les molécules de ferritine, présentes à faible concentration dans le sérum, proviennent de cellules arrivées au terme de leur vie (cytolyses physiologiques) et de sécrétion par des monocytes macrophages ; elles sont glycosylées, contrairement aux molécules de ferritines tissulaires. Il existe un parallélisme d'évolution de la ferritinémie avec l'importance des réserves en fer de l'organisme. Cette relation peut être prise en défaut (faux positifs) dans un certain nombre de situations plus ou moins fréquentes : syndromes inflammatoires (la ferritine est une protéine inflammatoire), hépatopathie avec lyse cellulaire, tumeur maligne (la ferritine peut être un marqueur tumoral), maladie de Graves-Basedow (où l'on observe une élévation de la ferritinémie)...
La prise de fer, par quelque voie que ce soit, entraîne dans les heures qui suivent une augmentation de la ferritinémie non liée au pool de réserve (conséquence de la régulation traductionnelle de la synthèse de ferritine, placée sous le contrôle du fer). En cas de traitement martial, il sera prudent de respecter une fenêtre thérapeutique de huit jours précédant le prélèvement ; aucun cycle nycthéméral n'est à prendre en compte. Bien que standardisées au plan international, les méthodes utilisées donnent encore lieu à de grandes dispersions analytiques des valeurs surtout dans la gamme des concentrations élevées témoignant d'une surcharge.
On peut proposer les valeurs habituelles suivantes qui devront, chaque fois, être reprécisées en fonction de la technique de dosage utilisée (intervalles pour 95 % des sujets témoins) :

- Homme : 80-250 mcg.L-1
- Femme ménopausée : 50-120 mcg.L-1

Chez les femmes en âge de procréer, les carences martiales sont extrêmement fréquentes, concernant 60 à 70 % d'entre elles. C'est pourquoi la référence doit être la femme ménopausée chez qui les pertes physiologiques mensuelles de fer ont cessé. Cette remarque est importante : il y a peu d'exemples comparables où il est justifié de prendre les valeurs de référence dans un échantillon différent de celui étudié.
Il faut également faire ici définitivement justice à la notion de seuils diagnostiques de carence martiale latente ou patente, établis à 20 et 12 mcg.L-1 ; ces valeurs découlent des premiers résultats obtenus avec une technique particulière dans les années 1978-1980. Les valeurs à prendre en compte sont en fait à redéfinir par le biologiste en fonction de la technique qu'il utilise et en tenant compte de la remarque formulée plus haut.
L'examen est codifié B 70.

Les ferritines glycosylées

Une cytolyse hépatique qui s'accompagne du relargage de ferritines tissulaires dans la circulation est susceptible de rendre difficile l'interprétation de résultats élevés ; cette cytolyse peut être confirmée en procédant à l'évaluation du pourcentage de glycosylation. Les molécules de ferritines sériques sont glycosylées (normalement le pourcentage de glycosylation est voisin de 80 %) alors que les ferritines tissulaires ne le sont pas. En cas de cytolyse massive avec relargage de ferritines non glycosylées, le coefficient global de glycosylation s'abaisse nettement. Cette mesure, qui peut aider à démêler une situation complexe, ne fait pas partie des examens de première intention. Sa difficulté, son absence de standardisation, la sensibilité d'autres examens biologiques permettant d'authentifier une cytolyse, la font actuellement réserver à des laboratoires et à des cas particuliers.
Examen hors nomenclature.

Les ferritines érythrocytaires

Les ferritines dosées dans un hémolysat de sang total représentent la forme de stockage intracellulaire du fer avant son utilisation pour l'hémoglobinosynthèse.

Comme partout ailleurs dans l'organisme, il s'agit d'un mélange d'isoformes moléculaires avec toutefois une proportion plus importante que dans le sérum, d'isoformes acides [38]. Seules les formes basiques, analogues à celles du sérum, constitueraient les structures de réserve de l'érythrocyte et les formes acides ayant un pourcentage plus élevé de sous-unités H, ne participeraient pas à cette fonction. En fait, il apparaît de plus en plus évident que la ferritine possède d'autres fonctions en dehors du stockage du fer, assimilant ses sous-unités H « acides » à des cytokines régulant négativement la prolifération de certaines cellules [39].
Tout ceci a une conséquence pratique : les méthodes de dosage utilisées pour la mesure de la ferritinémie sont en général applicables aux ferritines érythrocytaires dès lors que l'on s'intéresse à la seule fonction de réserve intra-érythrocytaire assurée par les ferritines « basiques ». Leur concentration est le reflet d'un équilibre entre les entrées (l'apport de fer sous forme de di-ferri-Tf) et les sorties (l'hémoglobinosynthèse) ; une élévation des entrées non justifiée par des besoins accrus (hémochromatose), une utilisation défaillante (hémoglobinopathie) sans restriction des apports, auront pour conséquence une élévation de la concentration intracellulaire en ferritine.
En cas de carence d'apport ou d'utilisation accélérée (anémie hémolytique), des valeurs abaissées pourront être observées. Naturellement, cette variation sera un phénomène tardif qui fait de la mesure de la ferritine érythrocytaire un dosage de seconde intention (mais qui présente l'avantage de ne pas subir de fluctuations liées à un éventuel processus inflammatoire). En cas de surcharge, les valeurs mesurées constituent des arguments très discriminants, aidant par exemple à faire la part des responsabilités dans la surcharge d'une hémochromatose génétique et d'une consommation abusive de vin. Un exemple d'utilisation conjointe des ferritines sériques et intra-érythrocytaires est illustré figure 7 dans le cas d'une surveillance de désaturation par saignées itératives chez un sujet hémochromatosique ; l'effondrement de la ferritinémie précède la désaturation tissulaire : la charge en fer reste importante et nécessite la poursuite des phlébotomies tant que la ferritine intra-érythrocytaire ne s'est pas à son tour effondrée.
Afin de s'affranchir de l'influence que pourraient avoir sur l'expression des résultats, des variations du volume globulaire ou de l'hématocrite, on rapporte le contenu en ferritine à l'érythrocyte. Les calculs nécessitent :

* un comptage globulaire du sang total ;
* un dosage d'hémoglobine du sang total et de l'hémolysat (pour apprécier la dilution opératoire de l'échantillon) ;
* un dosage de ferritine de l'hémolysat.

Le résultat est exprimé en attogrammes (10-18 g) par érythrocyte ; les valeurs habituelles proposées sont (intervalles pour 95 % des sujets témoins) :

  • Homme
    • enfant : 2,8-24,0 attog/¢
    • adulte : 5,0-38,0 attog/¢
  • Femme :
    • 3,0-24,0 attog/¢

On remarque l'absence de valeurs basses chez la femme jeune contrairement à ce qui est observé avec les ferritines sériques.
Dosage non inscrit à la nomenclature.
Ces deux dosages de ferritine, sérique et érythrocytaire, apprécient des réserves en fer différentes :

* les séroferritines indiquent l'état des réserves martiales tissulaires ;
* les ferritines érythrocytaires indiquent l'état des réserves martiales immédiatement disponibles pour l'érythropoïèse.

Autres examens

Pour mémoire, parce qu'ils ne sont prescrits que dans des cas particuliers :

-Sidérurie des 24 heures : elle n'est utilisée que dans le suivi d'une élimination de fer après injection d'un chélateur (desferrioxamine).
- Fer tissulaire : « juge de paix » du diagnostic de surcharge ; prélèvement agressif, dosage difficile par laboratoire très spécialisé. Une information quantitative à peu près équivalente est fournie par l'imagerie hépatique (tomodensitométrie, IRM) mais celle-ci n'apporte pas les éléments d'étude histologique qui rendent cet examen irremplaçable.
- Protoporphyrines libres érythrocytaires : intéressantes en pédiatrie (microprélèvement) mais nécessitent un appareillage adapté qui, en France tout au moins, rend le développement de ce dosage difficile.
- Hémosidérine urinaire : pour documen-ter un dossier particulier.

En pratique : un souci d'efficacité dans la gestion budgétaire des analyses doit inciter à définir une stratégie de prescription, c'est-à-dire choisir quels paramètres seront demandés en première ou en deuxième intention, dans un cadre de diagnostic ou de suivi. En se limitant à quelques situations simples mais fréquentes, on peut proposer le tableau de la page suivante.
Ces quelques suggestions pourraient permettre par exemple, l'économie d'un grand nombre de mesures inutiles de la sidérémie.

CONCLUSION

Le métabolisme martial, dont l'étude biochimique a commencé il y a soixante-dix ans, n'est actuellement exploré que par la quantification de quelques protéines. Bien des étapes et des effecteurs moléculaires nous échappent encore. Certaines pathologies laissent entrevoir ce que sera demain l'étude complète de ce métabolisme ; on peut imaginer qu'il sera effectué par des examens stratifiés « en couches » de plus en plus profondes et spécialisées (Hématologie, n° 1, vol 1, p. 70).
C'est de l'étude de la pathologie que viendront certainement les progrès décisifs attendus, lorsque la quête du (des) gène(s) de l'hémochromatose, localisé dès 1975 sur le bras court du chromosome 6, aura abouti. Les gènes codant pour les protéines connues du métabolisme martial sont situés sur d'autres chromosomes (3, 11, 19, 9 pour Tf, ferritines H, L, protéine de liaison à l'IRE) ; par des méthodes de génétique de positionnement, plusieurs gènes candidats font l'objet d'une analyse structurale [40]. La chance aidant, une anomalie de l'un de ces gènes, constamment retrouvée chez les sujets atteints, permettrait d'identifier la protéine codée. La découverte de la fonction de celle-ci rendrait alors possible une (totale ?) compréhention des mécanismes régulateurs de l'entrée du fer dans l'organisme.
Des remarques intéressantes ont été faites récemment sur les mécanismes de contrôle de la synthèse de ferritine au cours de processus inflammatoires : la cytokine TNF* accroît le taux de transcription du mRNA de la sous-unité H de la ferritine dans de nombreuses lignées cellulaires. Elle régule négativement l'absorption du fer, probablement par une action sur une intégrine. Le gène du TNF* est situé sur le chromosome 6 ; il pourrait être un (des) élément(s) de contrôle du gène de l'hémochromatose idiopathique [41].
Chacune des nombreuses protéines que nous saurons caractériser est une cause potentielle de troubles par mutation, délétion... Dans un avenir sans doute proche, l'exploration biologique du métabolisme martial ne ressemblera plus beaucoup à ce qui a été entrepris voilà déjà presque trois quarts de siècle, avec le simple (mais difficile) dosage du fer sérique. Un nouveau chapitre est ouvert ; comme pour d'autres domaines de la biologie clinique, il est déjà et il sera moléculaire *

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