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La cytométrie en flux : intérêt dans le diagnostic phénotypique et le suivi des hémopathies malignes


Annales de Biologie Clinique. Volume 60, Numéro 6, 663-72, Novembre - Décembre 2002, Revues générales


Résumé   Summary  

Auteur(s) : B. Drénou, O. Fardel, R. Fauchet, L. Amiot, Laboratoire d’hématologie-immunologie, Hôpital Pontchaillou, CHU Rennes, 35033 Rennes cedex 09.

Résumé : Le diagnostic des hémopathies malignes, et en particulier celui des leucémies aiguës et des lymphomes malins non hodgkiniens, est basé sur une analyse multiparamétrique : à côté de la morphologie, des études phénotypiques et génétiques (cytogénétiques et moléculaires) sont actuellement nécessaires. Certaines entités ont été décrites ou ne sont reconnues que par l’une des ces approches. La cytométrie en flux permet de caractériser ainsi le composant normal cellulaire dont dérive la prolifération, le degré de différenciation au sein de cette lignée. En outre, elle définit la clonalité en particulier dans les proliférations lymphoïdes B mais aussi T, elle recherche l’existence éventuelle de critère de malignité tel que des trous phénotypiques ou des expressions d’antigène aberrant. Enfin, elle précise des critères pronostiques. Parmi les différentes hémopathies, les leucémies aiguës lymphoblastiques sont préférentiellement reconnues par cette approche, alors que dans les leucémies aiguës myéloblastiques le phénotypage permet une confirmation du diagnostic cytologique et la recherche de facteurs pronostiques. Un système de score (EGIL) permet d’assigner aux cellules tumorales leur contrepartie normale à une lignée en fonction de l’expression de différents marqueurs. Dans les lymphopathies chroniques, l’immunophénotypage peut faire le diagnostic grâce à un système analogue tel que le système du score de Matutes dans la leucémie lymphoïde chronique. Dans d’autres pathologies, comme les lymphomes du manteau, le lymphome folliculaire, les leucémies à tricholeucocytes, certaines combinaisons antigéniques permettent d’évoquer le diagnostic mieux qu’en immunohistochimie. En effet, la coexpression de plusieurs marqueurs est un élément essentiel de cette approche diagnostique qu’il peut être difficile à mettre en évidence sur coupe. Enfin, lors du suivi sous traitement, la détection de la maladie résiduelle basée sur la détection d’événements rares caractérisés par un phénotype spécifique est une approche qu’il convient d’évaluer par rapport, en particulier, aux techniques de biologie moléculaire.

Mots-clés : cytométrie en flux, leucémie aiguë, leucémie chronique, lymphome, immunophénotypage, maladie résiduelle.

Illustrations

ARTICLE

Le diagnostic des hémopathies malignes repose sur le recueil d’un ensemble d’éléments biologiques dont l’analyse morphologique qui est à la base des principales classifications, comme la classification FAB pour les leucémies aiguës ou les classifications REAL ou de KIEHL pour les lymphomes non hodgkiniens [1, 2]. Ces techniques sont relativement peu onéreuses, mais nécessitent des cytologistes ou des anatomopathologistes expérimentés dans un centre ayant un fort recrutement. Il est nécessaire aujourd’hui d’adjoindre d’autres approches comme l’analyse phénotypique, l’analyse cytogénétique, l’analyse moléculaire. Ainsi, de nombreuses entités n’ont été décrites ou ne sont, aujourd’hui, reconnues que par l’une ou plusieurs de ces approches. Elles sont toutes complémentaires, et doivent s’intégrer dans une démarche non systématique et raisonnée dans le cadre d’une collaboration entre les différents acteurs au laboratoire, collaborant à la construction médicale d’un diagnostic. L’immunohistochimie ou l’immunocytochimie permettant de révéler l’expression de quelques antigènes, en général en simple marquage sur les coupes de tissus ou les frottis cellulaires, nécessitent une analyse morphologique. Cela permet une adéquation entre observation morphologique et expression antigénique. L’autre approche consiste à utiliser la cytométrie de flux qui permet, quand les cellules sont dissociées, ce qui est la règle générale dans les hémopathies, d’effectuer une analyse des protéines membranaires mais aussi intracytoplasmiques. Il est possible de tester en général un plus grand nombre d’antigènes en multimarquages. Ainsi, il est possible de déterminer des sous-populations cellulaires minoritaires, dont le caractère anormal ne peut provenir que de l’expression concomitante de deux marqueurs, qui, pris séparément, ne sont pas obligatoirement anormaux. Cette technique, qui s’est imposée dans le diagnostic des leucémies aiguës, voit son intérêt croître aujourd’hui, dans le cadre des lymphopathies qui sont de plus en plus fréquentes et dont les classifications intègrent maintenant le phénotypage.

Données techniques concernant la cytométrie de flux

Les cytomètres

Les cytométries en flux permettent l’analyse de cellules en suspension. Au niveau d’une chambre de lecture, une lumière provenant d’un ou de plusieurs lasers permet d’éclairer les cellules qui ont été préalablement marquées avec différents fluorochromes, afin d’émettre différentes lumières, qui sont recueillies en temps réel sur différents photomultiplicateurs grâce à des jeux de filtres. Ainsi, les cytomètres actuellement disponibles permettent de recueillir deux paramètres de réémission " spontanée " de lumière déterminant des paramètres dits " morphologiques " : il s’agit du right angle scatter (ras, SSC), paramètre de granularité cellulaire et du foward angle scatter (fas, FW, FSC) ou paramètre de taille. De plus, sont recueillis simultanément de trois à six paramètres de fluorescence, spécifiques de chacun des anticorps monoclonaux utilisés pour le marquage cellulaire. Si, dans des applications répétitives comme le phénotypage de cellules normales (populations lymphocytaires), il est facile et logique d’utiliser des marquages en quatre couleurs, cette stratégie, très efficace également dans le phénotypage des hémopathies, justifie des mises au point techniques dont la principale est la nécessité d’appliquer des compensations électroniques aux fluorescences recueillies : en effet, si la fluorescéine (FITC) émet dans le spectre au niveau du vert (autour de 530 nanomètres), ce spectre d’émission s’étend assez loin en dehors de cette zone et des fluorescences " parasites " pourront être observées pour des cellules marquées avec ce fluorochrome lorsque l’on étudie une fluorescence orange autour de 575 nm. Ces réglages préalables à tout protocole sur le cytomètre sont la garantie d’un résultat performant. À côté de ces analyseurs, existent des cytomètres trieurs dont le débit, en termes de tri cellulaire, est souvent inférieur à celui imaginé par les utilisateurs non avertis et dont l’intérêt est actuellement réservé à la recherche.

Les anticorps monoclonaux

D’origine le plus souvent murine, les anticorps monoclonaux sont dirigés essentiellement contre des antigènes membranaires des cellules hématopoïétiques. Ils sont regroupés dans une classification régulièrement mise à jour à l’occasion de workshops dont le dernier s’est tenu à Harrogate (Grande-Bretagne). Ces ateliers de travail permettent d’assigner aux différents anticorps monoclonaux proposés, l’appartenance à un cluster de différenciation. Il en existe plus de 250 actuellement (tableau 1). La détection d’antigènes intracytoplasmiques voire intranucléaires est également possible.

Les principaux fluorochromes

Le nombre de fluorochromes disponibles pour effectuer les phénotypages va en augmentant avec l’utilisation de cytomètres permettant des analyses avec de multiples couleurs. Chaque fluorochrome est une molécule qui doit être excitable par l’émission du laser (spectre d’excitation) et émettre une lumière distincte de celle produite par les autres fluorochromes, mesurable par le système optique du cytomètre (spectre d’émission). Les substances les plus usuelles sont les suivantes : - FITC (isothiocyanate de fluorescéine) : il s’agit d’une petite molécule stimulable par un laser usuel à argon à 488 nm (poids moléculaire 389), elle émet dans le vert à 525 nm. D’utilisation très courante, peu onéreuse, elle nécessite l’application d’une assez forte compensation lorsqu’elle est associée à la phycoérythrine (PE). De plus son intensité d’émission est très dépendante du pH. - PE (R-phycoérythrine) : il s’agit d’une assez grosse molécule de la famille des phycobiliprotéines (poids moléculaire 240 000). Elle est aussi stimulable par un laser à argon et émet dans l’orange entre 565 et 590 nm. - PE-Cy5 (PE-cyanine 5) : le principe de ce fluorochrome, également utilisable avec un laser argon, est le transfert d’énergie : il s’agit d’un tandem de deux molécules dont la première est la PE qui a un spectre d’émission correspondant au spectre d’excitation de la seconde. Celle-ci est la cyanine 5 qui va ainsi être stimulée et émettre à 667 nm dans le rouge. Ce fluorochrome particulièrement pratique pour effectuer des triples marquages a l’inconvénient d’avoir une chimie de couplage aux anticorps assez difficile à maitriser, ce qui explique des prix et des résultats de qualités très différentes d’une société à une autre. - APC (allophycocyanine) : ce fluorochrome n’est pas excitable par un laser à argon et nécessite un laser hélium/néon pour une excitation rouge/orange à 590 nm et une émission entre 645 et 675 nm.

Les techniques de marquage

Les techniques sont parfois des techniques d’immunofluorescence indirecte, l’anticorps spécifique primaire étant révélé secondairement par un anticorps de seconde couche fluorescent. Le plus souvent, en particulier lorsqu’il y a multiples marquages, la technique utilisée est celle de l’immunofluorescence directe. Le principe de la détection d’un marquage spécifique est basé sur la détection de la fluorescence générée par des cellules incubées en présence d’un anticorps contrôle qui est du même isotype et du même animal ; de plus, il doit être couplé de la même manière avec le même fluorochrome. Cet anticorps définit un seuil au-delà duquel on parle de positivité. L’intensité de la fluorescence est, si l’on travaille avec des IgG à saturation, proportionnelle à l’expression antigénique. Cette propriété permet ainsi, par différentes techniques, de mesurer la densité antigénique à la surface d’une cellule.

Le rôle de la cytométrie en flux dans les hémopathies

Il faut distinguer cinq rôles principaux à la cytométrie en flux dans la caractérisation d’une hémopathie maligne.

La nature de la prolifération

Il s’agit de préciser quelle est l’origine cellulaire ‘‘lineage’’ de la prolifération tumorale à caractériser. Ainsi, des anticorps monoclonaux ‘‘clusterisés’’ et dirigés contre des antigènes communs à toute la lignée sont utilisés : CD3 est situé sur les lymphocytes T, CD19 ou CD20 sur les lymphocytes B, CD 56 et/ou CD16 sur les lymphocytes NK, CD 13 ou CD 33 sur les cellules granulomonocytaires. L’origine de la prolifération est à la base de la classification des hémopathies (figure 1).

Le degré de différenciation au sein de la lignée

Il apparaît logique de préciser ce critère, une fois la lignée déterminée. Il pose, en fait, plus de problèmes qu’il n’y paraît, s’agissant de cellules anormales qui ont des expressions antigéniques aberrantes. De plus, si ce critère CD 19 CD 22 CD 22 CD 5 CD 5 CD 3 CD 3 CD 3 CD 8 CD 34 CD 34 CD 19 CD 20 CD 5 CD 33 CD 19 CD 10 CD 8 CD 4 CD 4 CD 19 CD 56 a b c d e f 1 000 100 10 1 1 10 100 1 000 1 000 100 10 1 1 10 100 1 000 1 000 100 10 1 1 10 100 1 000 1 000 100 10 1 1 10 100 1 000 1 000 100 10 1 1 10 100 1 000 1 000 100 10 1 1 10 100 1 000 1 000 100 10 1 1 10 100 1 000 1 000 100 10 1 1 10 100 1 000 1 000 100 10 1 1 10 100 1 000 1 000 100 10 1 1 10 100 1 000 1 000 100 10 1 1 10 100 1 000 apparaît important d’un point de vue fondamental, il s’avère souvent de peu d’intérêt en pratique clinique où la discrimination entre cellules immatures et cellules matures est suffisante. La coexpression du marqueur d’immaturité CD 34 avec CD 33 permet ainsi de parler de blastes myéloïdes en accord avec le diagnostic de leucémie aiguë myéloblastique ; ce même marqueur CD 34 associé à CD19 est en faveur du diagnostic de leucémie aiguë lymphoblastique (figure 1f).

La clonalité

Il s’agit d’un critère majeur qui peut souvent être caractérisé par la cytométrie en flux. En effet, toute prolifération tumorale est une prolifération à l’origine clonale (l’inverse n’est évidemment pas vrai). Il convient donc, dans une prolifération B de définir la restriction isotypique soit kappa soit lambda (figure 2a). Il existe chez l’homme, environ deux fois plus de lymphocytes B kappa (+) que de lymphocytes lambda (+) dans une prolifération réactionnelle. En ce qui concerne les proliférations T, la cytométrie de flux est moins performante que les études de biologie moléculaire par exemple. Néanmoins, depuis peu, des panels d’anticorps monoclonaux dirigés contre les principales familles de V b permettent de montrer une expansion d’allure clonale par une restriction isotypique de la chaîne b du TCR (figure 2b) [3]. En ce qui concerne les proliférations natural killer (NK), où la biologie moléculaire n’est pas opérante, l’on peut imaginer qu’une expression assez caractéristique d’un ensemble de marqueurs comme les killer Ig like receptors (KIR) permette d’appréhender cette notion de clonalité.

Des critères de malignité

Ces critères sont inconstants, mais leur mise en évidence précise à la fois le caractère anormal de la prolifération, ainsi que son caractère clonal. Il s’agit, par exemple, de la mise en évidence d’un trou phénotypique avec perte de l’expression d’antigènes physiologiquement dirigés contre une lignée. On observe par exemple la perte de l’antigène CD20 ou du CD19 pour un lymphocyte B. Il est possible d’observer une perte partielle ou totale des molécules HLA de classe I (figure 3d) ce qui permettrait l’échappement de la tumeur au système immunitaire. Il peut s’agir aussi d’un marqueur aberrant normalement absent sur des cellules de la lignée concernée. La recherche de critères pronostiques Il s’agit d’éléments intéressants bien que peu utilisés. Ainsi l’expression du récepteur de la transferrine (CD71) sur des lymphomes malins est un marqueur indirect de la prolifération cellulaire et donc des capacités d’une prolifération tumorale hématologique (figure 3c).

Les principales hémopathies malignes pouvant bénéficier de la cytométrie en flux

Les leucémies aiguës

La classification des leucémies aiguës repose avant tout sur l’analyse morphologique et cytochimique et elle est souvent confortée par l’analyse cytogénétique. L’apport Kappa/Vert Lambda/Orange a b 1 1 des anticorps monoclonaux et de la cytométrie en flux dans ces pathologies permet de caractériser les points précédemment cités sur des prélèvements sanguins ou mieux médullaires, le plus souvent après séparation cellulaire de type Ficoll puisque les cryopréservations de cellules sont en général à associer dans le cadre des protocoles. - La définition de la lignée atteinte (lymphoïde B, lymphoïde T ou myéloïde) qui est particulièrement importante pour les leucémies aiguës lymphoblastiques, est définie au mieux par le système de score du groupe français du GEIL (Groupe pour l’étude immunologique des leucémies) ou dans la classification européenne de l’EGIL (European group for the immunologic classification of leukaemia) [4]. Le tableau 2 indique le niveau de pondération respectif des principaux antigènes détectés. Une assignation à une lignée nécessite un score supérieur à 2 pour la lignée myéloïde et à 1 pour la lignée lymphoïde. Il permet en particulier de caractériser les leucémies aiguës avec une origine ambiguë, c’est-à-dire les leucémies aiguës bi-phénotypiques ou les leucémies aiguës indifférenciées. - La caractérisation du type de leucémie aiguë est parfois possible. Ainsi, la leucémie aiguë myéloblastique avec translocation t (8;21) peut être évoquée devant un cas de leucémie aiguë myéloïde par l’expression particulièrement intense du marqueur CD34, la coexpression sur ces blastes myéloïdes du marqueur pan-B CD19 et parfois le marqueur CD56. La confirmation sera ainsi obtenue en cytogénétique traditionnelle, par technique FISH ou encore en biologie moléculaire par mise en évidence du réarrangement ETO-AML1. - La caractérisation d’un facteur pronostique est également possible : c’est le cas par exemple de l’expression du marqueur d’immaturité CD 34 qui est, dans la majorité des études, corrélée à un plus mauvais pronostic dans les leucémies aiguës myéloblastiques. - L’analyse du cycle cellulaire avec en particulier la détection de la ploïdie cellulaire peut être appliquée en cytométrie aux leucémies aiguës. Celle-ci, qui a une valeur pronostique, en particulier dans les leucémies aiguës lymphoblastiques de l’enfant est déterminée de façon systématique dans un certain nombre de protocole thérapeutique. Il ne s’agit pas à proprement parler de phénotypage bien que depuis peu, il soit possible d’effectuer un comarquage entre le cycle cellulaire d’une part et un marquage spécifique des blastes au niveau membranaires d’autre part. - Le caractère tumoral d’une prolifération cellulaire leucémique peut être affirmé avec la détection de trous phénotypiques ou de phénotypes aberrants. On peut citer ainsi en exemple l’expression de CD34 sur des cellules circulantes, la coexpression de CD4 et de CD8 quasi caractéristique de blastes lymphoïdes T, la coexpression de CD7 sur des cellules myéloïdes caractéristiques fréquentes des blastes de leucémies aiguës myéloblastiques. - Expression de CD45 : la difficulté, au sein d’un échantillon pour caractériser les blastes leucémiques, est de pouvoir les isoler au sein des autres cellules pour pouvoir les étudier. Un consensus est quasiment obtenu actuellement par les équipes réalisant ce type de phénotypage pour effectuer un " fenêtrage immunologique " sur les cellules de phénotype " CD45 faible ". Il s’agit d’un marqueur panleucocytaire (antigène leucocytaire commun) qui est très utilisé par les anatomopathologistes. On peut, sur ce seul critère, isoler les blastes qui seront marqués avec d’autres anticorps monoclonaux couplés à d’autres fluorochromes dans des tests en deux, trois ou quatre couleurs. La tendance est donc à l’inclusion d’un anticorps monoclonal couplé à CD45 dans la majorité des combinaisons testées dans ce cadre. - La détection de la maladie résiduelle, dans les leucémies aiguës, est en théorie une technique particulièrement séduisante. Elle est rapportée par différents auteurs avec des sensibilités très inférieures à 1 pour 1 000 dans la majorité des cas. En fait, plusieurs remarques doivent être faites dans ce cadre : 1) il s’agit d’une approche particulière, correspondant à la détection de cellules rares et justifiant une stratégie systématique de détection de combinaisons à base d’anticorps monoclonaux informatifs dans ce but. La détection doit utiliser l’enregistrement d’un nombre particulièrement élevé d’événements cellulaires afin d’obtenir suffisamment de cellules anormales. Cette approche est connue sous le terme de détection d’événements rares ; 2) toutes les leucémies aiguës lymphoblastiques ou myéloblastiques ne disposent pas toujours de combinaisons permettant ce type d’étude. Il n’est pas évident que la combinaison antigénique ainsi définie " à la carte " ne définisse pas une population cellulaire présente à de très faible pourcentage à l’état physiologique dans l’échantillon cellulaire analysé ; 3) les études portant sur ce sujet réellement bien documentées sont finalement peu nombreuses et émanent de peu d’équipes dans le monde [5-7].

Les lymphopathies (leucémie lymphoïde chronique et lymphomes)

Il s’agit d’une application moins " classique " du phénotypage des hémopathies. Néanmoins, c’est ici que le phénotypage prend de plus en plus d’intérêt dans la pratique quotidienne.

La leucémie lymphoïde chronique B (LLC-B)

La définition de la leucémie lymphoïde chronique est encore, dans bon nombre de traités, livres et cours, une prolifération de petits lymphocytes murs caractérisés par une hyperlymphocytose à plus de 4 000 éléments par millimètre cube. En fait, aujourd’hui la définition de la leucémie lymphoïde chronique est avant tout phénotypique, et s’il est difficile de retenir le diagnostic de LLC-B avec moins de 4 000 lymphocytes par millimètre cube (bien que ceci soit assez fréquent en pratique), bon nombre d’hyperlymphocytoses à lymphocytes plus ou moins atypiques doivent avoir recours à un phénotypage pour être rattachées ou non au groupe des LLC-B. S’il persiste une hétérogénéité cytologique, d’intérêt éventuellement pronostique, dans les LLC ainsi définies, le phénotype en est homogène d’un type cytologique à l’autre. Bien que parfois réalisé au niveau médullaire, le phénotype est faisable au niveau sanguin, de telle sorte qu’aucune analyse médullaire ne soit nécessaire tant dans un but diagnostique que pronostique. Le choix d’une technique sans séparation cellulaire, en lyse, est envisageable mais nécessite une procédure particulière (lavage avant marquage) pour l’étude des immunoglobulines de surface. Ce phénotype de la leucémie lymphoïde chronique a été défini au mieux par Matutes (Royal Mardsten Hospital - Londres) qui a décrit un système de score [8] (tableau 3). Le phénotype classique est celui d’un lymphocyte B coexprimant le marqueur pan T CD5 avec un score de 4 ou 5 (figure 1d). Les lymphopathies avec un score de 0, 1 ou 2 répondent en fait toujours à des lymphomes leucémiques, le score de 3 est plus ambigu et ne permet pas de trancher mais est assez rarement observé. Si l’on part d’un échantillon ganglionnaire, le score reste applicable dans notre expérience et il s’agira dans ce cadre d’un lymphome " lymphocytique ". Le pronostic de cette hémopathie particulièrement fréquente, est basé actuellement sur la classification clinique soit de Rai aux États-Unis, soit de Binet en Europe. Il existe de nombreux facteurs biologiques pronostiques prédictifs d’une évolution défavorable, dont le plus récent et le plus important est probablement la détection d’hypermutations somatiques au niveau du gène de la chaîne lourde des immunoglobulines. Néanmoins, ce paramètre est inutilisable en pratique clinique et les meilleures corrélations avec ce paramètre - bien qu’elles aient été discutées et qu’elles soient inconstantes - correspondent à la coexpression de la molécule CD38 à la surface des cellules leucémiques (figure 3a). Ainsi les LLC-B CD38- sont de meilleur pronostic que les leucémies B CD38+.

La leucémie prolymphocytaire

Il s’agit d’une affection rare. Si la majorité des cas est de phénotype T CD3+ et CD8+, la leucémie prolymphocytaire B, de novo, est caractérisée par l’absence d’expression de CD5 et de CD10. Le marqueur pan B CD20 et l’immunoglobuline de surface sont d’intensité particulièrement forte.

La leucémie à tricholeucocytes

Un peu plus fréquente que la précédente, son diagnostic est essentiellement basé sur l’examen morphologique du sang ou de la moelle qui objective des expansions cytoplasmiques. Celles-ci sont responsables en cytométrie de la projection inhabituelle de ces cellules lymphoïdes sur les cytogrammes morphologiques (scatter grammes) dans une zone proche des monocytes. Un fenêtrage immunologique par un marqueur pan B permet de préciser leur phénotype B CD5-, CD25+, CD11c+, CD103+ [9]. Ces marqueurs permettent de les différencier des tricholeucocytes variants qui ne les expriment pas et qui présentent une réponse différente aux traitements.

Les lymphomes malins

Il s’agit d’une application qui est souvent peu détaillée dans la littérature, mais les classifications des lymphomes malins depuis 1994 (Real classification ou classification actuelle de l’OMS) utilisent en plus de la morphologie, les données phénotypiques, génotypiques et caryotypiques afin d’obtenir une classification la plus objective possible [2]. La cytométrie de flux permet très facilement le bilan d’extension dans le sang et dans la moelle à partir d’une analyse effectuée au diagnostic au niveau d’un échantillon (par exemple ganglionnaire, ou d’un liquide). Elle permet en outre le suivi en cours de traitement de la maladie résiduelle, dans une zone de sensibilité supérieure à 1 % ce qui est souvent suffisant dans les lymphomes, en particulier en cas de bas grade de malignité. Quelques repères peuvent être donnés pour différencier les différents types de lymphomes : - le lymphome folliculaire, dont le diagnostic est typiquement anatomopathologique et éventuellement cytogénétique en retrouvant les translocations usuelles en particulier la t (14;18) impliquant le proto-oncogène Bcl 2. Il s’agit d’une lymphopathie B CD5- souvent CD10+ ; - le lymphome du manteau, pour lequel la morphologie est souvent pris en défaut compte tenu du caractère souvent diffus de la prolifération et du grand pléïomorphisme cellulaire, doit être évoqué sur le phénotype afin de rechercher soit la translocation t(11;14) soit l’hyperexpression de la cycline D1 (Bcl 1) secondaire à cette translocation. Il s’agit d’un lymphome B CD5+, le plus souvent CD23-. Il n’exprime jamais CD10, l’expression des immunoglobulines qui sont des IgM et/ou des IgD, est intense de même que l’expression de CD20. Les formes, avec une localisation digestive, qui sont particulièrement fréquentes, coexpriment une molécule de homing digestif, l’intégrine b7 (exemple : figure 3b). Les formes blastoïdes variantes sont souvent caractérisées par une tétraploïdie qui peut être déterminée en cytométrie en flux ; - les lymphomes de MALT ainsi que les lymphomes de la zone marginale n’ont pas de phénotype très particulier, ils sont CD5-, CD10- ; - les lymphomes B diffus à grandes cellules, qui sont particulièrement fréquents, sont des lymphomes B, le plus souvent CD5-, parfois CD10+ coexprimant fortement le CD71 marqueur de prolifération ; - les lymphomes lymphoblastiques s’apparentent aux leucémies aiguës lymphoblastiques alors que le lymphome de Burkitt est souvent CD10+ ; - les lymphomes T sont parfois difficiles à caractériser en cytométrie en flux. Toutefois, une expression exclusivement intracytoplasmique du CD3, un trou phénotypique en CD7 ou en CD2 permet de repérer une sous-population cellulaire d’intérêt diagnostique qui sera particulièrement facile à suivre dans le cadre de la maladie résiduelle (figure 3e). Les lymphomes T épidermotropes et particulièrement le syndrome de Sézary qui est la forme " leucémoïde " de ces hématodermies, présente un phénotype de lymphocyte T CD4+ avec, de façon inconstante, un trou phénotypique en CD7. L’étude du répertoire V b prend ici tout son intérêt ; - les lymphomes NK : il s’agit de lymphomes particulièrement agressifs et rares qui ont une définition quasi exclusivement phénotypique soit sur coupe anatomo-pathologique, soit en cytométrie en flux. La présence d’un marqueur NK en particulier comme le CD56 (en l’absence de marqueur T) souvent coexprimé avec CD8 ou en l’absence de marquage CD4 ou CD8 est un argument en faveur de ce type d’atteinte (figure 1c).

Les cas particuliers

Dans un certain nombre d’hémopathies dont l’exploration repose traditionnellement sur différentes approches non cytométriques, le phénotypage en CMF peut être parfois utile.

Les proliférations de grands lymphocytes à grains (LGL: large granular lymphocyte)

Il s’agit de proliférations de lymphocytes souvent chroniques pouvant induirent une hyperlymphocytose qui se rencontre parfois dans un contexte autoimmum (polyarthrite rhumatoïde en particulier), parfois en post greffe ou encore de façon systématique lors de la réalisation d’un hémogramme. On distingue les proliférations T exprimant CD3 et les cellules NK ne l’exprimant pas, et l’on parle de prolifération NK vraie non T [10]. Dans les deux cas, la définition de la prolifération de cellules NK peut être abordée par la cytométrie en flux avec l’utilisation des marqueurs NK suivants : CD16 (spécifique des cellules NK au sein des lymphocytes), CD56 (même remarque) et CD57. On peut y rajouter le CD 122 (récepteur b de l’interleukine 2) et des marqueurs spécifiques des molécules fonctionnelles activatrices ou inhibitrices de la fonction NK retrouvée sur ces cellules. Ainsi, des molécules de type KIR (killer Ig like receptor) sont parfois exprimées sur des sous-populations de LGL, traduisant indirectement le caractère polyclonal qui ne peut être abordé d’aucune autre manière puisqu’il n’existe pas de réarrangement ni du gène des immunoglobulines ni d’un gène de récepteur T à l’antigène.

Les leucémies/lymphomes de type CD4+, CD56+ Il s’agit d’une entité récemment décrite et s’apparentant aux cellules dendritiques lymphoïdes de type pré-DC 2. Il s’agit, tantôt d’une présentation de type leucémie aiguë, tantôt de type lymphome avec une fréquence des atteintes extraganglionnaires en particulier cutanées. L’analyse cytométrique systématique de plus de 20 cas au sein du GEIL a permis leur individualisation [11]. Ces proliférations ont pour phénotype CD4+, CD56+, CD123+, CD34-, CD11C- en l’absence d’autres marqueurs de lignée en nombre suffisant pour les assigner à une lignée particulière.

Les myélomes

Il n’existait pas, jusqu’alors, d’intérêt de réaliser de phénotypage dans cette pathologie. La mise à disposition d’un anticorps monoclonal caractéristique des plasmocytes (CD138 au Syndecan) a permis d’isoler ces cellules et d’en préciser par exemple la clonalité en intracytoplasmique, en effet elles n’expriment pas d’immunoglobulines de surface Igs(-). Elles ne portent pas les antigènes pan B CD19 et CD20 et le co-marquage de CD56 serait assez caractéristique des plasmocytes tumoraux. Des études des puces ADN récentes feraient de la perte de CD27 l’un des marqueurs les plus spécifiques des proliférations plasmocytaires, sans qu’aucune série de cytométrie n’ait encore validé ce paramètre théorique. Même si ce type de données pouvait modifier la valeur diagnostique de la cytométrie, elles n’ont pas été utilisées dans ce sens et l’on propose actuellement deux applications de la cytométrie dans cette pathologie : - détermination de l’index ADN qui a une valeur pronostique. - détection de la maladie résiduelle avec une stratégie validée sur des bases cliniques mais de façon paucicentrique.

L’hémoglobinurie nocture paroxystique (HNP) ou maladie de Marchiafava-Micheli

Il s’agit ici de dépister très facilement, sur l’ensemble des lignées, les cellules dérivant du clone pathologique appelé clone HNP caractérisé par la perte des molécules liées à l’ancre gluco-phospho-inositol (GPI). Ainsi, l’on peut montrer la perte du CD55 ou du CD59 sur les hématies, du CD14 sur les monocytes, du CD66 b ou du CD16 sur les polynucléaires, du CD48 sur les différentes souspopulations lymphocytaires, du CD24 sur les lymphocytes B ou encore du CD59 sur les plaquettes, par exemple. Ce clone, dont on sait aujourd’hui qu’il n’est pas d’origine tumorale, bien qu’il résulte de la mutation du gène pigA est ainsi recherché non seulement dans les cas typiques d’anémie hémolytique acquise mais aussi devant toutes les aplasies médullaires qui sont souvent associées à l’existence d’un tel clone. Ce test diagnostique phénotypique en cytométrie en flux remplace souvent les tests traditionnels de lyse en gradient d’acidité ou en gradient de sucrose, plus grossier et qui surtout ne testent que la lignée érythrocytaire.

Phénotype et syndromes myéloprolifératifs

Il n’y a, actuellement, qu’une seule application récente de la cytométrie en flux dans les syndromes myéloprolifératifs (à l’exclusion de la transformation de la leucémie myéloïde chronique (LMC) en leucémie aiguë bien évidemment). Il s’agit de détecter le nombre de cellules immatures CD34+ circulantes dans la splénomégalie myéloïde avec myélofibrose. Ce chiffre apparaît comme un facteur pronostique, dans cette affection dont l’évolution est particulièrement lente et pour laquelle aucune thérapeutique n’est disponible.

Phénotypage et thérapie cellulaire

Aujourd’hui, les activités de thérapie cellulaire pour les traitement des hémopathies malignes en particulier ont toutes besoin d’un phénotypage aux différentes étapes de la procédure et dans le suivi de celle-ci. Dans l’autogreffe de moelle, il est souhaitable de disposer du phénotype de l’hémopathie du patient afin de pouvoir effectuer une recherche de la maladie résiduelle dans le greffon si d’autres techniques ne peuvent être utilisées, en particulier, la biologie moléculaire. La détermination de la valeur hématopoïétique du sang avant cytaphérèse en sortie d’aplasie et sous facteur de croissance est réalisée dans la majorité des centres par la numération des cellules CD34, le matin de la cytaphérèse. Le chiffre de 10 à 20 cellules CD34 par mm3 prédit l’efficacité de la procédure de recueil. Le greffon est analysé de la même manière. Un seuil supérieur à 1 ou 2 x 106 cellules CD34+/kg de poids de patient est un garant d’une reprise hématopoïétique rapide. (Il est clair que le cas des leucémies aiguës CD34+ doit faire l’objet de contrôles particuliers). Ce type de donnée, particulièrement rapide et peu onéreuse est parfaitement corrélée aux données des cultures de ces CFU-GM qui sont toujours obligatoires légalement en France. Dans les allogreffes de moelle osseuse, la détermination de la composition cellulaire du greffon peut être intéressante. Il est nécessaire, lorsqu’il s’agit de réaliser une " infusion des lymphocytes du donneur " puisque la dose à réinjecter est 1 x 106 cellules CD3+/kg de poids de malade à 1 x 108 CD3+/kg de poids de patient.

CONCLUSION

La cytométrie en flux, après avoir été particulièrement utilisée dans le cadre des leucémies aiguës, permettant d’affirmer le caractère lymphoblastique d’un certain nombre de cas indifférenciés morphologiquement, trouve aujourd’hui son intérêt dans le phénotypage de beaucoup d’autres types d’hémopathies, excepté actuellement les syndromes myélo-prolifératifs et les myélomes. Elle est un outil utile dans le diagnostic et le suivi des patients. Elle trouve sa place à côté des analyses morphologiques cytologiques ou anatomopathologiques et avant les analyses s’intéressant au génome comme la cytogénétique ou la biologie moléculaire. Dans le futur, s’agissant d’une technique particulièrement sophistiquée de la " protéomique ", il est à parier qu’elle en sera l’une des composantes à part entière.

Article reçu le 1er juillet 2002, accepté le 30 août 2002

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