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Molecular basis of RH blood groups and Rhnull deficiency syndrome


Hématologie. Volume 3, Number 3, 207-20, Mai-Juin 1997, Mini-revues et revues


Résumé   Summary  

Author(s) : Jean-Pierre Cartron, Yves Colin.

Summary : The Rh blood group antigens are carried by a family of nonglycosylated hydrophobic transmembrane proteins of 30-32 kDa which are missing from the red cells of rare Rhnull individuals that exhibit several membrane defects. The Rh proteins (D and Cc/Ee, respectively) are encoded by two homologous genes RHD and RHCE (96 % sequence identity) tandemly organized on chromosome 1p34-p36, and which most likely derived by duplication of a common ancestral gene. The D and non-D proteins (417 amino acids) differ by 35 substitutions and exhibit a similar membrane topology with short hydrophilic loops connecting the twelve putative transmembrane helices. The molecular basis of the RH genes and proteins polymorphisms have been established by analysis of many common and rare variants. The presence or the absence of the RHD gene and of its product determined the basis of the Rh-positive and Rh-negative phenotypes, respectively, whereas amino acid polymorphisms at positions 103 and 226 of the RHCE gene product determined the molecular basis for the C/c (Ser Æ Pro) and E/e (Pro Æ Ala) specificities, respectively. Other polymorphisms occur by gene conversion between the two RH genes and by single point mutations. Comparative analysis of the immunological and molecular anomalies typical of partial D phenotypes (D-positive individuals that produce alloanti-D antibodies) provided a preliminary mapping of the D epitopes on the D polypyptide. Rhnull individuals suffer a clinical syndrome of varying severity and their red cells are characterized by abnormalities of the morphology, the function (cation transport) and the membrane phospholipid asymmetry. In addition to the Rh proteins, several other glycoproteins (Rh50, CD47, LW, GPB) are absent or severely decreased on these cells. These findings suggest that the Rh proteins are assembled by non covalent linkages into a complex with these glycoproteins. Molecular analysis indicate that most cases of Rh deficiency are caused by mutations within the gene encoding the Rh50 subunit. Further studies should clarify the trafficking, assembly and potential function of each component in this complex.

Keywords : blood groups, Rh antigens, D epitope mapping, red cell membrane, null phenotypes.

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ARTICLE

Le système de groupe sanguin Rh (Rhésus) joue un rôle important en médecine transfusionnelle. Historiquement, l'identification de ce système fut associée à la première description de l'incompatibilité foeto-maternelle responsable de la maladie hémolytique du nouveau-né [1, 2]. C'est aussi, à cause de l'immunogénicité des antigènes, le système le plus répandu de typage sanguin avec le système ABO. Les antigènes Rh sont également les cibles fréquentes des auto-anticorps produits chez plus de 30 % des malades atteints d'anémie hémolytique auto-immune [3]. La fonction des protéines Rh est encore inconnue, mais certaines manifestations cliniques caractéristiques du « syndrome de déficience Rh » ou syndrome Rhnull [4, 5] suggèrent que ces antigènes seraient impliqués dans le maintien des propriétés structurales et fonctionnelles de la membrane des érythrocytes. Le système RH est complexe et très polymorphe [6]. Parmi les 49 antigènes sérologiquement identifiés, on distingue l'antigène majeur D. Selon sa présence ou son absence sur la membrane des érythrocytes, les cellules sont dites Rh-positives (pour D-positives) ou Rh-négatives (pour D-négatives). Le phénotypage Rh courant comprend, en plus de l'antigène D, la détermination systématique des antigènes C, c, E et e. La présence de certains autres antigènes n'est recherchée que plus rarement.

Des travaux récents ont permis de déterminer la structure et l'organisation membranaire des gènes et des protéines Rh et d'établir la base de leur polymorphisme. Les études actuelles visent à préciser leur fonction potentielle et à comprendre la nature moléculaire des altérations entraînant des anomalies morphologiques et fonctionnelles des cellules qui présentent un déficit total ou partiel de ces structures [7-9].

Syndrome Rhnull

Les hématies de phénotype Rhnull sont dépourvues de tous les antigènes Rh connus, ce qui les différencient des hématies Rh-négatives chez lesquelles seul l'antigène D est absent. Les études familiales ont montré que ce phénotype très rare peut survenir dans deux circonstances génétiques distinctes [6]. Le type « amorphe » est causé par l'homozygotie pour un allèle silencieux au locus RH. Le type « régulateur » résulte de l'homozygotie d'un gène autosomique suppresseur (Xor) qui est indépendant du locus RH. Un hypothétique allèle (XQ) à ce locus pourrait être responsable du phénotype Rhmod exprimant des quantités résiduelles d'antigènes Rh. Le type régulateur est le plus fréquent et représente environ 80 % des cas répertoriés de phénotypes Rhnull.

Tous les types de déficit Rh conduisent à des anomalies hématologiques similaires [4, 5]. On note une anémie hémolytique chronique de sévérité variable et une réduction de la durée de vie des hématies. On observe aussi une stomato-sphérocytose, une fragilité osmotique augmentée et une perméabilité cationique augmentée (transports actifs et passifs de K) [10]. La splénectomie dans les formes sévères conduit à une nette amélioration clinique avec une survie normale des érythrocytes bien qu'une faible hémolyse résiduelle puisse persister. Les membranes Rhnull présentent également un certain nombre d'anomalies biologiques. Il existe une hyperactivité des Na-K et Mg ATPases membranaires, et le contenu des érythrocytes en cations et en eau est diminué [11]. Le taux de cholestérol membranaire est relativement abaissé. De plus, ces cellules présentent une altération de l'asymétrie des phospholipides membranaires, caractérisée par une augmentation de la capacité d'échange de la phosphatidylcholine et une accessibilité accrue de la phosphatidyléthanolamine à l'hydrolyse par les phospholipases exogènes, suggérant une augmentation du mouvement passif des phospholipides à travers la bi-couche phospholipidique [12]. Enfin, il existe de multiples anomalies de protéines membranaires (décrites plus loin). La similarité clinique et biologique entre le déficit Rh et la sphérocytose héréditaire a déjà été observée [8], mais classiquement les deux syndromes diffèrent par leurs modes de transmission, respectivement récessif et dominant. Cependant, des études récentes suggèrent que la sphérocytose héréditaire est hétérogène aussi bien cliniquement qu'en termes de ses bases moléculaires et génétiques [13, 14]. Le syndrome de déficit Rh pourrait donc être considéré comme une forme récessive de cette maladie. Par ailleurs, il est intéressant de noter qu'une diminution d'expression (50 %) de l'antigène majeur du système RH (antigène D) a été notée chez des malades atteints de sphérocytose héréditaire [15].

Les érythrocytes d'individus Rhnull et de patients atteints de stomatocytose héréditaire qui présentent aussi des anomalies biologiques comparables ont des défauts moléculaires distincts. Dans la stomatocytose héréditaire, les érythrocytes possèdent des polypeptides Rh normaux mais sont dépourvus de protéines membranaires 7.2b (stomatine) alors que les érythrocytes de sujets Rhnull ne possèdent pas de protéines Rh mais expriment des quantités normales de protéine 7.2b [16].

Structure et polymorphisme du locus RH

Les toutes premières études concernant la biochimie des antigènes Rh avaient établi plusieurs propriétés importantes de ces molécules, en particulier :
1) le rôle des phospholipides et de groupes thiols libres dans l'expression antigénique D et C ;
2) la nature hydrophobe des molécules impliquées ;
3) leur poids moléculaire apparent de 30-32 kDa ;
4) l'absence de glycosylation et
5) l'association probable avec le squelette membranaire [pour revue, voir 17]. Les connaissances actuelles sur ces molécules reposent largement sur des données de la biologie moléculaire [7-9] et ne seront que brièvement résumées, sans respecter leur ordre chronologique.

Gènes et protéines

La structure du locus RH a été déterminée principalement dans la population caucasienne (figure 1). Chez les sujets de phénotype D-positif, le locus est composé de deux gènes homologues étroitement liés (RHD et RHCE ; 96 % d'identité), localisés sur le chomosome 1p34-p36, dont l'organisation est similaire (10 exons s'étendant sur 75 kb d'ADN) [18, 19]. Ces gènes forment un haplotype et sont transmis ensemble de génération en génération. Ils résultent sans doute de la duplication d'un gène ancestral. Chez les sujets de phénotype D-négatif, l'haplotype RH ne comporte qu'un seul gène (RHCE) [18]. Exceptionnellement, surtout dans les populations non caucasiennes où le phénotype Rh-négatif est très rare, c'est le gène RHD d'un haplotype Rh-positif qui est inactivé (délétion partielle ou remaniement). Les gènes RHD et RHCE codent des protéines membranaires palmitoylées mais non glycosylées de 417 acides aminés, comportant 12 domaines transmembranaires et dont les extrémités N- et C-terminales sont intracytoplasmiques (figure 1). Cette organisation rappelle celle de transporteurs ou de canaux et s'accorde bien avec un rôle potentiel de ces protéines dans des mécanismes de transport. Les protéines D et non-D sont exprimées exclusivement à la surface des érythrocytes. Elles sont relativement abondantes (100-200 x 103 copies/cellules) et diffèrent par 35 substitutions en acides aminés.

Bases moléculaires des polymorphismes C/c et E/e

Le séquençage des transcrits présents dans les réticulocytes et les analyses de l'ADN génomique ont permis d'établir les bases moléculaires des spécificités antigéniques courantes C, c, E et e [20]. Le polymorphisme E => e résulte d'une substitution proline => alanine en position 226, causée par une mutation ponctuelle dans l'exon 5 du gène RHCE (figure 1). Le polymorphisme C => c résulte d'une substitution sérine => proline en position 103, causée par une mutation ponctuelle dans l'exon 2 du gène RHCE. Tous les épitopes Rh sont de nature conformationnelle ; ils sont détruits lors de l'extraction des protéines. Des études menées chez les primates (singes), dont certains seulement expriment l'antigène Rhc, indiquent que la proline en position 102 joue un rôle essentiel dans la définition de l'épitope c [21].

Bases moléculaires du polymorphisme D

La présence ou l'absence de la protéine D (produit du gène RHD) détermine la base moléculaire des phénotypes Rh-positif (D-positif) et Rh-négatif (D-négatif). Les protéines D et CE diffèrent par 35 substitutions en acides aminés, mais laquelle (lesquelles) de ces positions rend (rendent) compte de la spécificité antigénique D reste difficile à établir. En effet, l'antigène D est complexe, car il est composé d'une mosaïque d'épitopes, dont au moins neuf (epD1 à epD9) ont été définis à l'aide d'une batterie d'anticorps monoclonaux [22]. Certains sujets de phénotype D-positif peuvent produire un alloanticorps anti-D dirigé contre un ou plusieurs épitopes manquants, définissant ainsi les phénotypes « D partiel » (DIIIb, DIVa, DIVb, DVa, DVI, DVII, DFR, DBT, DHar, HMi, HMii, DNU, DHR), que l'on distingue selon la présence ou l'absence d'un ou plusieurs des épitopes D.

L'analyse moléculaire de ces variants a montré que la perte d'expression de certains épitopes D est associée soit à des réarrangements, soit à des mutations ponctuelles du gène RHD (tableau I). Par un mécanisme de double crossing-over ou de conversion génique, un fragment du gène RHD (différent pour chaque catégorie de D partiel) est remplacé par le fragment génomique correspondant du gène RHCE, créant ainsi un ensemble de gènes hybrides RHD-CE-D [23]. Ces gènes remaniés produisent des protéines hybrides D-CE-D de 417 acides aminés ne conservant que certains des épitopes D, mais pouvant occasionnellement exprimer de nouveaux épitopes détectables sérologiquement (spécificités antigéniques Rh23, Rh30, Rh32, Rh40, Rh50, Rh52). Le phénotype DHar est particulier, car il résulte d'un gène hybride RHCE-D-CE dans lequel l'exon 5 du gène RHCE, provenant d'un haplotype Rh-négatif, est remplacé par l'exon 5 du gène RHD (tableau II). La protéine hybride correspondante exprime (faiblement) certains épitopes D (epD5, 6/7).

Chez les phénotypes D partiels qui résultent de mutations ponctuelles dans le gène RHD (tableau I), il est intéressant de noter que certaines mutations ne correspondent pas à l'une des 35 substitutions permettant de différencier les protéines D et non-D, ce qui ajoute encore à la complexité des antigènes.

Cartographie des épitopes D

L'analyse comparative des protéines mutantes chez les variants D partiels a permis de proposer un modèle (figure 2) permettant de corréler les positions polymorphes D localisées dans les boucles extracellulaires de la protéine D avec les principaux épitopes D définis par l'analyse de « cluster » à l'aide des anticorps monoclonaux anti-D [23]. Deux caractéristiques importantes révèlent la nature conformationnelle des épitopes D : 1) une même mutation affecte plusieurs épitopes, définissant ainsi des motifs antigéniques chevauchants (ex. : position 350 des épitopes D1, D2, D3, D9) ; 2) des mutations situées sur des boucles adjacentes ou non adjacentes de la protéine D définissent un même épitope (ex. : épitopes D2 et D8). De telles interactions ne peuvent pas être précisées en l'absence d'un modèle de structure tridimensionnelle des protéines Rh.
Le modèle présenté est utile pour une approche préliminaire de la relation structure-activité, mais il doit être considéré avec prudence, car des altérations ou des mutations non prises en compte (dans les boucles intracellulaires ou les domaines transmembranaires) pourraient aussi induire des effets à distance sur la conformation de la protéine D, comme cela a été documenté dans d'autres systèmes (apolipoprotéine E2 et ATIII) [24, 25], et faire apparaître certains épitopes et/ou disparaître certains autres. En outre, l'utilisation d'un large panel d'anticorps monoclonaux anti-D a permis récemment de définir au moins 30 groupes de spécificité (« clusters »), suggérant une diversité supplémentaire des épitopes epD5 à 7 et l'existence de plusieurs épitopes non identifiés auparavant [26, 27]. Au plan expérimental, la validation de ce modèle par mutagenèse dirigée devrait être réalisable en partie grâce à la mise au point d'un système d'expression des protéines Rh dans des lignées érythroïdes (exprimant la protéine Rh50, voir plus loin) transduites par des constructions rétrovirales appropriées [28], alors que les tentatives initiales par transfection avec des vecteurs plasmidiques avaient échoué [29]. Cependant, comme des mutations non prédictibles sur la base de nos connaissances du polymorphisme des protéines D et non-D ont été observées chez certains mutants naturels (tableau I), il est à craindre qu'une telle approche ne permette d'explorer qu'en partie la complexité des structures antigéniques D. La caractérisation d'autres mutants naturels reste donc nécessaire.

Autres polymorphismes

D'autres variants rares présentant une anomalie qualitative ou quantitative des antigènes Cc et/ou Ee ont été analysés afin d'établir leurs bases moléculaires [30-35]. Souvent, on peut identifier des gènes RHCE réarrangés codant des protéines hybrides CE-D-CE ayant perdu tout ou partie des antigènes Cc et/ou Ee (tableau II). L'expression d'épitopes D par de tels polypeptides est rarement analysable car les réarrangements surviennent le plus souvent dans un haplotype Rh-positif comportant un gène RHD fonctionnel. Des mutations ponctuelles du gène RHCE ont aussi été décrites (tableau II). La cartographie des épitopes présents sur la protéine CE (figure 3) est moins avancée que celle des épitopes D, sans doute faute d'un nombre suffisant d'anticorps monoclonaux. Les antigènes Cc/Ee sont également dépendants de la conformation. Par exemple, les mutations G96S (Rh26) et L245V (Rh20) localisées dans les domaines intramembranaires réduisent respectivement l'expression des antigènes c et e, et la palmitoylation de la cystéine C16 pourrait moduler l'expression antigénique C et Cw [30].

Mécanismes moléculaires des réarrangements

Les études précédentes suggèrent que le polymorphisme génétique du locus RH, qui engendre une très large diversité des phénotypes, repose en grande partie sur des mécanismes de double crossing-over ou de conversion génique (échange intergénique non réciproque). Les limites exactes des réarrangements qui surviennent dans la formation des gènes hybrides ne sont pas connues, et l'on ignore dans la grande majorité des cas si ces événements surviennent dans des séquences répétées ou des « points chauds » de recombinaison. Cependant, des travaux récents ont révélé que le point de cassure en 5' des gènes hybrides est identique chez certains variants, constituant un « point chaud » de recombinaison (250 pb) comprenant une séquence Alu S. Le point de transition se trouve soit dans l'intron 3 du gène RHD (transition D-CE des variants DVI et DFR), soit dans l'intron 3 du gène RHCE (transition CE-D des variants Dc- et RN) [36]. Chez des sujets de phénotype D &endash; &endash;, un autre « point chaud » (4,2 kb) comprenant de nombreux éléments répétés (Alu, MIR, co-polymère [(AC).(TG)]) a été caractérisé autour de l'exon 2 des gènes RH [37].

Polypeptides associés aux protéines Rh

L'étude des phénotypes Rhnull a révélé une complexité inattendue des antigènes Rh. En effet, les érythrocytes Rhnull présentent non seulement un défaut d'expression des antigènes Rh, mais aussi des antigènes LW et Fy5. De plus, l'expression des antigènes Ss, U et Duclos est réduite [38]. Les études complémentaires menées par immunoprécipitation et Western blot, principalement à l'aide d'anticorps monoclonaux, ont clarifié la nature biochimique de la plupart de ces antigènes et ont révélé que d'autres protéines (Rh50, CD47) sont également absentes ou sévèrement réduites sur les érythrocytes Rhnull. Les principales propriétés de ces protéines sont résumées dans le tableau III et leur structure schématique est indiquée dans la figure 4.

Glycoprotéines Rh50

Moore et Green [39] ont montré les premiers, par des techniques d'immunoprécipitation avec des anticorps polyclonaux, que les protéines Rh sont associées à des glycoprotéines de 45-100 kDa et 30-65 kDa portant des déterminants de groupe sanguin ABO. Ces glycoprotéines, appelées maintenant « Rh50 » (taille moléculaire moyenne 50 kDa), ne se trouvent que sur des cellules d'origine érythroïde et peuvent être détectées par l'anticorps monoclonal murin 2D10. Elles sont absentes des hématies Rhnull U-négatif mais s'expriment faiblement à la surface des érythrocytes Rhnull U-faible [40, 41].

L'ADNc codant la protéine Rh50 a été cloné à partir des informations déduites de sa séquence protéique N-terminale [42]. Il code un polypeptide de 409 acides aminés possédant une homologie substantielle de séquence (40 %) avec les protéines Rh et une structure secondaire semblable, comprenant 12 segments hydrophobes en hélice alpha (domaines transmembranaires) (figure 4). Parmi les trois sites consensus de N-glycosylation (Asn-37, 274 et 355), seule la position Asn-37 semble N-glycosylée par une longue chaîne oligosaccharidique (responsable de la réactivité AB0) contenant des unités répétitives de N-acetyllactosamine. La glycoprotéine Rh50 possède cinq cystéines (Cys-237, 250, 286, 328 et 396) dont les positions ne sont pas conservées quand on les compare à celles des protéines Rh ; de plus, elles ne sont pas retrouvées dans le contexte de motifs Cys-Leu-Pro assimilés à des signaux de palmitoylation des protéines Rh. Des études développées à l'aide d'anticorps anti-peptides ont montré que les extrémités N- et C-terminales de Rh50 sont intracellulaires, et seraient comprises dans deux domaines structuraux, contenant chacun six hélices transmembranaires, séparés par un site de clivage trypsique (Lys-196) présent dans la troisième boucle intracellulaire [43]. Les protéines Rh auraient une organisation semblable [44]. Le gène RH50 a été localisé sur le chromosome 6, en position 6p12-p21. Les gènes RH et RH50 dérivent vraisemblablement d'un gène ancestral commun, mais seuls les produits du locus RH (D et CE) produisent des protéines dotées d'une spécificité antigénique Rh.

CD47

La glycoprotéine CD47 (47-52 kDa) a d'abord été détectée sur des érythrocytes normaux à l'aide d'un anticorps monoclonal murin (BRIC125), mais sa distribution tissulaire est beaucoup plus large [45]. Elle s'étend en particulier aux autres cellules hématopoïétiques [46], ainsi qu'aux cellules épithéliales et mésenchymateuses de nombreux tissus ; elle est aussi abondante dans le cerveau. La purification et le séquençage partiel de la protéine reconnue par l'anticorps BRIC125 ont permis de montrer qu'elle était identique à la protéine IAP (integrine associated protein), fonctionnellement et physiquement associée à des intégrines b3 (récepteur de la vitronectine avb3) présentes sur les plaquettes, les polynucléaires neutrophiles et les cellules endothéliales [45], ainsi qu'à la protéine OA3 abondamment représentée dans des tumeurs de l'ovaire [47]. Le clonage de l'ADNc codant les protéines OA3 et IAP a permis de confirmer l'identité de ces protéines [47, 48]. BRIC125, IAP et OA3 définissent donc la même entité moléculaire, dont l'expression est réduite sur les érythrocytes Rhnull, mais reste normale sur les autres cellules du sang périphérique de ces sujets [49]. Le gène IAP a été localisé sur le chromosome 3q13 dans une région contenant le gène codant une protéine reconnue par l'anticorps monoclonal 1D8, dont l'expression est phénotypiquement associée aux antigènes Rh [50]. Comme 1D8 réagit aussi avec des transfectants IAP, il est clair que BRIC125, IAP, OA3 et 1D8 définissent la même molécule que l'on désigne maintenant sous la terminologie CD47 [48]. La protéine CD47 comporte un domaine « Ig-like » dans sa région N-terminale et représente un nouveau membre de la superfamille des immunoglobulines. Elle est composée d'une chaîne polypeptidique comprenant 323 acides aminés incluant un peptide signal de 18 résidus, six motifs consensus de N-glycosylation et cinq domaines hydrophobes transmembranaires (figure 4).

La protéine CD47 (IAP) est fonctionnellement associée à des intégrines b3 et serait responsable du flux de calcium intracellulaire lors de l'activation des neutrophiles et des cellules endothéliales par contact avec des protéines de la matrice extracellulaire (vitronectine, fibronectine) [51]. Des travaux récents ont montré qu'elle représente aussi un nouveau récepteur pour le domaine C-terminal de la thrombospondine (TSP), tout en maintenant son association avec les intégrines b3 [52]. Elle est également impliquée dans la migration transendothéliale (diapédèse) des granulocytes [53], un processus essentiel de la défense anti-infectieuse permettant l'accumulation des polynucléaires sur les sites de l'inflammation, et dans lequel sont impliqués aussi une intégrine b présente sur les leucocytes et la molécule PECAM-1 des cellules endothéliales. La stimulation de la motilité cellulaire par le CD47 mettrait donc en jeu des mécanismes de signalisation intracellulaire médiés soit par des intégrines soit par stimulation via la liaison à la thrombospondine.

Chez l'homme, on ne connaît pas de déficit en CD47, à l'exception de la réduction sévère mais sélective du taux de CD47 érythrocytaire des hématies Rhnull. L'inactivation du gène chez la souris révèle que les animaux déficients CD47&endash;/&endash; se développent normalement, sont fertiles et ne présentent aucune anomalie détectable de leurs organes [54]. Cependant, les animaux ont une résistance très diminuée aux infections bactériennes résultant de graves défauts fonctionnels des granulocytes, en particulier l'incapacité de lier les ligands des intégrines b3 (malgré la présence en quantité normale des intégrines), l'absence d'activation des mécanismes oxydatifs, et la réduction de la phagocytose dépendante des récepteurs Fc. Le CD47 joue donc un rôle essentiel dans les mécanismes de défense en participant à la fois aux mécanismes de migration des polynucléaires et à leur activation sur les sites inflammatoires.

Le rôle de CD47 sur les érythrocytes qui n'expriment aucune intégrine connue n'est pas déterminé. L'expression sévèrement diminuée sur les érythrocytes Rhnull pourrait contribuer aux anomalies de flux ioniques décrits dans le syndrome de déficience Rh [48].

LW

Les antigènes Rh et LW (Landsteiner-Wiener) ont été découverts simultanément et ont été longtemps confondus. Ces deux antigènes sont phénotypiquement associés puisque, d'une part, le niveau d'expression de LW est plus important chez les sujets de phénotype D-positif que chez les sujets D-négatif et, d'autre part, les antigènes LW sont portés par une glycoprotéine de 37-42 kDa absente des érythrocytes Rhnull.

Le clonage de l'ADNc codant LW [55] a permis d'établir que LW est distinct de D et que ces deux antigènes sont codés par des gènes dépourvus d'homologie, localisés sur des chromosomes différents (19p13 et 1p34, respectivement). La protéine LW est une chaîne polypeptidique de 270 acides aminés (dont 29 dans le peptide signal) comportant un seul domaine transmembranaire et quatre sites potentiels de N-glycosylation ; en outre, l'extrémité N-terminale comporte deux domaines « Ig-like », signant son appartenance à la superfamille des immunoglobulines (figure 4). La comparaison des séquences a révélé une importante homologie avec les molécules d'adhésion intercellulaire (ICAM). En accord avec ces prédictions, il a été montré récemment que LW se lie in vitro avec les intégrines LFA-1 (CD11a/CD18) et Mac-1 (CD11b/CD18) et que les anticorps monoclonaux anti-CD18, -CD11a, -CD11b et anti-LW inhibent ces interactions [56]. La protéine LW a donc été rebaptisée ICAM-4.

L'expression de ICAM-4 est restreinte à la lignée érythroïde, mais son rôle fonctionnel n'est pas connu. À cause de ses capacités de liaison à des intégrines, il pourrait intervenir d'une part dans la maturation des précurseurs érythroïdes ou la sénescence des globules rouges, et d'autre part dans la formation des rosettes avec les hématies parasitées par P. falciparum (qui sont impliquées dans la cytoadhérence à l'endothélium vasculaire) que l'on rencontre dans les formes cérébrales du paludisme.

Glycophorine B

La glycophorine B (GPB) est le support des antigènes Ss dont l'expression est réduite de 70 % environ sur les cellules Rhnull [57]. La détection d'une faible quantité de glycoprotéine Rh50 sur les érythrocytes de phénotype Rhnull U-faible mais pas sur ceux de phénotype Rhnull U-négatif (déficient en GPB) suggére que l'antigène U pourrait être le produit de l'interaction entre les glycoprotéines Rh50 et GPB [41]. La glycophorine B est une glycoprotéine de 72 acides aminés bien caractérisée, codée par un gène appartenant à une petite famille multigénique (glycophorines A, B et E) localisée sur le chromosome 4q28-q31 qui code les deux principales glycoprotéines riches en acides sialiques de la membrane du globule rouge [58, 59].

Duffy

Bien que les érythrocytes Rhnull expriment les antigènes Duffy (Fy) communs (Fya/Fyb, Fy3, Fy6), ces érythrocytes ne réagissent pas avec l'antisérum anti-Fy5. La base moléculaire de l'antigène Fy5 n'est pas connue, mais il est possible que Fy5 représente un épitope conformationnel qui requiert la présence des protéines Rh pour son expression. Une hypothèse similaire a été proposée pour les antigènes Wrb et U qui résultent probablement, pour le premier de l'interaction de la GPA et de la Bande 3 [60], et pour le second de l'interaction de la GPB et des glycoprotéines Rh50 (voir ci-dessus).

La protéine Fy possède un double rôle biologique. C'est à la fois le récepteur érythrocytaire de Plasmodium vivax et P. knowlesi [les hématies Fy(a-b-) sont réfractaires à l'invasion], et le récepteur de peptides chimiotactiques (IL-8, MGSA, RANTES, MCP-1) impliqués dans le recrutement de cellules immunitaires sur les sites inflammatoires [61, 62]. À cause de ces propriétés, la protéine Fy est aussi connue sous le sigle DARC (duffy antigen/receptor for chimiokines). Le clonage de l'ADNc [63] a confirmé l'homologie avec les récepteurs de l'IL8 et l'analogie structurale avec la superfamille des récepteurs à sept domaines transmembranaires liant les protéines G. Cependant, la protéine Fy ne semble pas être contrôlée par les protéines G ni transmettre un signal calcique dans les cellules transfectées [62, 64]. La protéine Fy possède 338 acides aminés, deux sites de N-glycosylation potentiels et dix cystéines pouvant expliquer la tendance de cette protéine à former des oligomères (figure 4).

Des formes non érythrocytaires de l'antigène Fy ont été mises en évidence, principalement dans les cellules endothéliales des veinules post-capillaires de nombreux tissus [65], mais aussi dans d'autres endothéliums (glomérules, vasa recta) ainsi que dans des cellules épithéliales (tubules collecteurs du rein) et certaines cellules nerveuses (cellules de Purkinje du cervelet) [66, 67]. La protéine Fy érythrocytaire pourraît être impliquée dans la clairance des peptides chimiotactiques circulants alors que celle des cellules endothéliales postcapillaires pourrait, en concentrant localement les chimiokines, faciliter le recrutement des leucocytes. Son rôle dans le complexe Rh est inconnu.

On sait maintenant que certains récepteurs de chimiokines sont des cofacteurs indispensables à l'entrée du VIH dans les lymphocytes (CXCR4, fusine) et les macrophages (CCR5). La protéine Fy ne possède pas cette propriété.

Assemblage membranaire des polypeptides Rh

Le complexe membranaire Rh

Les hématies Rhnull sont caractérisées par des anomalies protéiques multiples (tableau III). L'hypothèse la plus vraisemblable est que les protéines Rh existent dans la membrane érythrocytaire sous forme d'un complexe non covalent avec d'autres protéines (Rh50, CD47, LW, GPB) codées par des gènes distincts et qui sont toutes collectivement absentes (ou très sévèrement diminuées) chez les sujets Rhnull (figure 4). Il est possible que l'absence de l'une des protéines du complexe empêche son assemblage et/ou son transport à la surface cellulaire, ce qui pourrait conduire aux anomalies caractéristiques des cellules Rhnull [7-9]. Une situation analogue est bien connue pour d'autres modèles biologiques (récepteur T, récepteurs plaquettaires gpIIb-IIa et complexe gpIb-IX-V, complexe dystrophine, etc.). Le complexe Rh pourrait jouer un rôle important dans l'architecture membranaire elle-même en contrôlant les propriétés élastiques et mécaniques des cellules (interaction avec le squelette membranaire) ou en formant une structure de pore douée de propriétés de transports ioniques et/ou de régulation de l'asymétrie des phospholipides membranaires, fonctions qui sont altérées dans le syndrome Rhnull. L'étude de la structure, de l'assemblage et de la fonction du complexe Rh représente donc une étape essentielle dans la compréhension du syndrome Rhnull.

Les principales sous-unités du complexe Rh (Rh50, CD47, LW, GPB) ont été identifiées (tableau III), mais il n'est pas exclu que d'autres protéines de ce complexe restent à caractériser. Laquelle ou lesquelles de ces protéines jouent un rôle critique dans la formation du complexe ? Il est généralement admis que les polypeptides Rh (D+CcEe) jouent un rôle important puisque le complexe est absent ou très sévèrement diminué lorsque ces protéines sont absentes. Cependant, ni la protéine D elle-même, ni les protéines Cc/Ee seules, ne sont critiques puisqu'elles sont respectivement absentes des érythrocytes de phénotype Rh-négatif et D &endash; &endash;, qui ne présentent aucune anomalie membranaire. De même, les érythrocytes déficients en GPB [phénotype (S-s-U-)], en glycoprotéine LW [phénotype LW(a-b-)] ou en protéine Fy [phénotype Fy(a-b-)] ne sont pas déficients en antigènes Rh. Au contraire, on ignore si des érythrocytes sélectivement déficients en protéines Rh50 ou CD47 (qui n'ont pas été décrits) peuvent ou non exprimer des antigènes Rh.

Arguments en faveur du complexe Rh

Des observations indirectes plaident en faveur de l'existence du complexe Rh, en particulier :
1) le déficit de plusieurs glycoprotéines non apparentées à la surface des hématies Rhnull ;
2) la co-précipitation des glycoprotéines Rh50 avec des anticorps anti-Rhc, D ou E polyclonaux ; 3) la co-précipitation des antigènes Rh avec des anticorps monoclonaux murins (LW, R6A, Rh50) et 4) les variations de glycosylation de Rh50 sur les érythrocytes Rhnull de type U-faible et sur les érythrocytes S-s- (U-neg ou U-faible), suggérant que le temps de transit de Rh50 dans le Golgi est modifié selon la présence ou l'absence des protéines Rh ou de la glycophorine B. Celle-ci faciliterait donc le transport de la protéine Rh50 vers la surface cellulaire, tandis que les protéines Rh ralentiraient son transit [68]. Les protéines Rh, Rh50 et la glycophorine B établissent donc des interactions pendant leur synthèse in vivo. Par analogie, on suppose que la protéine D pourrait faciliter l'expression cellulaire de LW puisqu'il y a plus d'antigènes LW (4 400 contre 2 800 molécules/cellules) sur les érythrocytes D-positif que sur les érythrocytes D-négatif chez l'adulte. Du fait de ces interactions protéiques, certains déterminants antigéniques Rh pourraient être partagés par les sous-unités du complexe Rh.

En se basant sur des analyses hydrodynamiques de membranes solubilisées en triton X-100, la taille du complexe Rh a été estimée à 170 kDa [69]. La composition exacte du complexe n'est pas connue, mais le coeur pourrait être constitué d'un tétramère comportant deux sous-unités Rh et deux sous-unités Rh50 [68], auquel seraient associées les chaînes accessoires CD47, LW et glycophorine B, présentes en quantité plus limitée dans la membrane (tableau III).

Interaction des protéines Rh avec le squelette membranaire

Les techniques d'extraction par des détergents non ioniques suggèrent une association entre les protéines Rh et celles du cytosquelette [70]. Toutefois, à cause du caractère hydrophobe des protéines Rh, ces résultats sont difficiles à interpréter pour conclure qu'un découplage provoqué par l'absence de protéines Rh pourrait expliquer les anomalies morphologiques (stomato-sphérocytose) et fonctionnelles des cellules Rhnull.

La description récente de l'inactivation du gène de la Bande 3 par recombinaison homologue chez la souris [71, 72] a révélé de manière surprenante et inattendue que le squelette érythrocytaire est capable de s'assembler quasi normalement en l'absence de Bande 3 (bien que les animaux présentent une sphérocytose et des signes d'anémie sévère), ce qui remet en cause l'un des dogmes concernant la biogenèse de ces membranes. À l'évidence il doit exister d'autres sites d'attachement du squelette à la membrane. L'un d'entre eux est représenté par le complexe ternaire glycophorine C-protéine 4.1-protéine p55 [73], absent chez les malades atteints d'elliptocytose héréditaire par déficit en protéine 4.1 [74] ou le déficit en glycophorine C représenté par le phénotype Leach [75]. Un troisième point d'ancrage du cytosquelette pourrait être représenté par le complexe Rh lui-même, et une perturbation de ce système entraînerait des altérations des propriétés élastiques et mécaniques des érythrocytes, comme cela est rencontré dans le syndrome Rhnull.

Des études préliminaires réalisées avec des Fab anti-D marqués à la fluorescéine, à l'aide d'une technique d'imagerie (fluorescence imaged micro deformation) permettant de suivre la redistribution des composants membranaires dans des globules rouges soumis à une déformation dynamique provoquée par aspiration dans une micropipette [76], indiquent une restriction considérable de la mobilité de la protéine D (Mouro-Chanteloup et al, non publié). Ce résultat important représente le premier argument direct en faveur d'une interaction des protéines Rh avec le cytosquelette, mais la nature moléculaire des partenaires en cause reste à définir.

Analyse moléculaire du déficit en protéines Rh

L'analyse de l'ADN génomique provenant de sujets Rhnull indique que certains possèdent les deux gènes RH (D et CE) et d'autres un seul gène (RHCE), mais aucun remaniement évident (insertion, délétion) pouvant expliquer l'absence des protéines Rh à la surface des érythrocytes n'a été mis en évidence [77]. Afin de déterminer s'il existe des anomalies transcriptionnelles ou traductionnelles des protéines principales du complexe Rh, les ARN codant les protéines Rh (D et CE), Rh50 et CD47 ont été amplifiés par PCR à partir des réticulocytes des malades et séquencés.

Deux sujets Rhnull homozygotes pour un haplotype portant un gène RHCE silencieux (type amorphe) ont été analysés. Dans un cas, aucune altération de la séquence des transcrits RhCE, Rh50 et CD47 n'a été mise en évidence [77]. L'hypothèse la plus probable est que l'absence d'expression des antigènes Rh chez ce malade résulterait d'une anomalie transcriptionnelle ou de la présence de transcrits instables. Chez un second malade, une petite délétion dans la région codante du transcrit conduit à un arrêt prématuré de la traduction (Chérif-Zahar et al., non publié).

Chez des sujets Rhnull de type régulateur, qui représentent la grande majorité des phénotypes Rh-déficients (environ 80 % des malades), on sait que le locus RH est intact car ces sujets transmettent mais n'expriment pas les antigènes Rh. D'ailleurs, aucune anomalie des gènes et des transcrits RH, LW et CD47 n'a été détectée chez six patients [78]. Au contraire, cinq patients présentent des altérations dans la région codante du transcrit Rh50 (mutations entraînant un décalage du cadre de lecture et mutations non-sens) (figure 5). Chez le sixième, le transcrit Rh50 n'a pas pu être amplifié [78] mais des travaux plus récents ont montré une mutation d'un site accepteur d'épissage de l'intron 1 (Chérif-Zahar et al., soumis). Ces mutations sont transmises sur un mode mendélien et entraînent soit l'absence complète soit une réduction très sévère de synthèse de la protéine Rh50. Ces résultats mettent en évidence pour la première fois des altérations génétiques chez les sujets Rhnull et suggèrent que l'absence de la protéine Rh50 entraîne un déficit total d'expression des antigènes Rh, ce qui s'accorde bien avec le modèle du complexe proposé plus haut. Le gène responsable du phénotype Rhnull de type régulateur n'est pas un modulateur transcriptionnel du locus RH. Il code la sous-unité protéique Rh50 qui apparaît indispensable à l'assemblage ou au trafic intracellulaire des protéines du complexe Rh, par un mécanisme qu'il conviendra de préciser ultérieurement. Bien que ces résultats apportent une clarification sur la nature moléculaire de certaines altérations en cause, la relation avec les anomalies fonctionnelles des cellules reste encore obscure.

Autres pathologies associées à des anomalies d'expression des antigènes Rh

Les analogies entre le syndrome Rhnull et la sphérocytose héréditaire, et en particulier le déficit d'expression de l'antigène D chez certains de ces malades, ont été signalés auparavant. Des altérations de l'expression des antigènes Rh ont aussi été occasionnellement décrites chez des malades atteints d'hémopathies malignes [79, 80]. Dans la plupart des cas, on observe un mosaïcisme avec perte d'expression antigénique sur une fraction seulement (origine clonale ?) de la population érythrocytaire. Chez un malade d'origine danoise atteint de leucémie myéloïde chronique étudié très récemment, l'expression de l'antigène D avait complètement disparu et l'analyse moléculaire du locus RH a révélé une mutation non-sens du gène RHD dans les cellules de la lignée érythroïde, alors que le gène RHD des cellules lymphoïdes n'était pas affecté (Chérif-Zahar et al., non publié). En dehors des cas de véritables mosaïques génétiques où des altérations analogues peuvent survenir, ou encore de translocations réciproques chez certains patients souffrant de dysplasie myéloïde [81], on ignore si ces modifications traduisent une relation directe avec la progression de la maladie.

Protéines Rh et asymétrie des phospholipides membranaires

Il est bien établi que les phospholipides membranaires sont distribués asymétriquement entre les feuillets de la bicouche lipidique, les phospholipides contenant de la choline étant principalement localisés sur le feuillet externe et les aminophospholipides sur le feuillet interne. Cette asymétrie est sous le contrôle de mécanismes spécifiques dont certains commencent à être élucidés [82]. L'activité la mieux caractérisée est celle d'une aminophospholipide translocase ATP-dépendante assurant le transport de la phosphatidylsérine (PS) et de la phosphatidyl-éthanolamine (PE) depuis le feuillet externe vers le feuillet interne de la membrane (« activité flippase »). La nature moléculaire de ce transporteur fait encore l'objet de controverses car deux protéines distinctes de 115 et 32 kDa semblent impliquées. La protéine de 115 kDa est une ATPase II Mg-dépendante présente dans les granules des cellules chromaffines des glandes surrénales de boeuf [83]. Une protéine douée d'une activité analogue a été purifiée à partir des érythrocytes humains et reconstituée dans des vésicules lipidiques artificielles [84]. D'autres observations suggèrent qu'il existe une aminophospholipide translocase que l'on détecte au niveau d'une bande de 32 kDa par marquage préalable des globules rouges, soit par un analogue photoactivable de la PS (125I-azido-PS), soit par un inhibiteur spécifique du transport de PS (125I-pyridyldithioethylamine). Des expériences d'immunoprécipitation à l'aide d'anticorps anti-Rh monoclonaux suggèrent que cette bande contient des protéines Rh [85, 86]. Cependant, malgré l'absence totale ou la diminution très sévère de protéines Rh, les hématies Rhnull transportent normalement la phosphatidylsérine (PS) et l'on y détecte encore une bande de 32 kDa (Rh-like ?) après marquage par l'analogue photoactivable et l'inhibiteur du transport de phosphatidylsérine [85, 87]. La bande de 32 kDa contiendrait également la protéine 7.2b (stomatine) qui pourrait être impliquée, soit dans le transfert non spécifique des phospholipides depuis le feuillet interne vers le feuillet externe (« activité floppase »), soit dans la ré-orientation non spécifique des phospholipides entre les deux feuillets (activité « scramblase ») [88]. Cependant, on ignore si les cellules déficientes en protéine 7.2b des patients atteints de stomatocytose héréditaire transportent normalement la phosphatidylsérine et présentent des anomalies de distribution des phospholipides membranaires.

Ces hypothèses ne sont pas mutuellement exclusives car le « transporteur » fonctionnel de phospholipides pourrait être un complexe formé de sous-unités catalytiques (ATPases) de 115 kDa et de sous-unités modulatrices 32 kDa. Selon une autre hypothèse, les protéines de 32 kDa pourraient moduler passivement la distribution des phospholipides membranaires, et ce mécanisme serait perturbé, par exemple, dans les globules rouges Rhnull. Récemment, un ARNm codant une ATPase bovine potentiellement douée d'activité aminophospholipide translocase a été clonée [89], et plus récemment encore, l'homologue humain a été isolé à partir d'une banque d'ADNc de moelle osseuse [90]. Sur la base de ces observations, les propriétés fonctionnelles de cette ATPase et ses interactions éventuelles avec les protéines Rh pourront sans doute être clarifiées.

CONCLUSION

Nos connaissances sur la structure, l'organisation et le polymorphisme du locus RH reposent désormais sur des bases moléculaires. Outre l'apport fondamental, une retombée significative au plan de la biologie clinique concerne le développement d'un diagnostic prénatal permettant le génotypage RH des foetus à risque de maladie hémolytique chez les femmes immunisées de phénotype Rh-négatif [91-95]. L'identification des sous-unités composant le complexe Rh devrait également permettre de mieux définir la spécificité fine des auto-anticorps « anti-Rh » présents chez les malades atteints d'anémie hémolytique auto-immune et de rechercher une corrélation éventuelle avec l'étiologie de l'anémie. Enfin, il est désormais possible d'étudier les mécanismes de trafic et d'assemblage intracellulaire des sous-unités du complexe Rh, afin de clarifier leur rôle dans l'architecture de la membrane érythrocytaire.

Remerciements

Nous remercions Baya Chérif-Zahar, Giorgio Matassi, Isabelle Mouro-Chanteloup, France Noizat-Pirenne et Caroline Le Van Kim pour les discussions et la communication de résultats non publiés.

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