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Différents aspects de régulation du transport ionique transépithélial dans le contexte de la mucoviscidose


Médecine thérapeutique / Pédiatrie. Volume 8, Numéro 3, 135-49, mai-juin 2005, Dossier


Résumé  

Auteur(s) : Aleksander Edelman, Janine Fritsch , INSERM U467, Faculté Necker, 156, rue de Vaugirard, 75015 Paris, CNRS UPR 1524/UMR 8104, Hôpital St Vincent de Paul, 82, av. Denfert Rochereau, 75014 Paris.

Résumé : La mucoviscidose est la maladie génétique et létale la plus fréquente dans la population caucasienne, impliquant un défaut de transport transépithélial d’ions chlorures, C1 . Le gène CFTR dont les mutations sont impliquées dans la pathogenèse de la mucoviscidose a été identifié en 1989. La fonction principale de la protéine CFTR est celle d’un canal C1 régulé par l’AMPc et l’ATP. CFTR est localisé à la surface apicale des cellules épithéliales recouvrant notamment les voies aériennes, le tractus digestif, les glandes exocrines où elle est responsable de la sécrétion transépithéliale de sels et d’eau. De multiples interactions dynamiques au sein de complexes protéiques retentissent sur la stabilité, la localisation et la fonction de CFTR. Outre sa fonction canalaire, CFTR régule par des mécanismes encore incertains l’activité de plusieurs transporteurs et canaux tels que certains transporteurs de bicarbonates, et le canal sodique sensible à l’amiloride, EnaC. Ces nombreuses fonctions régulatrices sont vraisemblablement à l’origine des multiples facettes du dysfonctionnement épithélial dans la mucoviscidose. La variabilité du phénotype de la maladie chez les patients atteints ou chez les animaux invalidés pour le gène CFTR est à l’origine d’une attention particulière pour d’autres classes de canaux chlorures exprimés dans les mêmes tissus, qui pourraient partiellement compense la fonction de la protéine CFTR. Les recherches de protéines formant des complexes avec des canaux C1 apporteront des informations nouvelles quant aux mécanismes du dysfonctionnement du transport des fluides dans la mucoviscidose et éclaireront notre savoir sur le lien entre l’inflammation et ce transport.

Mots-clés : mucoviscidose, cystic fibrosis, CFTR, canal C1 , sécrétion épithéliale

Illustrations

ARTICLE

Auteur(s) : Aleksander Edelman1, Janine Fritsch2

1INSERM U467, Faculté Necker, 156, rue de Vaugirard, 75015 Paris
2CNRS UPR 1524/UMR 8104, Hôpital St Vincent de Paul, 82, av. Denfert Rochereau, 75014 Paris

Dans cet article seront décrits les modèles proposés pour rendre compte des processus d’absorption et de sécrétion de fluides dans le contexte de la mucoviscidose avec une attention particulière sur la sécrétion de bicarbonates dont le dysfonctionnement pourrait expliquer un grand nombre de symptômes chez les patients. Nous décrirons les principales propriétés de la protéine CFTR en tenant compte des nouvelles données concernant sa biosynthèse et sa maturation, ainsi que les protéines partenaires impliquées dans les différentes fonctions de CFTR. La dernière partie résumera l’état des connaissances sur les canaux Cl épithéliaux autres que CFTR.

Epithéliums

L’épithélium, composé de cellules maintenues entre elles par des jonctions serrées (tight junction), constitue une barrière cellulaire qui possède essentiellement deux fonctions : la première est de réguler le transport transépithélial d’électrolytes et de fluides, la deuxième est de défendre l’organisme contre les hôtes extérieurs tels que les bactéries, les virus ou autres pathogènes. Le dysfonctionnement des fonctions de l’épithélium conduit à de multiples états pathologiques. C’est le cas de la mucoviscidose où un défaut de transport de fluides affecte les voies aériennes, le pancréas, l’intestin, les glandes sudoripares et le tractus génital. Dans le rein, les défauts de transport sont responsables de nombreuses pathologies parmi lesquelles il faut citer les syndrômes de Bartter ou de Liddle.

La caractéristique principale des cellules qui composent un épithélium est leur polarité. Les cellules sont entourées de deux membranes différentes délimitées par des jonctions serrées : une membrane apicale qui fait face à la lumière de l’organe, et une membrane basolatérale du côté sanguin. Les jonctions serrées, permettent dans certains cas un passage sélectif d’ions [1]. Les membranes apicales diffèrent des membranes basolatérales par leur composition en phospholipides et protéines (récepteurs, canaux ioniques, ATPases, transporteurs, etc.). Ces différents transporteurs établissent les gradients électrochimiques qui déterminent le sens des flux transépithéliaux.

Mécanismes de transport des électrolytes dans les épithéliums

La direction du flux ionique ou du transport à travers un épithélium est définie par la somme des transports actifs et passifs, principalement ceux de Na+, Cl, HCO3 et K+. Selon la valeur de transport net, les épithéliums ont un rôle d’absorption (direction de transport net vers le sang) ou un rôle sécréteur (direction de transport net vers la lumière de l’épithélium).

Absorption de NaCl

Les épithéliums de surface intestinaux et pulmonaires sont principalement engagés dans des processus d’absorption. Les mécanismes diffèrent selon le tissu et peuvent être électroneutres ou électrogéniques.

Le mécanisme électroneutre ( (figure 1) ) qui prédomine dans le colon proximal (au niveau de l’épithélium de surface et des cryptes) et distal (au niveau de l’épithélium de surface), fait intervenir deux types d’échangeurs agissant en parallèle dans la membrane apicale : un échangeur Na+/H+ (NHE3) [2, 3] et un échangeur Cl/HCO3- (DRA [4]). Il en résulte une entrée de Na+ et de Cl dans la cellule, couplée à une sortie apicale de H+ et de HCO3. Au niveau basolatéral, les ions Na+ quittent la cellule sous l’action de pompes Na+/K+ATPases et les ions Cl- au travers d’échangeurs K+/Cl ou de canaux Cl sensibles à des variations osmotiques

Le mécanisme d’absorption électrogénique ( (figure 2) ) dépend de l’activité de canaux Na+ apicaux (ENaC) sensibles à l’amiloride. Il intervient au niveau du colon distal et tout au long de l’arbre respiratoire [5]. Selon ce modèle, les ions Na+ pénètrent dans la cellule au travers des canaux ENaC selon leur gradient électrochimique et sont transportés vers le compartiment sanguin par la Na+K+ATPase. Le transport actif de Na+ crée une différence de potentiel transépithélial favorable à l’absorption de Cl par la voie paracellulaire (voie de « shunt »). Ce mode d’absorption est également contrôlé négativement par la protéine CFTR. L’absence d’inhibition du canal ENaC dans la mucoviscidose est responsable de l’hyperabsorption de NaCl largement décrite au niveau pulmonaire [6].

Les propriétés biophysiques et pharmacologiques du canal sodique épithélial sont connues depuis un certain nombre d’années [7] : ce canal présente une très forte sélectivité pour le Na+ et il est fortement inhibé par l’amiloride et ses dérivés.

Les expériences de clonage réalisées en 1993 ont montré qu’il est formé de trois sous-unités relativement homologues de 60-75 kD, α, β, γ comprenant chacune une large boucle extracellulaire glycosylée et deux domaines transmembranaires [8]. L’expression de la sous-unité α dans l’ovocyte de Xénope génère un courant sodique dont les propriétés biophysiques et pharmacologiques peuvent être modifiées par la coexpression des deux autres sous-unités [9]. L’activité maximale est obtenue par association de deux sous-unités α pour 1 β et 1 γ. Cette stœchiométrie varie vraisemblablement selon les tissus, permettant une certaine diversité fonctionnelle. Dans l’épithélium colique les transcrits codant pour chaque sous-unité sont retrouvés à un niveau comparable alors que la distribution de ces transcrits varie le long de l’arbre respiratoire (au moins chez la souris) ce qui laisse présager des propriétés et des régulations différentes du canal [10].

Sécrétion de NaCl

Les cryptes intestinales, les voies aériennes et les glandes sous-muqueuses, les acini et les canaux des glandes pancréatiques sont des exemples d’épithéliums sécréteurs. La sécrétion de NaCl y est placée sous le contrôle d’une augmentation de Ca2+ ou de AMPc.

Dans ces épithéliums, le facteur limitant de la sécrétion de NaCl est le flux de Cl( (figure 3) ). Le processus de sécrétion suit le modèle suivant : les ions Cl pénètrent dans la cellule grâce au cotransporteur Na+K+2Cl (NKCC) et leur accumulation intracellulaire crée un gradient électrochimique favorable à leur efflux dans la lumière. La différence de potentiel transépithéliale qui en résulte permet la sécrétion des ions sodium par la voie paracellulaire.

Dans le cas d’une sécrétion AMPc-dépendante, le flux apical est assuré essentiellement par la protéine CFTR et dans une moindre mesure par un canal à rectification sortante (ORCC), lui-même régulé par la protéine CFTR [11]. La sécrétion Ca2+-dépendante implique soit l’activation par le Ca2+i de canaux CaCC (comme dans le pancréas et l’épithélium pulmonaire), soit l’activation de canaux K+ basolatéraux qui favorise la sortie des ions Cl via CFTR. Ce mode d’activation est prépondérant dans l’intestin.

La sécrétion Ca2+-dépendante se différencie toutefois de la sécrétion AMPc-dépendante par son caractère transitoire et réfractaire à des stimulations répétées [12]. Ce profil peut être en partie expliqué par une inhibition directe des canaux CaCC par la production concomitante d’inositol tétrakisphosphate Ins(3,4,5,6)P4 lors de l’activation des récepteurs muscariniques [13]. Malgré ce caractère transitoire, la contribution de cette voie peut jouer un rôle déterminant puisque chez les souris invalidées pour le gène CFTR on n’observe aucune atteinte pulmonaire et que les lésions pancréatiques restent peu sévères. Par contre, l’absence de canaux CaCC dans les entérocytes différenciés pourrait rendre compte des complications intestinales létales dans les modèles murins [14].

Le processus de sécrétion de Cl dépend de l’action coordonnée des canaux Cl apicaux et de canaux K+ basolatéraux. Ces canaux K+ assurent le recyclage des ions K+ et en hyperpolarisant la membrane, maintiennent une force électromotrice suffisante pour la sortie passive des ions Cl[15].

Il est possible de distinguer au moins deux types de canaux K+ dans les membranes basolatérales, activés soit par l’AMPc, soit par le Ca2+. Ces deux types de conductances ont récemment été identifiés au niveau moléculaire. Le canal activé par l’AMPc correspond au canal KVLQT1 (codé par le gène KCNQ1) précédemment caractérisé dans les cellules cardiaques [16]. Son expression a été retrouvée dans le colon, le pancréas, les cellules nasales ainsi que dans une lignée de cellules bronchiques. Ces canaux de très faible conductance (3pS) sont inhibés par le chromanol 293 B et le chlotrimazole et leur mode d’ouverture dépend de la présence de sous-unités β. Deux de ses sous-unités ont été identifiées, KCNE1 dans le cœur et la cochlée [17] et KCNE3 dans le colon [18]. L’association KCNQ1/KCNE3 est nécessaire pour l’ouverture des canaux à des potentiels négatifs alors que les canaux KCNQ1/KCNE1 ne sont activés lentement qu’à des potentiels plus positifs que –10 mV.

Plusieurs types de canaux K+ activés par le Ca2+ doivent coexister dans ces membranes, puisque des canaux de conductance variable ont été décrits. L’un d’entre eux, SK4, a récemment été identifié à l’échelle moléculaire dans le colon de rat et humain. Ce canal de conductance intermédiaire [19] est inhibé par le chlotrimazole et activé par le benzimidazolone 1-EBIO. Des canaux présentant des propriétés comparables ont été décrits dans les cellules pulmonaires, mais la présence de SK4 dans ces cellules n’a pas été rapportée.

Il est admis que les molécules d’eau sont transportées soit par la voie de shunt soit par les aquaporines (canaux à eau) présentes dans les membranes basolatérales et apicales de l’épithélium. L’eau peut également emprunter les voies de transport de différents substrats et notamment celle du transport de glucose Na+/Glucose [20].

Sécrétion de bicarbonate dans le pancréas

Les lésions pancréatiques sévères observées chez 80 % des malades atteints de mucoviscidose sont à l’origine du nom de la maladie. Dans cet organe, la sécrétion de HCO3 représente l’élément déterminant de la sécrétion de fluides : la concentration des ions bicarbonates dans le liquide sécrété peu atteindre chez l’homme 150 mM.

Les mécanismes de sécrétion de HCO3 ont été surtout explorés chez le rat qui représente un modèle un peu atypique dans la mesure où la concentration des ions HCO3 sécrétés est deux fois moins importante que chez l’homme. Chez le rat, le mécanisme de sécrétion fait intervenir les étapes suivantes [21] : en réponse à la sécrétine, la concentration intracellulaire des ions HCO3 s’élève grâce à l’activation d’un cotransporteur Na+HCO3 électrogénique (NBC) situé dans la membrane basolatérale ainsi que par diffusion de CO2 qui est transformé en HCO3 sous l’action d’une anhydrase carbonique. Au niveau de la membrane apicale, l’activation d’un échangeur anionique Cl/ HCO3 (AE) électroneutre, assure l’efflux de HCO3 couplé à un influx de chlore. Le Cl est recyclé dans la lumière au travers de la protéine CFTR activée par l’augmentation de AMPc.

Ce modèle de sécrétion électroneutre est toutefois insuffisant pour rendre compte de la totalité de la sécrétion de HCO3 chez l’homme [22]. Face à des concentrations luminales élevées en bicarbonate, l’échangeur AE est inhibé et pourrait même fonctionner en sens inverse. D’un point de vue thermodynamique, la concentration maximale de HCO3 que cet échangeur puisse assurer est de l’ordre de 70 mM. Le modèle actuellement retenu ( (figure 4) ) propose donc une contribution de cet échangeur dans les canaux proches des acini où la concentration de HCO3 est encore faible, de l’ordre de 25 mM. Deux types d’échangeurs ont été identifiés jusqu’à ce jour dans les membranes apicales de cellules pancréatiques humaines, l’échangeur DRA [4] et l’échangeur SLC26A6 [23] dont l’expression et l’activité sont régulées par CFTR. Au niveau de la membrane basolatérale, un cotransporteur de type NBC1 [24] est responsable de l’entrée de bicarbonate. Il est admis que l’efflux de chlore via CFTR entraîne une dépolarisation suffisante de la membrane basolatérale pour favoriser l’influx de bicarbonate au travers de l’échangeur électrogénique NCB1 [25].

Dans la partie distale des canaux, la sécrétion devient électrogénique, principalement médiée par un canal anionique qui est vraisemblablement CFTR ( (figure 4) ). Bien que la perméabilité relative de CFTR vis-à-vis de HCO3 soit faible (0,1-0,4), l’estimation des variations respectives des concentrations de Cl et de HCO3 ainsi que les variations de potentiel de membrane observées en réponse à une stimulation de sécrétion sont tout à fait compatibles avec cette hypothèse. Ainsi, les différences de mécanismes entre le rat et l’homme peuvent s’expliquer par l’absence d’expression chez l’homme (ou dans diverses autres espèces qui présentent des mécanismes de transport comparables) du cotransporteur Na+K+2Cl (NKCC1) dans la portion distale des canaux pancréatiques. En l’absence de ce cotransporteur, la concentration intracellulaire de Cl reste très faible et pourrait rendre compte du transport favorisé de HCO3 au détriment de celui de Cl par le canal CFTR [26].

Par ailleurs, d’autres études soulignent l’importance d’échangeurs Na+/H+ (NHE3) dans la membrane apicale qui pourraient favoriser l’absorption ou la rétention de HCO3 à l’état basal. Lorsque la sécrétion est stimulée, leur inhibition favorisée par CFTR faciliterait la sortie des ions HCO3[27].

Régulation du transport transépithélial

Divers mécanismes de régulation du transport transépithélial ont été décrits [12] :
  • 1. Régulation du taux d’expression des protéines de transport. Cette régulation peut avoir lieu soit au niveau de la transcription soit au cours de la traduction des gènes. Différents stimuli peuvent conduire à une inhibition ou une augmentation de l’expression des protéines canalaires tels que hormones, cytokines, variations osmotiques, agents pharmacologiques etc.
  • 2. Régulation du trafic vésiculaire. L’activité globale d’un transporteur est fonction de la quantité des protéines dans la membrane plasmique. Ce nombre dépend de la fusion de vésicules sous-membranaires avec la membrane plasmique. Ce mode de régulation a été démontré par exemple pour le cotransporteur Na+-K+-2Cl, l’échangeur Na+/H+ (NHE3), et le canal CFTR.
  • 3. Régulation induite par modification covalente des protéines de transport provoquant un changement de leur d’activité. Ce mécanisme comprend les processus de phosphorylation par diverses kinases (par exemple, phosphorylation par les protéines kinases A et C, de CFTR, de canaux K+ ou encore de l’échangeur NHE3).
  • 4. Régulation par interaction directe des protéines de transport avec des facteurs cytosoliques. Ces interactions protéine-protéine utilisent des domaines conservés qui permettent de reconnaître des motifs peptidiques d’une autre protéine. Parmi ces domaines, on trouve les domaines homologues Src (SH2 et SH3), le domaine liant la phosphotyrosine (PTB) ou encore le domaine PDZ1.

Protéine CFTR

Le défaut de transport épithélial des ions Cl, responsable notamment de l’obstruction des voies aériennes, des canaux pancréatiques et de l’intestin dans la mucoviscidose, était connu bien avant le clonage du gène CFTR. Cette maladie est la première des maladies autosomiques récessives dont le gène a été isolé par clonage positionnel. Dans la population caucasienne, sa fréquence est de 1:2 500.

Gène

Le gène impliqué dans la mucoviscidose a été isolé en 1989 [28]. Ce gène contient 27 exons s’étendant sur 250 kb du chromosome 7 (7q31). Une mutation ponctuelle, ΔF508, est retrouvée chez 70 % des patients atteints de mucoviscidose. Depuis la description du gène CFTR, environ 1 400 mutations ont été décrites et sont rassemblées dans une base de données (http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr-cgi-bin/FullTable). Les différentes mutations sont regroupées en six classes en fonction du type d’anomalie fonctionnelle (classe I : anomalie de production ; classe II : anomalie de maturation ; classe III : anomalie de régulation ; classe IV : anomalie de conduction ; classe V : anomalie des ARNm ; classe VI : anomalie de stabilité de la protéine) [29].

Topologie de la protéine CFTR

La séquence protéique déduite de la séquence nucléotidique du gène CFTR correspond à une protéine composée de 1 480 acides aminés. L’analyse de la séquence primaire a permis de reconstituer la structure tertiaire probable de la protéine CFTR d’après son profil hydropathique [28]. Elle contient deux motifs répétés constitués chacun d’un domaine hydrophobe transmembranaire (TMD) contenant six hélices α et d’une importante région hydrophile contenant des séquences consensus Walker A et B susceptibles de lier l’ATP (NBD ou Nucleotide ATP-Binding Domain). Ces deux motifs sont reliés par un domaine cytoplasmique (domaine R) contenant de nombreux résidus chargés et la majorité des sites potentiels de phosphorylation (substrats probables des protéines kinases A et/ou C) ( (figure 5) ).

La protéine CFTR présente une homologie de séquence primaire avec les membres d’une famille de protéines membranaires, les transporteurs ABC (ATP-binding cassette). Tous les transporteurs ABC partagent une organisation commune en quatre domaines. Ces domaines peuvent être exprimés séparément ou fusionnés en une seule protéine multidomaine. Deux domaines très hydrophobes (TMD ou Transmembrane Domain), chacun constitué de 5 à 6 segments transmembranaires, sont supposés former le passage par lequel le soluté traverse la membrane et déterminer la spécificité/sélectivité du substrat du transporteur ABC. Les deux autres domaines sont des domaines de liaison à l’ATP (NBD ou Nucleotide-Binding domain) localisés à la face cytosolique de la membrane et qui permettent le couplage de l’hydrolyse de l’ATP au transport du soluté. Ils sont le trait caractéristique des transporteurs ABC [30].

Les expériences d’immunoprécipitation de la protéine à partir de cellules transfectées avec l’ADNc de CFTR ont permis de détecter trois bandes protéiques de poids moléculaire 170, 145 et 135 kD. Il est admis que la bande de poids moléculaire d’environ 170 kD correspond à la forme mature (glycosylée) de la protéine CFTR tandis que les bandes de 145 et 135 kD correspondent à la protéine en cours de maturation. (http://central.igc.gulbenkian.pt/cftr/newsletters_files/newsL%20res2.1.pdf)

Maturation/dégradation

La biosynthèse de CFTR [31] comme celle de la plupart des protéines eukaryotes dans le réticulum endoplasmique (RE) comprend plusieurs étapes ( (figure 6) ). Les domaines transmembranaires sont tout d’abord correctement orientés, rassemblés et introduits dans les membranes lipidiques. Les étapes suivantes comprennent la formation des hélices, le repliement des domaines cytosoliques et la glycosylation dans la partie cis/médium de l’appareil de Golgi pour aboutir à une structure tertiaire pleinement mature. Ces étapes font intervenir une machinerie cellulaire spécialisée qui comprend le complexe de translocation Sec 61, les protéines chaperones hsp70 et hsp40 et la protéine calnexine. Cette dernière contribue également au repliement correct et prévient l’agrégation et le repliement de polypeptides intermédiaires. L’ensemble de cette machinerie forme « le contrôle qualité » qui n’autorise pas la sortie du RE d’une protéine CFTR anormalement repliée. Le « contrôle qualité » régule également le taux de dégradation de la protéine par le système ubiquitine/protéasome (pour les mécanismes de dégradation dans le protéasome voir [32]). Soulignons qu’entre 50 et 80 % de la protéine CFTR sauvage et 99 % de ΔF508CFTR sont dégradés dans le RE [31, 33], que la forme mature (glycosylée) est plus résistante à la protéolyse in vitro [34] et qu’elle possède un temps de demi-vie d’environ 12 heures. Comparativement, la protéine ΔF508CFTR qui présente un défaut de maturation, à savoir l’absence d’addition de mannosidases dans la partie cis/médium de l’appareil de Golgi [35], possède un temps de demi-vie d’environ 2 heures [36].

Fonctions du CFTR

La structure de la protéine CFTR laissait présager deux fonctions : canal ionique ou transporteur actif. Plusieurs approches électrophysiologiques ont été nécessaires pour démontrer que cette protéine se comporte comme un canal Cl. Les analyses de courant ont été effectuées après incorporation de la protéine dans une bicouche lipidique et après expression de la protéine dans différents systèmes cellulaires [37].

Canal Cl

Les études réalisées au moyen de la technique de patch clamp en configuration cellule entière ont permis d’identifier un courant Cl activé par l’AMPc dans les cellules transfectées par l’ADNc de CFTR. La même technique appliquée en configuration patch « excisé » a montré que l’expression de la protéine CFTR est associée avec la présence d’un canal Cl activé par la PKA. Ces résultats ont été confirmés par expression des ARNc CFTR dans l’ovocyte de Xénope. La démonstration formelle de la fonction canalaire a été obtenue dans un système acellulaire, après reconstitution de la protéine purifiée dans une bicouche lipidique.

Le canal Cl/CFTR présente une conductance unitaire de 7-10 pS, une relation courant-voltage linéaire, et une forte sélectivité anionique (anion/cation = 10, sélectivité anionique : Br > Cl > I). Ce canal est insensible aux dérivés stilbènes (DIDS, 4’-diisothiocanato-stilbene-2,2’ acide disulphonique) et peu sensible aux inhibiteurs usuels de conductance anionique tels que les dérivés anthracènes (DPC, diphénylamine-2-carboxylate et NPPB, 5-nitro-2-(3-phénylpropylamino)-benzoate). Il est partiellement bloqué par le glibenclamide (sulfamide hypoglycémiant).

De nombreuses études ont été entreprises par la suite pour étudier la structure du canal Cl/CFTR et déterminer les sites impliqués dans la sélectivité, la régulation et les interactions protéine-protéine. Grâce à des méthodes de substitution par la cystéine de différents résidus, il a été possible de montrer que des acides aminés situés dans les domaines transmembranaires 1, 3 et 6 contribuent à la formation du pore. L’utilisation de ces techniques a permis également de montrer que l’arginine en position 352 est responsable de la sélectivité de charge (anion vs cation) [38].

Protéines d’interaction

Un nombre croissant de travaux souligne l’importance de partenaires interagissant au sein de complexes protéiques pour la régulation du canal Cl/CFTR et/ou d’autres transporteurs impliqués dans l’absorption ou la sécrétion de fluides [39, 40].

Au moins deux protéines PDZ interagissant avec le motif DTRL présent à la fin de la partie C-terminale du CFTR sont impliquées dans la régulation de l’activité de CFTR et/ou de l’ENaC : le facteur NHERF1 (Na+/H+ regulatory Factor) appelé EBP50 (Ezrin-radixin-moezin-Binding Phosphoprotein 50) et la protéine CAP 70 (CFTR-Accessory Protein) ( (figure 7) ). Le facteur NHERF1 se lie à la protéine ezrin qui contient aussi dans sa partie C-terminale des sites de liaison pour l’actine et pour la proteine kinase A, permettant l’ancrage de la kinase à la membrane. Le complexe CFTR-NHERF1-ezrin-actin facilite ainsi la phosphorylation de CFTR par la PKA conduisant au changement de l’activité du canal Cl/CFTR. La protéine CAP 70 augmente l’activité du canal en favorisant probablement la formation de dimères.

La partie N-terminale de la protéine CFTR comporte également un site d’interaction important pour sa régulation. Ce site permet une liaison avc la syntaxine 1A qui appartient à la famille des protéines SNARE, impliquées dans les mécanismes de fusion vésiculaire dans les cellules eukaryotes. Cette liaison avec la syntaxine 1A conduit à une diminution de l’activité du canal Cl /CFTR [41].

CFTR : protéine multifonctionnelle

Le caractère multifonctionnel de la protéine CFTR est maintenant bien reconnu. Hormis son rôle de canal Cl, il est vraisemblable que la protéine transporte les ions HCO3 et le glutathion [42]. De nombreuses fonctions régulatrices d’autres transporteurs ioniques ont été également mises à jour qui permettent de mieux comprendre les multiples facettes du dysfonctionnement épithélial dans la mucoviscidose. Parmi les différentes fonctions de régulation proposées, citons la régulation du canal ENaC, des échangeurs NHE3 et Cl/HCO3, du canal Cl (ORCC), des canaux K+-ATP dépendant, des canaux à eau (AQP3), ou du transport de mucines (tableau 1)( Tableau 1 ).
Tableau 1 Différentes fonctions de CFTR

Protéines régulées par CFTR

Effet

Mécanismes

Références

EnaC

Inhibition

[Cl] ?, protéines Yes, YAP65?

[55]

Na+ /H+

Inhibition

NHERF ?

[27]

HCO3/Cl

Activation

?

  • [77]
  • [43]


ORCC

Activation

ATP?

[11]

K-ATP,

Activation

?

[78]

AQP3

Activation

?

[79]

Canaux de jonction gap

Activation

?

[80]

Transport de glutathion

Activation

Efflux de Cl? Transport par CFTR ?

  • [54]
  • [42]


Défaut de transport de bicarbonate

Le dysfonctionnement de la protéine CFTR pourrait intervenir à plusieurs niveaux pour rendre compte du défaut de sécrétion de HCO3 dans le pancréas. Tout d’abord en limitant la sécrétion électrogénique qui fait appel à un passage des ions HCO3 au travers de la protéine CFTR elle-même, mais aussi par défaut de régulation des autres transporteurs impliqués dans les mécanismes de sécrétion. Des travaux récents ont mis en évidence un rôle primordial de CFTR dans le contrôle de l’activité de l’échangeur anionique apical [43] : l’étude comparative de mutants CFTR qui tout en conservant une fonction résiduelle de transport de Cl sont associés ou non à une insuffisance pancréatique a montré une excellente corrélation entre le défaut d’activation de l’échangeur anionique et les mutations qui conduisent à une atteinte pancréatique sévère. D’autre part, la perte de régulation négative par CFTR de l’échangeur NHE3 pourrait favoriser la rétention ou l’absorption de HCO3 au détriment d’une sécrétion [27].

Au plan pulmonaire, l’implication d’un défaut de transport de HCO3 dans la pathologie demeure hypothétique dans la mesure où les tentatives de mesure de pH dans le liquide recouvrant l’épithélium de surface n’ont pas montré de différence chez les patients par rapport aux sujets sains [44]. Il faut souligner que ces mesures effectuées in vivo restent très difficiles de part la très faible hauteur de liquide et l’éventualité d’une transformation rapide de HCO3 en CO2 suivie d’une élimination par ventilation ne peut pas être exclue.

Cette hypothèse pourrait toutefois rendre compte de beaucoup des symptômes pulmonaires [45]. Différents tests effectués in vitro montrent en effet qu’une acidité trop importante : (i) affecte les propriétés rhéologiques du mucus et augmente sa viscosité ; (ii) augmente l’activité du canal sodique, ENaC ; (iii) compromet la fonction des cellules immunitaires en favorisant la production de molécules oxydantes toxiques et d’élastase ; (iv) favorise les capacités de survie de certaines bactéries.

Les mécanismes de sécrétion de HCO3 dans les voies aériennes ont surtout été explorés in vitro à partir de la lignée de cellules Calu-3, dérivées de cellules séreuses glandulaires humaines [46] dans lesquelles la sécrétion de HCO3 est prépondérante par rapport à celle de Cl. Cette sécrétion met en jeu une conductance anionique représentée vraisemblablement par la protéine CFTR. De même que dans le pancréas, la présence d’un cotransporteur analogue à NBC1 (mais qui dans ces cellules ne semble pas électrogénique [47]) et l’absence de NKCC favorisent le transport transépithelial de HCO3 au détriment de celui du chlore. En l’absence de modèle cellulaire équivalent pathologique (génotype CF–/–), il n’a pas été possible de vérifier si ce transport est affecté par les mutations de la protéine CFTR.

Défaut de transport de glutathion

La forme réduite de glutathion, GSH, représente le plus important antioxydant soluble dans l’organisme. La concentration normale de GSH est particulièrement élevée dans le liquide de surface pulmonaire, de l’ordre de 400 μM [48]. Chez les patients, cette concentration diminue progressivement, ce qui explique vraisemblablement les diminutions de défense contre les stress oxydatifs liés à l’inflammation chronique [49]. Il en résulte une perte de l’action mucolytique de GSH, une dégradation du surfactant, une réponse immunitaire anormale avec diminution de l’activité bactéricide ainsi que de la production de NO, cette dernière pouvant conduire à une diminution de conductance de CFTR et à une perte du signal nécessaire pour la diminution de l’absorption de Na. La rétention intracellulaire de GSH peut aussi faire basculer le processus normal apoptotique des cellules épithéliales vers une nécrose et conduire à une augmentation de la viscosité du mucus et à l’aggravation des phénomènes inflammatoires [50, 51].

La diminution de la concentration extracellulaire de GSH au cours de la mucoviscidose semble résulter d’un défaut de sortie de peptide plutôt que d’un défaut de synthèse ou d’une dégradation plus importante [52]. Cependant, les mécanismes sous-jacents à l’efflux de GSH sont très peu connus. Des études récentes ayant permis de montrer une perméabilité unidirectionelle de CFTR vis-à-vis de gros anions et en particulier de GSH, ont conduit à l’hypothèse que la protéine CFTR défectueuse serait directement responsable de la diminution de concentration luminale de GSH [42]. Il est aussi possible que le transport soit indirectement régulé par la protéine CFTR au travers des variations de potentiel de membrane [53]. Compte tenu de l’impact de la diminution de GSH dans la pathologie pulmonaire, un nombre croissant d’études s’intéresse au transport possible de GSH par les membres de la famille des MRP dont le rôle dans ce transport a été montré dans le foie. Ces protéines qui commencent à être identifiées dans le poumon, pourraient offrir une approche thérapeutique nouvelle. Il faut noter qu’une restauration du transport de glutathion a été récemment décrite grâce à l’incorporation d’un canal chlorure synthétique de 27 acides aminés, dérivé du récepteur glycine dans les membranes de cellules trachéales, in vitro [54]. Ce travail souligne l’importance du rôle du transport de chlore pour l’efflux de GSH sans nécessité d’une contribution directe de la protéine CFTR.

Défaut de régulation du canal Na+, ENaC

Chez les patients atteints de mucoviscidose, le dysfonctionnement de CFTR conduit à la levée d’inhibition de l’activité des canaux Na+ (ENaC) provoquant une hyperabsorption des fluides. Les mécanismes d’interactions entre CFTR et ENaC demeurent peu clairs [55]. Il ne semble pas que des interactions directes soient responsables du contrôle de l’activité de ENaC par CFTR. Des travaux récents laissent plutôt supposer que des modifications de concentration de chlore intracellulaires sont à l’origine de cette inhibition [56]. Cette interprétation pourrait par ailleurs rendre compte de l’inhibition récemment décrite des canaux ENaC par les agonistes purinergiques [57] qui activent les canaux chlorures CaCC ou ORCC.

L’importance de l’hyperabsorption de Na+ dans la génèse de la maladie pulmonaire a récemment été mise en évidence dans un modèle murin surexprimant la sous-unité β du canal ENaC. Il a été observé que malgré la présence d’une protéine CFTR normale chez ces animaux, l’absorption accrue de Na+ au niveau pulmonaire était suffisante pour réduire la hauteur de liquide périciliaire et augmenter la densité du mucus. Ces phénomènes s’accompagnent d’un défaut majeur de clearance ciliaire entraînant une accumulation de macrophages et de neutrophiles dans la lumière des voies aériennes. L’élastase produite par les neutrophiles pourrait exacerber le phénotype en induisant une hyperplasie des cellules à mucus et une hypersécrétion de mucines. Ce modèle murin reproduisant les principales caractéristiques pathologiques de la mucoviscidose au niveau pulmonaire, y compris l’incapacité de clearance bactérienne, permettra de mieux évaluer les facteurs pouvant influencer la sévérité de la maladie ainsi que le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Diversité des canaux chlorures apicaux

Beaucoup d’espoirs pour une thérapie de la mucoviscidose se fondent sur la recherche de traitements pharmacologiques capables de restaurer une sécrétion normale de Cl au travers de canaux Cl endogènes, différents de CFTR, aussi bien pour le transport de fluide que pour celui de glutathion ou pour l’inhibition de l’absorption de Na+. Ci-dessous sont présentés brièvement les canaux Cl épithéliaux, cibles potentielles de ces traitements (canaux Cl Ca2+-dépendant (CaCC), canaux à rectification sortante (ORCC), canaux Cl dépendant du voltage (ClC), et canaux CLIC).

Canaux chlorures Ca2+-dépendants, CaCC

Les canaux CaCC endogènes ont été identifiés dans de nombreux types cellulaires et leur contribution à la sécrétion de fluides est bien établie [58]. Ces canaux se caractérisent par une séquence de perméabilité anionique I > NO3 > Br > Cl >F2 et par une rectification sortante de leur relation courant/voltage. Les courants macroscopiques sont activés lentement par dépolarisation et inactivés par hyperpolarisation. Ils sont le plus souvent inhibés par le DIDS et l’acide niflumique. Mais selon le type cellulaire la conductance unitaire des canaux peut varier de 1 à 14 pS et leur activation semble nécessiter ou pas une phosphorylation par la protéine kinase dépendante de la calmoduline (CAMKII).

Il a été montré notamment que les canaux CaCC pouvaient être activés par les nucléotides triphosphates ATP et UTP au travers de récepteurs purinergiques P2Y2 et restaurer une sécrétion de chlore dans les tissus atteints [59]. L’importante représentation de ces récepteurs tout au long de l’arbre pulmonaire laisse donc envisager un traitement possible par cette classe de composés. Quelques essais cliniques réalisés avec l’UTP ont montré une amélioration de l’épuration mucociliaire chez les malades mais transitoire en raison de la dégradation rapide de ce nucléotide par des ectonucléotidases [60]. La possibilité de traitement à long terme reste donc en attente d’analogues plus stables.

Une dizaine de gènes homologues, CLCA codant pour cette famille des canaux ont été décrits. L’identification des canaux CaCC demeure toutefois conflictuelle car les propriétés des protéines CLCA étudiées dans des systèmes hétérologues diffèrent des propriétés des canaux endogènes. Bien que le rôle des protéines codées par les gènes CLCA soit encore à préciser, il est intéressant de noter que la protéine mCLCA3 (alias gob-5) et identique à hCLCA1 joue un rôle essentiel dans la surproduction de mucus au cours des atteintes asthmatiques [61]. Son expression est fortement augmentée par les cytokines IL-4, 9, et 13 [62]. De plus, sa localisation dans les granules des cellules à mucus intestinales, utérines et respiratoires suggère que cette protéine est plus généralement impliquée dans la synthèse, la condensation ou la sécrétion de mucines [63].

Canal ORCC (Outwardly Rectifying Chloride Channel)

Ces canaux caractérisés par leur rectification sortante sont paradoxalement les moins bien étudiés alors qu’ils ont été les premiers à être identifiés dans les cellules épithéliales en réponse à une augmentation intracellulaire de AMPc [64]. Leur nature moléculaire n’est toujours pas connue. Depuis la découverte de la protéine CFTR, il a été montré que l’activation des canaux ORCC est fortement dépendante de celle de CFTR. L’hypothèse qui prédomine pour expliquer cette relation est que l’activation de CFTR favoriserait un efflux d’ATP responsable de l’activation de ORCC. Si l’étude fonctionnelle de deux mutants naturels a permis de désigner NBD1 comme un domaine essentiel pour cette régulation [65], le retentissement de la perte d’activation du canal ORCC chez les malades demeure très obscur.

Canaux chlorures dépendant du voltage, ClC

Les canaux Cl dépendant du voltage appartenant à la famille des ClC sont largement représentés dans des types cellulaires variés [66]. À ce jour, neuf membres ont été identifiés chez les mammifères. Certains sont tissus spécifiques comme ClC-1 dans le muscle squelettique ou ClC-K dans le rein. Les mutations des gènes correspondant à ces canaux sont responsables de myopaties ou du syndrome de Bartter. Les canaux ClC3 à ClC7 exprimés dans de nombreux types cellulaires sont principalement localisés dans des compartiments intracellulaires et contribuent vraisemblablement à leur acidification.

Depuis 1992 et le clonage de ClC-2 [67], on sait que les transcrits sont présents dans les tissus épithéliaux touchés par mucoviscidose. Ces canaux de faible conductance (environ 3 pS) sont activés par hyperpolarisation, par acidification du milieu extracellulaire, par hypo-osmolarité et par élévation de Cl intracellulaire. La protéine canalaire fonctionne sous forme dimérique et se caractérise par l’existence de deux pores formés chacun par un monomère. Chaque protopore comprend 907 acides aminés et l’analyse hydropathique suggère la présence de 12 domaines transmembranaires. Comme pour les autres membres de cette famille la séquence de perméabilité du canal ClC-2 est Cl>Br>I. Ces canaux sont bloqués par les ions Zn2+ et Cd2+3 mais très peu par les inhibiteurs communs des canaux anioniques comme le DIDS, le DPC ou le NPPB. Les propriétés de rectification entrante du canal ClC-2 favorables à un efflux de Cl ont très vite laissé suspecter que ce canal puisse contribuer à la sécrétion de chlorures. La démonstration d’une forte expression apicale de ClC-2 dans le poumon fœtal est en accord avec le rôle sécréteur de ce tissu à ce stade embryonnaire [68]. Depuis, d’autres études ont confirmé une localisation apicale tout au long de l’arbre bronchique après la naissance, chez le rat comme chez l’homme. Par contre, dans l’intestin grêle et le colon humains l’expression semble préférentiellement intracellulaire et confinée dans les cellules de surface qui n’expriment pas CFTR et qui sont surtout engagées dans des fonctions d’absorption [69]. D’un point de vue fonctionnel, leur rôle dans les épithéliums demeure hypothétique dans la mesure où l’on ne dispose pas d’outil pharmacologique spécifique et que l’invalidation du gène ne fait apparaître de troubles majeurs qu’au niveau de la rétine et des voies génitales [70].

Le canal ClC-2 n’est pas le seul représentant de cette famille à être exprimé dans les cellules intestinales et pulmonaires. Des études récentes suggèrent que la protéine ClC-4, bien que localisée principalement dans des vésicules intracellulaires, pourrait être recyclée vers la membrane apicale des cellules de cryptes intestinales [71]. Une expression apicale de ClC-5 a également été rapportée dans la trachée et les bronchioles de rat [72]. Par ailleurs, la présence d’un isoforme de ClC-3 contenant un motif consensus de liaison pour la protéine EBP-50 a été décrite dans les cellules ciliées ainsi que dans d’autres cellules épithéliales. Dans des systèmes hétérologues cette forme de ClC-3 facilite l’activation par CFTR du canal ORCC faisant apparaître un nouvel élément dans les complexes protéiques associés à CFTR [73].

Canaux CLIC

Le premier gène de cette famille a été cloné à partir du rein [74]. Cette famille comprend des protéines de petite taille (250-450 acides aminés) qui sont capables de former des canaux chlorures lorsqu’elles sont incorporées dans des vésicules « in vitro ». Leur localisation intracellulaire dans des types cellulaires variés soit dans les noyaux (CLIC1), dans les mitochondries (CLIC4) ou dans des vésicules de sécrétion (CLIC4 et5) suggère qu’elles participent à la régulation du pH de ces compartiments comme certains canaux ClC [66]. Un nouveau membre de cette famille, dénommé parchorin en raison de son expression préférentielle dans les cellules pariétales gastriques et du plexus choroïde, est également présent dans le rein, les glandes salivaires, mais aussi dans les canaux pancréatiques, les cellules de surface de la trachée et des bronches et dans les pneumocytes de type II [75]. Cette protéine présente la particularité d’être soluble mais acheminée à la membrane en réponse à une stimulation ; par exemple en réponse à une augmentation de AMPc dans les cellules pariétales ou après élimination de Cl extracellulaire dans une lignée de cellules rénales [76].

Les recherches futures

Le champ de recherche sur la pathophysiologie de la mucoviscidose s’élargit considérablement. Après une décennie d’études centrées autour de la protéine CFTR-canal Cl, une attention croissante a été portée sur les protéines d’interaction, sur les fonctions de CFTR autres que le canal Cl, sur les canaux Cl apicaux alternatifs ou encore sur d’autres transporteurs impliqués dans la régulation des flux ioniques transépithéliaux, ainsi que sur l’analyse globale des protéines dont l’expression est modulée chez les patients. Les progrès technologiques permettant cette analyse protéomique sont considérables. Aujourd’hui, grâce à l’analyse par électrophorèse bidimensionnelle et à la spectrométrie de masse, il est possible d’identifier des milliers de protéines. Certes elles ne représentent que les protéines les plus abondantes (environ 10 % des protéines totales d’une cellule à un instant donné), mais les développements technologiques sont si rapides que l’on peut espérer pouvoir identifier les protéines faiblement abondantes dans un futur proche.

Toutes ces études sont considérablement ralenties par une quasi-absence d’outils pharmacologiques qu’il sera indispensable de développer dans les années à venir.

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3 Zn2+ : zinc ; Cd2+ : cadmium.2 I = iode ; NO3 = nitrate ; Br = brome ; Cl = chlore ; F = fluor.1 Le nom PDZ est composé des premières lettres de 3 protéines dans lesquelles le motif de liaison a été identifié pour la première fois : PSD-95, Drosophila melanogaster Disc-Large protein et zona ocludens 1 protein, ZO-1.