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Comparaison entre All.Dix®-Pneumallergènes (All.Diag) et tests cutanés pour le diagnostic des allergies respiratoires


Annales de Biologie Clinique. Volume 59, Numéro 1, 72-8, Janvier - Février 2001, Pratique quotidienne


Résumé  

Auteur(s) : J. Barbara, H. Chabane, H. Daikha, N. Abuaf, F. Leynadier, Centre d'allergologie, hôpital Tenon, 4, rue de la Chine, 75970 Paris cedex 20.

Résumé : La recherche d'IgE spécifiques sériques est un élément fondamental du diagnostic allergologique. Quelles que soient les méthodes utilisées pour leur recherche et leur quantification [1, 2], la présence d'IgE permet seulement d'affirmer l'existence d'une sensibilisation du patient à l'allergène sans pour autant constituer une preuve suffisante de leur responsabilité dans les symptômes observés [3]. La prise en charge du dépistage de l'allergie par la recherche qualitative des IgE spécifiques est limitée par la nomenclature des actes de biologie aux seuls tests utilisant des mélanges d'allergènes (cotation B65) [4]. La prescription de ces tests de première intention n'est pas soumise à condition. Leur positivité permet d'orienter le patient vers un médecin compétent en allergologie pour la poursuite des investigations, notamment par des tests cutanés à lecture immédiate (prick-test ou intradermo-réaction). Les tests cutanés explorent la présence d'IgE spécifiques fixées aux mastocytes cutanés. Ils sont considérés comme « l'étalon or » du diagnostic de l'allergie. Le dosage des IgE spécifiques sériques vis-à-vis d'allergènes unitaires, pratiqué en règle générale après les tests cutanés, a pour but la confirmation de la présence d'IgE circulantes et leur estimation quantitative. Les règles de prescription limitent la cotation à 5 pneumallergènes (5 x B65) et 5 trophallergènes (5 x B65) [4]. Les tests utilisant des pneumallergènes ou des trophallergènes séparés sur un même support (cotation B165) constituent une alternative en cas de polysensibilisation.

Illustrations

ARTICLE

Le but de cette étude est d'évaluer les performances de l'All.Dix®-Pneumallergènes (AX-P) par comparaison aux tests cutanés. L'AX-P est un test d'identification basé sur la recherche semi-quantitative d'IgE spécifiques de 10 pneumallergènes séparés immobilisés sur une même bandelette (tableau 1). Son évaluation a été réalisée sur 97 sérums de patients ayant au moins un test cutané positif à l'un des pneumallergènes présents sur la bandelette. Sa sensibilité analytique a été évaluée sur des sérums préalablement dosés en IgE spécifiques par la méthode du CAP System Rast® FEIA (CAP) (Pharmacia, Uppsala, Suède).

Patients

Les sérums de 97 patients (57 femmes et 40 hommes) âgés de 18 à 63 ans (moyenne 31,3 ans), sensibilisés aux pneumallergènes, ont été utilisés pour l'évaluation de l'AX-P. Tous les patients avaient eu, dans le cadre d'une consultation allergologique au centre d'allergie de l'hôpital Tenon, des prick-tests aux pneumallergènes courants et un prélèvement de sang le même jour dans le cadre du bilan de routine. Pour 77 de ces patients, un dosage des IgE spécifiques pour au moins un des allergènes étudiés a été effectué par la méthode du CAP. Les volumes de sérums non utilisés (service d'immunologie et d'hématologie biologique, hôpital Rothschild), répartis en aliquotes et conservés à - 20 °C, ont servi à pratiquer l'AX-P.

Méthodes

Tests cutanés

Les tests cutanés à lecture immédiate ont été pratiqués par la méthode du prick-test qui consiste à piquer à l'aide d'une pointe à usage unique (Stallerpoint®, Stallergènes, Antony, France) à travers les gouttes d'allergènes, de témoins positif (phosphate de codéine 9 %) et négatif (diluant glycéro-salin phénolé à 4 ‰), déposées sur la peau du patient. Ils ont été réalisés avec des extraits allergéniques unitaires ou mélangés, en solution glycérolée (Stallergènes, Antony, France) (tableau 1). La mesure du diamètre moyen de la papule et de l'érythème a été effectuée 15 min après. Le test est considéré positif lorsque le diamètre de la papule est supérieur ou égal à 75 % du diamètre du témoin positif. Les tests cutanés sont validés lorsque le témoin négatif ne provoque aucune réaction notable et que le témoin positif donne une papule de diamètre moyen >= 4 mm.

Test All.Dix®-Pneumallergènes (AX-P)

Le test AX-P est basé sur le principe de « l'immuno-dot » avec révélation immuno-enzymatique à l'aide d'un substrat insoluble. Il se présente sous forme d'une trousse comprenant 12 bandelettes et les réactifs prêts à l'emploi (figure) : 3 flacons contenant respectivement le conjugué (solution d'anticorps anti-IgE humaines marqués à la peroxydase), le substrat tamponné (H2O2) et la solution chromogène (4-chloro-1-naphthol dans du méthanol). Chaque bandelette est divisée en 10 champs sur lesquels un allergène différent a été préalablement adsorbé (tableau 1). Des témoins, positif (anticorps anti-IgE) et négatif (diluant seul), sont inclus dans chaque bandelette. Les bandelettes sont emballées individuellement sous carte blister, laquelle comporte trois logements vides (blisters) destinés aux différentes phases d'incubation. Toutes les étapes se déroulent à température ambiante.

Nous avons pratiqué le test selon les indications du fabricant. Chaque bandelette a incubé pendant 20 ± 2 h, dans le blister n° 1 préalablement rempli de sérum jusqu'au trait de niveau (environ 900 mul). Les IgE non liées ont été éliminées par lavage de la bandelette pendant 10 min dans un tube contenant 5 ml d'eau distillée. Après séchage à l'aide de papier absorbant, la bandelette a incubé 1 h avec le conjugué dans le blister n° 2. Après deux lavages de 10 min dans l'eau distillée, elle a incubé 15 min dans le blister n° 3 en présence de solution chromogène diluée extemporanément au 1/6e dans le substrat tamponné. Après un lavage de 5 min dans l'eau distillée, la bandelette a séché pendant au moins 30 min à l'abri de la lumière. La lecture visuelle a été effectuée à l'aide d'une carte-couleur (nuancier) fournie dans la trousse, définissant quatre classes de positivité : 1 (faible), 2 (moyenne), 3 (élevée), 4 (très élevée). Le résultat était considéré positif pour un allergène s'il apparaissait une coloration bleue (« dot ») dans le champ correspondant. L'intensité de la coloration est directement proportionnelle à la quantité d'IgE spécifiques présentes dans l'échantillon. Le test n'est pas interprétable si le contrôle positif n'est pas coloré en bleu ou si une coloration bleue apparaît sur le témoin négatif. Pour ce travail, la lecture a été effectuée par deux biologistes, les résultats douteux ayant été relus par une troisième personne. Toutes les bandelettes ont été lues sans connaissance préalable des résultats des tests cutanés ni de ceux du CAP.

Dosage des IgE spécifiques par CAP System™

Les dosages des IgE spécifiques ont été pratiqués par la méthode du CAP selon les recommandations du fabricant. Les microplaques ont été lues sur un lecteur de fluorescence Fluoro-Count 96 (Pharmacia, Uppsala, Suède). Les résultats, exprimés en kUA/l, peuvent être répartis sous forme de six classes de positivité [2]. Pour la comparaison des deux tests, les classes 5 et 6 du CAP ont été regroupées avec la classe 4 en l'absence d'équivalent pour l'AX-P.

Analyse des résultats

La sensibilité, la spécificité, les valeurs prédictives positive (VPP) et négative (VPN) ainsi que la concordance (ou précision diagnostique) ont été calculées selon les formules classiques [1, 5].

sultats

La lecture des bandelettes par deux observateurs a donné lieu à 12 résultats discordants relevés chez 10 patients, pour un total de 970 résultats. Une troisième lecture a permis de trancher. Dans tous les cas, il s'agissait de réactions de classe 0 ou 1. L'erreur est de l'ordre de 1 % (12/970 lectures). Nous n'avons constaté aucun résultat ininterprétable dû à l'absence de coloration du témoin positif ou à la coloration anormale du témoin négatif.

La reproductibilité inter-lots de la méthode a été évaluée par la mise à l'essai de 27 sérums en double à l'aide de 2 lots de réactifs différents (soit 2 x 270 lectures). Six résultats discordants (2 %) ont été relevés sur 5 sérums : ils concernaient le bouleau (4 fois), l'armoise (1 fois) et le chien (1 fois). Ces discordances étaient systématiquement observées sur des résultats de classe 0 obtenus avec le premier lot et rendus classe 1 dans 5 cas et classe 2 dans un cas (bouleau) avec le second lot. Ces résultats obtenus avec le second lot étaient tous concordants avec le résultat des tests cutanés pour les poils de chien, les bétulacées et les herbacées.

Pour l'évaluation clinique de l'AX-P, les résultats du seigle (g12) n'ont pas été interprétés car non testés par test cutané, cette graminée ne faisant pas partie du panel d'allergènes habituellement utilisés au centre d'allergie de l'hôpital Tenon. De même qu'il n'a pas été possible d'évaluer les résultats des allergènes testés sous forme de mélange pour les tests cutanés : pollens de phléole (g6), d'armoise (w6), d'ambroisie (w1), de bouleau (t3) et Alternaria (m6). Par conséquent, seuls quatre allergènes (chat, chien, Dermatophagoides pteronyssinus et D. farinae) testés individuellement par prick-tests (tableau 1) ont été considérés pour l'évaluation clinique de l'AX-P. Nous avons observé 73 résultats discordants avec les tests cutanés (32 avec le chien, 26 avec les acariens et 15 avec le chat). La discordance était définie en termes de positivité ou de négativité sans tenir compte de l'intensité de la réaction de l'AX-P ni des tests cutanés. Parmi les 73 cas discordants, 29 avaient eu un dosage des IgE spécifiques par le CAP (tableau 2). L'AX-P était concordant avec les résultats du CAP 17 fois, suggérant une discordance clinicobiologique dans ces cas. Pour les 12 autres résultats, le dosage quantitatif des IgE spécifiques était concordant avec les tests cutanés, suggérant une discordance de l'AX-P.

Au total, comparé aux tests cutanés considérés comme référence, l'AX-P atteignait une sensibilité globale de 74 % (de 43 % pour le chien à 88 % pour le chat). La spécificité était de 88 % (de 82 % pour le chat à 98 % pour D. pteronyssinus). La valeur prédictive positive (VPP) était de 86 % (de 70 % pour le chien à 98 % pour D. pteronyssinus) et la valeur prédictive négative (VPN) de 77 % (de 64 % pour le chien à 87 % pour le chat). La concordance entre les résultats des tests cutanés et de l'AX-P était de 81 % (de 66 % pour le chien à 88 % pour D. pteronyssinus) (tableau 3, A).

Chez 77 patients parmi les 97 testés, un dosage quantitatif des IgE spécifiques par le CAP avait été effectué. Nous avons comparé ces résultats à ceux des tests cutanés : le CAP a montré une sensibilité globale de 88 % (de 83 % pour le chien à 100 % pour le chat). La spécificité globale était de 72 % (de 40 % pour le chat à 94 % pour D. farinae). La VPP et la VPN atteignaient respectivement 88 % (de 71 % pour le chien à 97 % pour D. pteronyssinus) et 72 % (de 69 % pour D. pteronyssinus à 100 % pour le chat). La concordance était de 83 % (de 67 % pour le chien à 89 % pour D. farinae) (tableau 3, B).

Comparé aux tests cutanés, l'AX-P était moins sensible que le dosage quantitatif des IgE spécifiques par la méthode du CAP pour les allergènes du chien (43 % contre 83 %), mais plus spécifique pour les poils de chat (82 % contre 40 %). Les deux méthodes présentaient des performances équivalentes pour les acariens.

La sensibilité analytique de l'AX-P a été évaluée par comparaison des résultats obtenus par cette méthode au dosage quantitatif des IgE spécifiques par le CAP chez 77 patients (soit un total de 194 dosages). Nous avons rangé ces résultats par classes sous forme de tableaux croisés pour chaque allergène et avons considéré qu'ils étaient discordants entre les deux méthodes lorsque la différence était supérieure ou égale à deux classes (tableau 4). La comparaison de l'AX-P au CAP montrait 64 % de résultats concordants (0 ou 1 classe d'écart). Le taux de résultats discordants était de 36 % (29 % à deux classes et 7 % à trois classes). Les discordants à deux classes d'écart concernaient en particulier l'armoise (11/18), D. pteronyssinus (17/47), le chien (9/24) et le bouleau (9/25). Les discordants à trois classes concernaient surtout l'armoise (5/18).

Tous allergènes confondus, l'AX-P n'a détecté que 3 sérums sur les 13 de classe 1 (CAP) et 20 sur les 37 de classe 2 (CAP). Par ailleurs, la concordance globale entre les résultats du CAP et de l'AX-P, calculée en termes de positivité ou de négativité de la recherche des IgE spécifiques, était de 81 %.

Discussion

L'évaluation de l'AX-P sur 97 sérums nous a permis de constater que la lecture visuelle de la bandelette par comparaison à une échelle de couleur comporte un risque d'erreur par défaut de l'ordre de 1 %. La sensibilité individuelle de perception visuelle des différentes nuances de bleu est responsable de ces discordances. La lecture des bandelettes avant séchage complet peut également constituer une source d'erreur par excès. La présence de témoins positif et négatif sur chaque bandelette garantit le bon déroulement du test. Par ailleurs, l'utilisation d'un densitomètre spécifique (non évalué) aurait permis de rendre des résultats quantitatifs en plus des classes.

Les discordances observées lors de l'évaluation de la reproductibilité inter-lot (2 %) concernaient le pollen de bouleau 4 fois sur 6. Elles s'expliquent dans ces cas par une modification de la préparation d'extrait de bouleau utilisée par le fabricant afin d'augmenter la sensibilité de la méthode. Cela a permis de dépister 4 patients positifs au bouleau qui avaient été rendus négatifs avec l'ancien lot. Les deux autres cas sont des discordances inexpliquées, ce qui ramène le taux réel de discordances inter-lots à 0,7 %.

L'AX-P obtient 81 % de résultats concordants avec le CAP en termes de positivité ou de négativité de la recherche d'IgE spécifiques. Néanmoins, la sensibilité analytique de la technique, déterminée par la comparaison aux résultats du CAP (exprimés en classes) montre qu'elle ne détecte que 46 % des sérums compris entre 0,35 et 3,5 kUA/l (classes 1 et 2, Pharmacia). Cette discordance est due au manque de sensibilité de l'AX-P pour les pollens d'armoise et de bouleau, les poils de chien et D. pteronyssinus. Pour ces quatre allergènes en particulier, le taux important de discordants à deux classes d'écart (de 36 % pour D. pteronyssinus et le bouleau à 61 % pour l'armoise) témoigne du décalage entre les classes AX-P et celles du CAP. Environ 40 % des sérums de classe 2 déterminés par le CAP n'apparaissent que classe 1 avec l'AX-P et 46 % ont été rendus classe 0.

La faible sensibilité analytique pour les sérums dont la quantité d'IgE spécifiques circulantes mesurée par le CAP est inférieure à 3,5 kUA/l lui confère en contrepartie une meilleure spécificité, en particulier pour le chat. Pour certains allergènes, la présence d'IgE spécifiques de classe 1 (CAP) n'est pas toujours bien corrélée aux résultats des tests cutanés et à la clinique [6]. Toutefois, la méthode AX-P doit être améliorée de façon à permettre la mise en évidence de toutes les IgE spécifiques dont la quantité est comprise entre 0,71 et 3,5 kUA/l (classe 2, Pharmacia).

L'évaluation clinique par comparaison aux tests cutanés à lecture immédiate a montré une bonne sensibilité pour le chat (88 %), satisfaisante pour les acariens de la poussière de maison (81 %), mais faible pour les allergènes de poils de chien (43 %). La variabilité de l'activité allergénique des extraits de poils de chien selon le lot testé, aussi bien par tests cutanés qu'avec des techniques in vitro a déjà été rapportée [7, 8]. Malgré une moins bonne sensibilité pour les poils de chien, l'AX-P obtient des résultats comparables à ceux du CAP. Au total, les performances de l'AX-P comparé aux tests cutanés pour les quatre allergènes étudiés apparaissent équivalentes aux performances d'autres tests d'identification utilisant la même technologie [9, 10].

L'utilisation de mélanges de pollens et de moisissures pour le diagnostic clinique par prick-tests ne nous a pas permis d'effectuer l'analyse clinique pour les allergènes correspondants testés isolément sur la bandelette de l'AX-P. Les préparations à usage thérapeutique sont souvent des mélanges de pollens ou de moisissures, il serait plus intéressant de pouvoir disposer des allergènes de ces mêmes mélanges au niveau des bandelettes afin de tester d'emblée davantage de spécificités.

Cette méthode simple, ne nécessitant aucun matériel supplémentaire en dehors de celui fourni dans la trousse, permet d'obtenir le dosage semi-quantitatif des IgE spécifiques de 10 pneumallergènes unitaires courants en 24 h. Les tests peuvent être pratiqués aussi bien en série qu'au coup par coup. L'originalité consiste dans l'utilisation des logements de la carte blister pour les différentes étapes d'incubation à température ambiante et des réactifs prêts à l'emploi.

CONCLUSION

Remerciements. Nous remercions Valérie Ghislain, Lydia Ovaguimian et Bernard Fourtinon (service d'immunologie et d'hématologie biologique) pour les dosages d'IgE spécifiques par la méthode du CAP System (Pharmacia) et Claire Chevalier pour son assistance technique.

REFERENCES

1. Kam KL, Hsieh KH. Comparison of three in vitro assays for serum IgE with skin testing in asthamatic children. Ann Allergy 1994 ; 73 : 329-36.

2. Kelso JM, Yunginger JW. 7-Laboratory tests for IgE-mediated diseases. In : Lockey RF, Bukantz SC. Allergen immunotherapy. New York : M Dekker Inc., 1991 : 145-60.

3. Pastorello EA, Incorvaia C, Ortolani C, et al. Studies on the relationship between the level of specific IgE antibodies and the clinical expression of allergy : I. Definition of levels distinguishing patients with symptomatic from patients with asymptomatic allergy to common aeroallergens. J Allergy Clin Immunol 1995 ; 96 : 580-7.

4. Arrêté du 1er juillet 1999 modifiant l'arrêté du 3 avril 1985 fixant la nomenclature des actes de biologie médicale, article 4. Journal officiel du 2 juillet 1999.

5. Poynard T. Évaluation des moyens diagnostiques : les indices informationnels. Rev Prat 1983 ; 33 : 985-90.

6. Guerin B, Didierlaurent A, Derer M, Stadler B. Seuil de positivité - interprétation des résultats du Rast. Rev Fr Allergol 1985 ; 25 : 189-95.

7. Martínez A, Martínez J, Sanz ML, Bartolomé B, Palacios R. Dander is the best epithelial source for dog allergenic extract preparations. Allergy 1994 ; 49 : 664-7.

8. Ohman JL, Sundin B. Standardized allergenic extracts derived from mammals. Clin Rev Allergy 1987 ; 5 : 37-47.

9. De Weck AL, Derer M, Morrison-Smith G. Immunodot Top screen : un nouveau procédé pour le dépistage des allergies. Rev Fr Lab 1996 ; 281 : 47-51.

10. Hamburger RN, Berger WE, Quiwa NB, Terrazas V, Casillas R, Miller SP. Skin testing compared with in vitro testing for screening allergic patients. Ann Allergy 1991 ; 67 : 133-7.