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Conséquences cliniques et moléculaires de l’instabilité des microsatellites dans les cancers humains


Bulletin du Cancer. Volume 95, Numéro 1, 121-32, janvier 2008, synthèse

DOI : 10.1684/bdc.2008.0571

Résumé   Summary  

Auteur(s) : Richard Hamelin, Alexandra Chalastanis, Chrystelle Colas, Jamila El Bchiri, Dominique Mercier, Ann-Sofie Schreurs, Virginie Simon, Magali Svrcek, Aziz Zaanan, Claire Borie, Olivier Buhard, Emilie Capel, Habib Zouali, Françoise Praz, Martine Muleris, Jean-François Fléjou, Alex Duval , Inserm, UMRS 762, 27 rue Juliette Dodu, 75010 Paris, Université Pierre et Marie Curie-Paris 6, Centre de recherche Saint-Antoine, 75012 Paris, Hôpital Saint-Antoine, Service d’anatomopathologie, 75012, Paris, Centre d’étude du polymorphisme humain, 75010 Paris.

Résumé : A chaque division cellulaire, l’ADN polymérase commet des erreurs en recopiant l’ADN. Ces erreurs, plus fréquentes au niveau de séquences répétées de l’ADN appelées microsatellites, sont normalement réparées par un système appelé MMR (mismatch repair). Les tumeurs déficientes dans le système MMR accumulent des mutations (délétions ou insertions de quelques nucléotides) au niveau des microsatellites, et sont appelées MSI (microsatellite instable). Les microsatellites sont très nombreux et dispersés dans des régions codantes ou non codantes du génome. L’instabilité des microsatellites non codants n’a pas de rôle connu jusqu’à présent dans le processus de transformation cellulaire, mais indique le statut MSI des tumeurs. En revanche, l’instabilité par délétion ou insertion dans une séquence répétée codante entraîne un décalage du cadre de lecture du gène qui la contient. La conséquence en est le plus souvent une inactivation fonctionnelle du gène concerné, ce qui est susceptible de jouer un rôle dans l’induction et/ou la progression tumorale MSI. Le phénotype MSI a d’abord été décrit dans environ 15 % des cancers colorectaux et peut être d’origine sporadique ou héréditaire (syndrome de Lynch ou HNPCC pour hereditary non-polyposis colorectal cancer). Il est également associé à environ 15 % des cancers de l’estomac et de l’endomètre et, à un degré moindre, à d’autres localisations tumorales. Outre un intérêt fondamental à cause de ce mécanisme de transformation original, l’étude des tumeurs MSI a un grand intérêt clinique. Il a en effet été montré que les tumeurs MSI étaient associées à un meilleur pronostic que les tumeurs non-MSI (appelées MSS pour microsatellite stable) et répondaient différemment aux traitements de chimiothérapie d’utilisation courante en clinique. Tous ces différents points seront développés dans cette revue.

Mots-clés : instabilité des microsatellites, MSI, HNPCC, cancer colorectal

Illustrations

ARTICLE

Auteur(s) : Richard Hamelin1,2, Alexandra Chalastanis1,2, Chrystelle Colas1,2, Jamila El Bchiri1,2, Dominique Mercier1,2, Ann-Sofie Schreurs1,2, Virginie Simon1,2, Magali Svrcek1,2,3, Aziz Zaanan1,2, Claire Borie1,2, Olivier Buhard1,2, Emilie Capel1,2,3, Habib Zouali1,2,4, Françoise Praz1,2, Martine Muleris1,2, Jean-François Fléjou1,2,3, Alex Duval1,2

1Inserm, UMRS 762, 27 rue Juliette Dodu, 75010 Paris
2Université Pierre et Marie Curie-Paris 6, Centre de recherche Saint-Antoine, 75012 Paris
3Hôpital Saint-Antoine, Service d’anatomopathologie, 75012, Paris
4Centre d’étude du polymorphisme humain, 75010 Paris

La première étude mentionnant l’existence d’une instabilité nucléotidique dans les cancers humains est une communication orale du groupe de Manuel Perucho lors d’un congrès international sur les oncogènes à Madrid le 8 avril 1992. Après divers refus de journaux prestigieux, probablement dus à la grande nouveauté des faits décrits, ce n’est qu’en juin 1993 que Ionov et al. du groupe de M. Perucho publient un article dans la revue Nature décrivant des « mutations somatiques ubiquitaires de séquences répétées dans les cancers colorectaux » [1], un mois après que deux autres articles parus dans la revue Science aient relaté le même phénomène [2, 3]. Ce processus original, associé à la transformation cellulaire, a été appelé MSI (microsatellite instability) au cours d’une réunion internationale de consensus dont le rapport a été publié fin 1998 [4]. En septembre 2007, une interrogation de la base de données bibliographique PubMed avec le terme MSI donne plus de 2000 réponses correspondant à des articles publiés sur le sujet.

Notre unité de recherche Inserm s’intitule « Instabilité des microsatellites et cancers ». Les chercheurs, médecins, ingénieurs, techniciens et étudiants qui y travaillent ont une activité de recherche focalisée sur l’étude des tumeurs MSI. Ils ont collégialement participé à la rédaction de cette revue, traitant chacun plus particulièrement le domaine d’expertise dans lequel il est le plus impliqué.

Gènes responsables du phénotype tumoral MSI

Le système de réparation des mésappariements (système MMR) contrôle la fidélité de la réplication de l’ADN. C’est un système très conservé de la bactérie aux mammifères. Chez la bactérie, il est composé de trois protéines principales, MutS, MutL et MutH. Chez les mammifères, il existe 5 homologues de MutS (de MSH2 à MSH6), 4 homologues de MutL (MLH1, MLH3, PMS1 et PMS2), tandis que MutH n’a pas d’homologue connu. MSH2 peut former des hétérodimères avec MSH6 ou MSH3, formant respectivement les complexes MutSα et MutSβ qui reconnaissent différemment les mésappariements de l’ADN selon leur nature (mésappariement de bases, insertion/délétion de un ou plusieurs nucléotides) (figure 1). MLH1 forme des complexes principalement avec PMS2 (MutLα) et joue un rôle essentiel dans la réparation des mésappariements (figure 1). D’autres protéines telles que l’exonucléase 1, le proliferating cell nuclear antigen (PCNA), des polymérases et des ligases jouent également un rôle dans ce processus [5].

Qu’elles soient héréditaires (HNPCC) ou sporadiques, les tumeurs MSI sont toutes déficientes dans le système MMR, consécutivement à l’inactivation biallélique d’un des gènes majeurs du système (figures 1 et 2). La conséquence directe de ce défaut fonctionnel est l’accumulation de mutations dans les cellules tumorales, particulièrement au niveau de séquences répétées appelées microsatellites. C’est ce phénomène qui a donné le nom de ce type tumoral appelé MSI (microsatellite instability). Les microsatellites sont des répétitions en tandem de motifs de 1 à 5 nucléotides présentes en très grand nombre et réparties sur tout le génome. Lorsque ces répétitions sont codantes, leur instabilité est susceptible d’altérer la fonction des gènes qui les contiennent (voir ci-après).

Dans les familles HNPCC, environ 90 % des altérations du système MMR sont des mutations constitutionnelles des gènes MSH2 ou MLH1. Il est décrit également dans environ 10 % des cas des mutations germinales de MSH6 et, à un degré moindre, de PMS2. Il existe une base de données rassemblant toutes les mutations germinales décrites des gènes MMR (www.insight-group.org). Quelques cas de méthylation germinale hémi-allélique des promoteurs de MLH1 ou MSH2 ont été rapportés, mais ils sont exceptionnels et rarement transmissibles.

Dans les tumeurs MSI sporadiques, que ce soit dans les cancers colorectaux, de l’estomac ou de l’endomètre, l’altération MMR princeps est l’inactivation de l’expression de MLH1 par méthylation biallélique du promoteur de ce gène [6]. Il a été montré que seule la méthylation d’une zone particulière (zone proximale) du promoteur de MLH1 était corrélée à une perte d’expression de la protéine [7]. Bien que cette observation ait été publiée en 1999, la région du promoteur de MLH1 analysée dans plus de 60 % des 200 publications que nous avons examinées, est une région dont la méthylation n’est pas associée à une inactivation de l’expression de ce gène [8]. Il faut donc absolument tenir compte de ce fait lorsqu’on entreprend l’étude de la méthylation du promoteur de MLH1.

Détermination du statut MSI des tumeurs

Il est maintenant généralement admis que la détermination du statut MSI des tumeurs est utile pour plusieurs raisons. Cela permet d’aider à identifier les patients HNPCC pour lesquels les critères familiaux et/ou cliniques utilisés jusqu’à présent sont peu sensibles ou peu spécifiques. Cela présente d’autre part un intérêt clinique puisque plusieurs études ont montré que les patients porteurs de tumeurs MSI avaient globalement un meilleur pronostic après chirurgie, et semblaient répondre différemment aux traitements de chimiothérapie, que les patients ayant des tumeurs non-MSI (voir ci-après).

A la suite de la découverte du phénomène d’instabilité des microsatellites (appelé alors RER pour replication error), de nombreuses équipes ont utilisé divers marqueurs microsatellites pour déterminer le statut MSI des tumeurs. Cela a conduit à un ensemble de données et d’articles hétérogènes sur leurs conclusions, par manque de consensus sur la méthodologie de dépistage et l’interprétation des résultats [9]. Cette absence de standardisation a montré la nécessité de mettre en place des critères internationalement reconnus, et une réunion de consensus a eu lieu à Bethesda en décembre 1997 pour proposer un panel de marqueurs microsatellites fiables [4].

Le principe de la caractérisation MSI repose sur l’analyse comparative des produits d’amplification par PCR, obtenus à partir de l’ADN tumoral et de l’ADN normal du même patient, de plusieurs régions contenant des microsatellites. Le panel recommandé par la réunion de consensus de Bethesda est composé de 5 microsatellites : 2 marqueurs mononucléotidiques, répétitions d’un seul nucléotide (BAT25 et BAT26) et 3 marqueurs dinucléotidiques, répétitions d’un motif de 2 nucléotides (D5S346, D2S123 et D17S250) [4]. Par définition, une instabilité sur au moins 2 de ces 5 marqueurs caractérise une tumeur appelée MSI-H (high). Les tumeurs ne présentant une instabilité que sur un seul marqueur sont appelées MSI-L (low). Les tumeurs MSS (microsatellite stable) sont celles ne présentant aucune instabilité sur les 5 microsatellites. Il n’a jamais été obtenu de preuves évidentes et définitives de l’existence réelle des tumeurs MSI-L qui ne se différencient pas, ou peu, aux niveaux moléculaires et cliniques des tumeurs MSS. Dans la suite de cette revue, nous ne considérerons donc que les tumeurs MSI-H, appelées MSI, et les tumeurs MSI-L et MSS seront appelées non-MSI ou MSS.

Les critères pour reconnaître les tumeurs MSI ont été révisés en 2002, à la suite de plusieurs études mettant en évidence un certain nombre de défauts du panel proposé, concernant notamment l’utilisation des marqueurs dinucléotidiques [10]. Le panel original de Bethesda n’est pas déconseillé, mais il est maintenant suggéré d’utiliser en priorité des marqueurs mononucléotidiques pour identifier les tumeurs MSI. Un panel de 5 marqueurs mononucléotidiques (BAT25, BAT26, NR21, NR24 et NR27), préalablement mis au point par notre groupe [11], a été recommandé [10]. Outre une extrême sensibilité et spécificité, il a l’avantage d’être constitué de marqueurs quasi-monomorphes (c’est-à-dire présentant très peu de variants de taille) dans la population mondiale, si bien que l’analyse comparative de l’ADN constitutionnel des patients n’est, en règle générale, pas requise [12]. Dans ce contexte, comme il existe tout de même quelques variants alléliques de ces marqueurs, une tumeur ne doit être considérée comme MSI que si elle montre une instabilité sur au moins 3 de ces 5 microsatellites mononucléotidiques. Pour certaines localisations tumorales, dans lesquelles l’instabilité des microsatellites est moins prononcée, conduisant à des variations de taille de ces marqueurs plus discrètes et plus difficiles à identifier (endomètre par exemple), une comparaison avec l’ADN normal correspondant des patients reste recommandée [13].

Une alternative à l’allélotypage de microsatellites est l’immunohistochimie. En effet, le phénotype MSI est dû, dans la plupart des cas, à l’absence d’expression d’un des gènes majeurs du système MMR à cause d’une altération génétique ou épigénétique (voir ci-dessus). L’immunohistochimie permet donc la détermination indirecte du statut MSI des échantillons étudiés par la mise en évidence de cette absence d’expression dans la cellule tumorale, les cellules normales contaminantes ou infiltrantes faisant fonction de contrôle interne d’expression [14]. Pour être complète, cette analyse nécessite l’emploi de 4 anticorps dirigés contre MLH1, MSH2, MSH6 et PMS2. Cette démarche méthodologique est considérée comme étant moins lourde et moins coûteuse que l’allélotypage des microsatellites, et est utilisée en routine dans de nombreux laboratoires d’anatomopathologie pour faire le diagnostic MSI des tumeurs. Mais, contrairement à l’analyse de répétitions mononucléotidiques par PCR, l’immunohistochimie est difficile à standardiser et nécessite une grande expérience des expérimentateurs pour être fiable [15]. Enfin, l’immunohistochimie ne permet pas l’identification des cas porteurs d’une mutation faux sens, pouvant entraîner une perte de fonction d’un gène MMR, sans diminuer systématiquement le taux d’expression du gène concerné. Cependant comme l’immunohistochimie a l’avantage de « cibler » le gène MMR en cause, elle facilite la recherche de mutation constitutionnelle de ce gène dans les familles HNPCC. L’idéal serait donc d’effectuer sur tous les échantillons tumoraux à la fois l’immunohistochimie et l’analyse des microsatellites, ces deux techniques donnant des résultats analogues dans la majorité des cas.

Conséquences cliniques du défaut MMR des tumeurs MSI

Reconnaissance des cas héréditaires

Le syndrome HNPCC est une prédisposition héréditaire au cancer de transmission autosomique dominante. Il explique de 2 à 7 % des cas de cancers colorectaux [16]. Il est lié, comme nous l’avons vu, à une altération constitutionnelle d’un des gènes MMR, principalement MLH1 ou MSH2, plus rarement MSH6 ou PMS2. La survenue d’un événement somatique inactivant le second allèle du même gène MMR dans une cellule conduit à une instabilité génétique augmentant le taux de mutations sur l’ensemble du génome, et peut favoriser l’émergence d’une prolifération cellulaire MSI et la transformation de ces cellules.

La pénétrance de ce syndrome est élevée avec 70 à 80 % de risque de cancer colorectal cumulé pour les hommes et 40 à 60 % pour les femmes. Le risque ne se limite pas au côlon puisque les femmes ont également un risque cumulé de cancer de l’endomètre de plus de 40 % [16, 17]. D’autres localisations plus rares peuvent être observées. On retient comme faisant également partie du spectre HNPCC les tumeurs des voies urinaires, de l’intestin grêle, de l’estomac, des voies biliaires, des ovaires, du pancréas, les tumeurs cérébrales, ainsi que quelques proliférations bénignes telles que les adénomes sébacés et les kératoacanthomes [18].

Historiquement, l’identification des patients HNPCC était basée exclusivement sur des données cliniques d’histoire personnelle et familiale très spécifiques mais peu sensibles (critères d’Amsterdam de type I puis II) [18, 19]. Beaucoup de patients porteurs de mutations constitutionnelles sur un gène MMR, et donc HNPCC, n’étaient pas identifiés par ces critères. Ces critères cliniques ont été élargis lors des conférences de Bethesda en 1997 puis en 2004, permettant la sélection de patients pour lesquels on propose une recherche de phénotype MSI tumoral préalablement à l’analyse constitutionnelle des gènes MMR, augmentant ainsi la sensibilité du dépistage [10, 20] (tableau 1). En France, un consensus de biologistes a même retenu le principe d’un phénotypage MSI systématique sur toutes les tumeurs colorectales diagnostiquées avant 61 ans indépendamment de leurs caractéristiques histologiques et de l’histoire familiale [17].

En présence d’une tumeur colorectale MSI, et après avoir « ciblé » par immunohistochimie le gène MMR portant potentiellement une altération, on identifie une mutation constitutionnelle chez environ 60 % des patients. Le pourcentage d’identification est variable selon qu’il existe une extinction de MSH2 ou MSH6 (respectivement 92 et 90 % de mutation identifiée) ou de MLH1 (48 % de mutation identifiée). En effet, il faut rappeler que les tumeurs perdant MLH1 peuvent être d’origine sporadique à la suite de la méthylation du promoteur de ce gène.

L’indication d’une analyse constitutionnelle des gènes MMR doit donc prendre en compte des éléments cliniques et biologiques. Un arbre décisionnel reprenant ces éléments est disponible dans les recommandations françaises [17]. Lorsqu’une analyse constitutionnelle est envisagée elle doit être faite, dans la mesure du possible, chez une personne atteinte de cancer. Ce premier patient analysé dans la famille est nommé cas index. Cette première analyse est longue (6 à 12 mois, voire plus) mais elle est facilitée par les résultats de l’immunohistochimie qui indiquent le gène le plus probablement muté et permet donc d’orienter la recherche de mutations. Il est à noter que les gènes MMR, et particulièrement MSH2, peuvent présenter des délétions constitutionnelles d’un ou plusieurs exons, qui doivent être recherchées lorsque des mutations constitutionnelles ponctuelles n’ont pas pu être mises en évidence.

Lorsqu’une mutation constitutionnelle est identifiée chez un cas index, cela permet dans un second temps de proposer une recherche de cette mutation chez les apparentés indemnes ou atteints de cancer. Cette analyse est beaucoup plus rapide (1 à 2 mois) car elle est ciblée sur la mutation familiale. L’identification des sujets porteurs de la mutation permet de leur proposer une surveillance adaptée à leur haut niveau de risque. Cette surveillance repose principalement sur la réalisation de coloscopies avec coloration à l’indigo carmin tous les 2 ans dès l’âge de 20 ans [17]. Elle réduit de façon significative l’incidence du cancer colorectal et la mortalité associée. La surveillance gynécologique est moins codifiée et n’a pas fait la preuve de son efficacité. Elle repose principalement sur l’échographie associée ou non à l’hystéroscopie à un rythme annuel à partir de 30 ans. Tout saignement anormal avant ou après la ménopause doit être exploré. Les autres localisations, plus rares, ne justifient pas une surveillance systématique mais tout symptôme doit donner lieu à une exploration approfondie.

Il est à noter que, parmi les familles qui répondent aux critères (restrictifs) d’Amsterdam, il existe des patients dont les tumeurs ne sont pas MSI et qui ne portent aucune mutation constitutionnelle d’un gène MMR. Il s’agit probablement de cancers du côlon héréditaires mais pour lesquels on ne connaît pas pour l’instant les gènes de prédisposition. Ces cas ont été regroupés récemment sous le terme de syndrome X [21]. Enfin il existe des patients héritant de deux mutations constitutionnelles différentes d’un même gène MMR [22, 23]. Le terme de Lynch III a été proposé pour ces patients qui présentent des pathologies hématologiques et cérébrales dans les premières années de leur vie, ainsi que des manifestations typiques de neurofibromatose de type 1 (NF1) [24, 25].

Tableau 1 Critères de Bethesda révisés [10]

Les tumeurs doivent être analysées pour leur statut MSI dans les cas suivants :

1. Cancer colorectal diagnostiqué avant 50 ans

2. Présence d’au moins 2 tumeurs du spectre large synchrones ou métachrones quel que soit l’âge.

3. Cancer colorectal d’histologie évocatrice* d’un phénotype MSI diagnostiqué avant 60 ans.

4. Patient atteint de cancer colorectal ayant un apparenté au premier degré atteint d’une tumeur du spectre large, l’une des tumeurs ayant été diagnostiquée avant 50 ans

5. Patient atteint de cancer colorectal ayant 2 apparentés ou plus au premier ou deuxième degré atteint d’une tumeur du spectre large, quel que soit l’âge.

*Lymphocytes infiltrant la tumeur (TIL), réaction lymphocytaire de type Crohn, cellules mucineuses en bague à chaton ou aspect médullaire.

Pronostic tumoral et réponse aux traitements de chimiothérapie

Les tumeurs MSI sporadiques présentent des caractéristiques anatomocliniques particulières : il s’agit de tumeurs plus volontiers localisées au niveau du côlon droit, peu différenciées, mucineuses ou en bagues à chaton, largement nécrosées, avec de nombreux lymphocytes intra-épithéliaux, un aspect dit de type Crohn, avec de nombreux nodules lymphoïdes et un front d’invasion expansif [26]. De nombreuses études ont analysé la relation existant entre le statut MSI et la survie des patients, avec des résultats généralement concordants. Dans une revue systématique de 32 études comportant 7642 cas de cancers colorectaux (dont 1277 MSI), Popat et al. [27] ont combiné les données publiées pour confirmer de manière significative que les tumeurs MSI étaient globalement associées à un meilleur pronostic que les tumeurs MSS.

L’impact du phénotype MSI sur la réponse aux différents traitements de chimiothérapie a également fait l’objet de plusieurs études in vitro et in vivo. Les études réalisées in vitro concluent à une résistance des cellules MSI aux effets cytotoxiques du 5-fluoro-uracile (5FU). Concernant l’impact du phénotype MSI sur la réponse des patients atteints de cancer colorectal et traités par 5FU, les premières études ont abouti à des résultats contradictoires. Il semble maintenant clairement établi que ce traitement ne bénéficie pas aux patients ayant une tumeur MSI avec envahissement locorégional (stades II ou III), et pourrait même être délétère pour ces patients [28]. À l’inverse, les lignées cellulaires dérivées de cancers MSI sont hypersensibles à certains agents génotoxiques provoquant des cassures double brin, comme la camptothécine, inhibiteur de topo-isomérase I, l’étoposide, inhibiteur de topo-isomérase II ou la bléomycine, agent radiomimétique [29, 30]. La pertinence de ces observations obtenues in vitro a été confirmée dans une étude clinique montrant que les patients atteints de cancer colorectal métastatique étaient plus susceptibles de répondre favorablement à un traitement par irinotecan, un analogue de la camptothécine, si leur tumeur était de phénotype MSI [31].

Conséquences moléculaires du défaut MMR des tumeurs MSI

Conséquences directes

Gènes cibles d’instabilité

Comme nous l’avons vu, les séquences répétées de type microsatellite représentent un site privilégié de l’instabilité génétique des tumeurs MSI. De telles séquences sont très nombreuses et dispersées dans tout le génome. L’immense majorité d’entre elles se trouve localisée dans des régions intergéniques non codantes de l’ADN, sans qu’aucune conséquence de leur instabilité ne soit connue pour l’instant.

Mais il existe également des séquences répétées localisées dans les exons de certains gènes humains. Il s’agit généralement de répétitions mononucléotidiques d’une taille comprise entre 6 et 10 nucléotides. Les mutations survenant à leur niveau dans les cancers MSI sont le plus souvent des délétions ou des insertions de 1 ou 2 bases, et on parle alors de gènes cibles d’instabilité. La conséquence de telles altérations est un décalage du cadre de lecture conduisant à la production d’une protéine tronquée (figure 1). On considère que l’inactivation d’un gène MMR n’est pas transformante par elle-même mais que c’est l’accumulation de nombreuses mutations au niveau de gènes cibles d’instabilité qui est responsable du processus tumoral MSI. Le premier gène cible impliqué dans la carcinogenèse MSI a été le gène codant pour le récepteur de type II du TGFβ (TGFβ-RII) [32]. De nombreux gènes cibles d’instabilité, mutés à des fréquences très variables, sont connus aujourd’hui [33] (figure 2). Ils sont impliqués dans différentes voies de signalisation comme la transduction du signal, l’apoptose et l’inflammation, la régulation de la transcription, la signalisation des dommages de l’ADN et leur réparation. Bien que les défauts MMR soient différents entre les cas MSI héréditaires (mutation constitutionnelle d’un des gènes MMR) et sporadiques (méthylation du promoteur de MLH1), il ne semble pas qu’il y ait, pour une même localisation tumorale, de différences fondamentales dans le répertoire de gènes cibles d’instabilité dans ces deux cas. Par contre, les gènes cibles d’instabilité sont tissu-spécifiques puisqu’ils sont différents entre les tumeurs MSI gastro-intestinales et les tumeurs MSI de l’endomètre par exemple [33, 34].

Le problème actuel n’est plus de découvrir de nouveaux gènes cibles mutés dans les cancers MSI, mais de déterminer ceux qui jouent un rôle important au cours de l’induction et de la progression tumorale. La carcinogenèse est un processus continu de mutations et de sélections favorisant en général la croissance cellulaire. On estime généralement qu’un gène cible susceptible d’intervenir dans la tumorogenèse MSI est sélectionné au cours de la progression tumorale et est muté à haute fréquence dans ces cancers. A l’opposé, les gènes ayant une faible fréquence de mutations sont considérés comme peu pertinents et sont le témoin du bruit de fond d’instabilité qui caractérise les tumeurs MSI. Diverses études ont tenté de différencier par des approches statistiques les vrais gènes cibles d’instabilité, de ceux correspondant au bruit de fond d’instabilité des tumeurs MSI [35, 36].

D’un point de vue fonctionnel, l’effet oncogénique de ces altérations reste à démontrer dans la majorité des cas. Lorsque ces répétitions sont localisées en début de séquence codante, il est probable que la protéine correspondante n’est plus fonctionnelle, et la mutation est supposée être de type « perte de fonction ». Dans les cas où les répétitions sont présentes plus en 3’, d’autres répercussions fonctionnelles doivent alors être évoquées (effet dominant négatif, gain de fonction). Quelques rares gènes cibles ont été étudiés d’une manière approfondie pour les conséquences fonctionnelles des mutations qu’ils contiennent. Parmi ceux-ci, on retrouve TGFβ-RII, ACVRII (activin receptor type II), MSH3, MSH6, BAX, RIZ (retinoblastoma protein interacting zinc finger), MBD4 (methyl-CpG binding domain protein 4) et TCF4.

Répétitions potentiellement régulatrices

Les mutations affectant les séquences répétées situées dans les régions codantes ont été largement documentées (voir ci-dessus). On ne peut pas exclure le fait que des séquences répétées situées dans les régions non codantes intragéniques (introns, régions transcrites non traduites en 5’ et en 3’), pourraient également contribuer à la carcinogenèse MSI en influençant la régulation de l’expression des gènes qui les contiennent.

Deux exemples évoquant la possible implication de répétitions introniques dans la carcinogenèse MSI sont connus. Une séquence répétée T19 située dans l’intron 1 de l’oncogène MYB joue un rôle atténuateur de l’élongation de la transcription de ce gène dans les cellules normales du côlon. Une surexpression de MYB a été observée dans les tumeurs MSI, et serait due à l’instabilité de cette répétition [37]. L’instabilité d’une séquence répétée intronique localisée en 3’ de l’intron 4 du gène MRE11, à proximité du site accepteur d’épissage, a été associée à un épissage aberrant donnant naissance à une protéine tronquée dans les cancers MSI [38]. Ce défaut est corrélé à une diminution de l’expression du complexe MRN (MRE11/RAD50/NBS1) qui joue un rôle crucial dans la réponse cellulaire en cas de cassure double brin de l’ADN.

Par ailleurs, certaines répétitions non codantes situées dans les régions 5’ et 3’ transcrites et non traduites contribuent probablement à la régulation de l’expression génique. Il s’agit principalement de répétitions mononucléotidiques qui, dans certains cas, sont moins polymorphes que des répétitions de même nature situées dans des régions non codantes intergéniques [39]. Cette conservation peut être la conséquence d’une pression de sélection reflétant un rôle fonctionnel dans l’expression génique. Mais il n’existe à ce jour aucune preuve fonctionnelle du rôle de l’instabilité de ces séquences dans le développement tumoral MSI.

Conséquences indirectes

De nombreux ARN messagers comportant des mutations non-sens sont générés en conséquence de l’instabilité des répétitions codantes décalant la phase de lecture des gènes. Ces ARNm donnent naissance à des protéines tronquées ayant une extrémité C-terminale aberrante (figure 1). De telles protéines mutantes peuvent posséder des propriétés néo-antigéniques et être à l’origine du déclenchement d’une réponse immunitaire spécifique de l’hôte [40]. Les cancers MSI sont d’ailleurs connus pour être des tumeurs généralement très immunogènes et on sait que l’intensité du processus immun antitumoral est positivement corrélé au bon pronostic des tumeurs MSI chez l’homme.

Par ailleurs, il existe un mécanisme physiologique appelé NMD (nonsense mediated mRNA decay) qui est un système de maintenance de la transcription dégradant les ARN messagers possédant dans leur séquence un codon stop prématuré (PTC) (figure 1) [41]. Le NMD est un mécanisme présent chez tous les eucaryotes, qui permet à la cellule de se prémunir des effets dominants négatifs et gains de fonction potentiellement délétères des protéines anormales tronquées générées par les ARNm contenant un PTC. Notre équipe a comparé le niveau d’expression de gènes cibles d’instabilité dans une série de lignées cellulaires MSI selon qu’elles comportaient une mutation homozygote, hétérozygote ou pas de mutation dans les répétitions codantes correspondantes. Il a été observé que le niveau d’expression de ces transcrits était très variable d’un gène à l’autre. Après inhibition in vitro du NMD, certains d’entre eux étaient réexprimés et d’autres non. Ces résultats suggèrent une dégradation différentielle et incomplète des transcrits mutants contenant un PTC dans la cellule tumorale MSI [42]. Il est attendu, en conséquence, que le NMD puisse avoir un impact significatif sur l’expression de nombreux mutants dans la cellule tumorale MSI. Nous avons proposé qu’il pourrait notamment influer sur la sélection de certaines altérations cibles en modulant leur effet fonctionnel, soit en l’accentuant (absence de dégradation de mutant dominant négatif par exemple), soit au contraire en l’annihilant (dégradation de mutant gain de fonction).

Autres mécanismes oncogéniques associés au type MSI

Altérations génétiques non liées à une instabilité des microsatellites

Il est connu que les gènes suppresseurs de tumeurs APC et p53, fréquemment mutés dans les cancers colorectaux présentant une instabilité chromosomique (voir ci-après), le sont rarement dans les cancers MSI [43, 44]. Par contre, on retrouve des mutations de l’oncogène KRAS à la fois dans les tumeurs MSI et MSS, mais avec une fréquence moins importante dans les tumeurs MSI [45]. Il semble en outre qu’il existe des différences de fréquence et de type de mutation de certains gènes selon que les tumeurs MSI sont sporadiques ou héréditaires [45]. Des mutations de l’oncogène BRAF, une sérine-thréonine kinase impliquée dans la voie de signalisation RAS/RAF/MAPK, sont présentes dans environ 35 % des tumeurs MSI et 5 % des tumeurs MSS colorectales [46]. Parmi les tumeurs MSI, seules les tumeurs MSI sporadiques, méthylées sur MLH1, peuvent présenter une mutation de BRAF, alors que celle-ci n’est jamais retrouvée dans des tumeurs HNPCC [47], si bien qu’il a été proposé que la présence de cette mutation pouvait permettre d’exclure le diagnostic de syndrome HNPCC [48]. Inversement, des mutations de la β-caténine, impliquée dans l’importante voie de carcinogenèse colorectale APC-β-caténine-TCF (également appelée voie Wnt-wingless), semblent être plutôt associées aux tumeurs MSI HNPCC qu’aux tumeurs MSI sporadiques [49]. Les mutations de ces différents gènes dans les tumeurs MSI ne sont pas localisées au niveau de séquences répétées codantes et ne découlent donc pas directement du processus d’instabilité des microsatellites. Elles peuvent être cependant la conséquence de l’instabilité nucléotidique générale caractérisant ces tumeurs.

Instabilité chromosomique modérée

Dans la littérature, les tumeurs MSI sont souvent opposées aux tumeurs dites CIN (chromosomal instability) qui montrent une instabilité chromosomique souvent très importante caractérisée par la coexistence de nombreux réarrangements des chromosomes au sein d’une même tumeur. Il est généralement admis que les tumeurs MSI représentent 15 % des cancers colorectaux et que les cancers CIN représentent les 85 % restant. La caractérisation des tumeurs MSI se fait selon des critères internationaux et il est maintenant facile de déterminer si une tumeur est MSI ou MSS. Par contre, il n’y a pas à ce jour de consensus ni sur la technique à utiliser ni sur le taux minimal d’instabilité chromosomique requis pour définir le phénotype CIN. Dans une premier temps, il a été considéré que toutes les tumeurs MSS étaient CIN, ce qui n’est pas le cas puisque certaines tumeurs MSS ne présentent pas d’instabilité chromosomique [50]. Il a d’autre part été démontré que des tumeurs MSI pouvaient présenter une instabilité chromosomique modérée (voir ci-après).

D’une manière générale, les études cytogénétiques permettent de mettre en évidence des remaniements et malségrégations chromosomiques conduisant à des déséquilibres récurrents et non aléatoires dans les tumeurs. Par la description des régions chromosomiques fréquemment perdues ou gagnées, la cytogénétique a permis d’orienter les études moléculaires ultérieures vers l’identification de nouveaux gènes suppresseurs de tumeurs ou oncogènes, respectivement. Fearon et Vogelstein en ont déduit un modèle de progression tumorale colorectale impliquant l’activation d’oncogènes par mutation ponctuelle ou amplification et l’inactivation de gènes suppresseurs de tumeur par mutation et pertes alléliques [51].

Avec l’avènement de la cytogénétique moléculaire (FISH, CGH et CGH-array), il a été possible de montrer que les tumeurs MSS étaient, pour leur majorité, aneuploïdes (c’est-à-dire présentent un contenu anormal d’ADN). Elles sont caractérisées principalement par des pertes de chromosomes entiers et des délétions de certaines régions chromosomiques (-18, -17p, -1p, -8p, -5q, -14, -15) associés à quelques gains (+20q, +13q, +8q, +7). L’ensemble de ces altérations conduit globalement à une diminution du nombre de chromosomes (hypodiploïdie). Ces tumeurs ont une forte tendance à subir des endoreduplications et à passer à l’hypotétraploïdie.

A l’opposé, les tumeurs MSI sont généralement considérées comme diploïdes et stables du point de vue chromosomique. L’analyse cytogénétique de plus d’une centaine de tumeurs MSI, essentiellement coliques, a été rapportée dans la littérature. La compilation de ces données montre que 40 % de ces tumeurs ne présentent effectivement aucune altération chromosomique. Mais 60 % des tumeurs présentent un caryotype anormal (Chalastanis et al., analyse non publiée). Les altérations chromosomiques mises en évidence sont certes globalement moins fréquentes que dans les tumeurs MSS, mais réelles, les gains étant plus fréquents que les pertes. Certains gains semblent être retrouvés de façon récurrente (+13, +20, +8, +8q, +7, +12) ce qui suppose qu’ils ont été sélectionnés au cours de la progression tumorale. Ainsi l’ensemble des anomalies retrouvées dans les tumeurs MSI diffère de celles observées dans les tumeurs MSS, par leur plus faible fréquence mais aussi par leur nature. La majorité des tumeurs MSI présente donc un certain degré d’instabilité chromosomique montrant ainsi que contrairement à ce qui est généralement admis, les phénotypes MSI et CIN ne sont pas totalement mutuellement exclusifs. Il reste maintenant à découvrir le rôle fonctionnel que peut avoir l’instabilité chromosomique au cours du processus de transformation cellulaire MSI puisque aucune étude n’a encore porté sur ce point en particulier.

Méthylation des promoteurs ou type CIMP

Dans les cellules de mammifères, la méthylation de l’ADN intervient principalement au niveau des cytosines des dinucléotides CpG. Les régions riches en CpG, appelées îlots CpG, sont souvent associées à des promoteurs (60 % des gènes en contiennent) et sont généralement non méthylées dans les cellules normales. La méthylation des promoteurs est un mécanisme important d’inactivation de l’expression des gènes et un nombre croissant de séquences promotrices sont décrites comme étant méthylées dans les cancers humains. Il a été proposé qu’il existe des tumeurs colorectales accumulant de telles modifications épigénétiques. Cela caractérise un phénotype appelé CIMP (CpG island methylator phenotype) [52]. Le phénotype CIMP ne semble pas exclusif des types CIN et MSI, mais n’est cependant pas encore bien défini. En l’absence d’un consensus internationalement reconnu pour mettre en évidence les tumeurs CIMP, deux panels différents de promoteurs sont actuellement analysés : celui proposé par le groupe de J.-P. Issa (MLH1, P16, Mint1, Mint2 et Mint31) [52] et celui proposé plus récemment par le groupe de P. Laird (CACNA1G, IGF2, NeuroG1, SOCS1, RUNX3) [53]. Une tumeur est considérée comme CIMP si au moins 3 des promoteurs du panel analysé sont méthylés. Cette analyse a permis de dégager quelques caractéristiques probables des tumeurs CIMP, mais cela n’est pas définitivement établi du fait de la difficulté à reconnaître ce type tumoral d’une manière non ambiguë. Ces caractéristiques sont les suivantes :
  • la plupart des tumeurs MSI sporadiques seraient CIMP (leur défaut de système MMR est la méthylation du promoteur de MLH1) ;
  • les tumeurs MSI HNPCC ne seraient pas CIMP ;
  • les tumeurs CIMP non-MSI ne seraient pas instables sur les chromosomes.

Il a même été évoqué que le bon pronostic des tumeurs MSI pourrait en fait être attribuable au fait qu’elles soient généralement de phénotype CIMP. Que le type CIMP existe ou non est encore une question ouverte puisque certains auteurs ont mis en doute la réalité de ce type tumoral [54]. Cependant, il n’est pas douteux que l’inhibition de l’expression d’un certain nombre de gènes par la méthylation de leurs promoteurs a une grande importance dans l’induction et la progression tumorale, particulièrement de type MSI. Outre MLH1 déjà largement cité [8], on peut signaler le cas du gène MGMT (O6-methylguanine-DNA methyltransferase), codant pour une protéine dont le rôle est de protéger la cellule des effets délétères des agents alkylant la position O6 des guanines. Certaines modifications physiologiques telles que l’inflammation, ou des drogues couramment utilisées en clinique favorisent ce phénomène. Il a été montré que la perte d’expression de la MGMT par la méthylation de son promoteur n’empêchait plus les transitions G vers A dans la cellule, favorisant les mutations de l’oncogène KRAS [55].

Signature moléculaire du phénotype MSI

Les techniques de criblage du génome à haute densité, comme le sont les puces à ADN, permettent l’analyse rapide d’un grand nombre de données d’expression de gènes. Ces techniques donnent la possibilité d’attacher à des entités biologiques diverses une signature moléculaire facilitant leur identification. L’analyse par puces à ADN est de plus en plus utilisée dans le but d’établir des profils spécifiques et de définir de nouveaux facteurs pronostiques, notamment prédictifs de la réponse aux traitements et/ou à visée diagnostique.

A ce jour, relativement peu de données ont été publiées concernant l’étude du phénotype MSI par la technique de puces [56, 57]. La majorité des études est basée sur une comparaison de cancers MSI versus MSS, plus rarement sur une analyse des profils MSI comparés à ceux provenant de la muqueuse colique saine. Il convient de regarder ces données avec recul, puisqu’elles ont été souvent obtenues avec des puces d’expression de natures différentes et hybridées en utilisant des protocoles différents. De plus, elles ont été normalisées selon des méthodes différentes et analysées avec des logiciels et des approches variables d’un laboratoire à l’autre. La diversité des méthodes expérimentales et analytiques utilisées jusqu’alors ne permet pas de réaliser une synthèse homogène et cohérente de la masse de données de puces concernant les cancers colorectaux humains. Néanmoins, il ressort de ces études que la classification d’échantillons MSI versus normal ou MSI versus MSS, en se basant sur les résultats d’analyse du transcriptome, est relativement aisée. Il est à noter que les différences observées peuvent ne pas résulter uniquement du processus d’instabilité des microsatellites, mais aussi être dues aux autres mécanismes oncogéniques associés au type MSI tels que l’instabilité chromosomique modérée avec gain de chromosomes et la méthylation d’un certain nombre de promoteurs.

Seule une vingtaine de gènes sont communs à au moins deux articles (Mercier et al., analyse non publiée). On peut citer pour exemple les gènes MGMT et MLH1, le récepteur de type 2 du TGFβ, un gène cible classique de la carcinogenèse MSI, et la β-caténine. On peut également remarquer des gènes marqueurs de l’infiltration lymphocytaire ou immunomodulateurs, puisque les tumeurs MSI sont classiquement décrites comme étant très immunogènes. La majorité de ces gènes est associée à plusieurs voies de signalisation clairement identifiées comme intervenant dans le processus de tumorogenèse colorectale, comme les voies APC/β-caténine/TCF, RAS/RAF/MAPK, p53 et TGFβ ou de l’apoptose pour ne citer que les plus connues.

Autres localisations tumorales de type MSI

L’essentiel de ce qui est écrit dans cette revue concerne les cancers colorectaux, mais peut également s’appliquer aux autres localisations classiques du phénotype MSI telles que les cancers de l’estomac et de l’endomètre. La différence principale est que les tumeurs MSI de certaines de ces localisations peuvent avoir une instabilité globale plus réduite en intensité (endomètre par exemple) [13] et/ou un répertoire de gènes cibles d’instabilité différent (endomètre à nouveau) [33, 34]. Nous n’insisterons pas dans cette revue sur ces localisations, préférant présenter d’autres tumeurs MSI moins fréquemment étudiées et dont la survenue est associée à des contextes cliniques très particuliers. Le spectre clinique des tumeurs MSI a effectivement pu être récemment étendu, du fait notamment de travaux réalisés par notre groupe. Ces travaux ont notamment permis de montrer que l’émergence de ces tumeurs était favorisée chez des patients immunodéprimés et/ou souffrant de pathologies inflammatoires chroniques. Ces faits cliniques sont particulièrement d’intérêt lorsqu’on sait que la carcinogenèse MSI est un processus de transformation particulièrement immunogène et donc très contrôlé par l’immunité de l’hôte (voir plus haut).

Maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI)

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) regroupent la maladie de Crohn (MC) et la rectocolite hémorragique (RCH). On estime actuellement que 100 000 personnes en sont atteintes en France (60 000 pour la MC, 40 000 pour la RCH). Les MICI s’accompagnent d’une augmentation importante du risque de survenue de cancers, en particulier colorectaux, avec, pour la maladie de Crohn, un risque également augmenté de cancer de l’intestin grêle. Le risque de survenue de cancers colorectaux au cours des MICI augmente avec l’étendue des lésions et la durée d’évolution de la maladie.

Ces cancers, qui dans leur très grande majorité sont des adénocarcinomes, sont précédés, comme pour les cas sporadiques, d’une lésion précancéreuse, la dysplasie (ou néoplasie intra-épithéliale). Cependant, la pathogénie de la dysplasie et sa signification d’un point de vue biologique, sont différentes dans ces deux types de cancérogenèse : dans les cancers colorectaux sporadiques, la lésion précurseur est le polype adénomateux, tandis que, dans les MICI, la dysplasie peut être plane ou polypoïde et est souvent multifocale. Les gènes altérés dans la carcinogenèse colorectale associée aux MICI sont généralement les mêmes que ceux décrits dans la carcinogenèse colorectale sporadique de type CIN, mais avec des fréquences d’altérations différentes. C’est le cas en particulier de KRAS. Certaines altérations sont de fréquence comparable dans les deux types de cancer, mais apparaissent de manière décalée au cours de la progression tumorale. C’est le cas du gène p53, dont la mutation serait plus précoce dans la carcinogenèse colorectale compliquant les MICI.

Le phénomène MSI semble également impliqué dans les cancers intestinaux compliquant les MICI. Toutefois, il est décrit avec des fréquences extrêmement variables, allant de moins de 1 % à plus de 45 %. Les raisons principales pouvant expliquer de telles variations d’une étude à l’autre sont, d’une part, l’utilisation de marqueurs d’instabilité non sensibles et/ou non spécifiques et, d’autre part, le faible nombre de cas étudiés, puisqu’il s’agit de pathologies relativement rares. Dans une étude récente menée par notre laboratoire sur une grande série de lésions néoplasiques (277 lésions chez 205 malades), nous avons observé un phénotype MSI dans 8,3 % des cas [58]. La fréquence de ce phénotype est sensiblement la même dans la RCH (7,8 %) et dans la MC (9,6 %). Le phénotype MSI est observé dès le stade de la dysplasie, y compris la dysplasie de bas grade. Les mécanismes d’induction de la tumorogenèse MSI dans les cancers colorectaux survenant sur MICI semblent différents de ce qui est observé dans les cancers MSI sporadiques du côlon. En effet, la méthylation du promoteur de MLH1 est rarement observée, et l’immunohistochimie indique que la déficience MMR de ces tumeurs est liée à des pertes plus variées pouvant concerner MLH1, mais aussi MSH2, MSH6 ou encore PMS2 [58]. Les mécanismes de progression tumorale semblent toutefois identiques à ceux des autres tumeurs MSI (sporadiques et héréditaires), notamment en termes de fréquence mutationnelle des gènes cibles d’instabilité.

L’émergence d’un phénotype MSI dans les néoplasies intestinales compliquant une MICI pourrait être en rapport avec l’inflammation chronique et/ou la prise d’immunosuppresseurs, à l’instar de ce qui a été suggéré dans les lymphomes du sujet immunodéprimé [59]. D’autres études semblent nécessaires pour faire toute la lumière sur la survenue du phénotype MSI dans les néoplasies intestinales compliquant les MICI.

Lymphomes de patients immunodéprimés

Les lymphomes non hodgkiniens correspondent à une prolifération du tissu lymphoïde et regroupent un ensemble d’entités assez variables sur le plan clinique, histologique, étiologique et pronostique. Ils présentent cependant la caractéristique d’avoir une incidence élevée chez les patients immunodéprimés dans un contexte de greffe ou de sida. La réactivation du virus EBV a été proposée comme mécanisme à l’origine de leur incidence accrue dans ces contextes, mais il existe une proportion non négligeable de ces lymphomes qui reste EBV-négatifs. En 2004, notre équipe a analysé une série de 603 lymphomes non hodgkiniens provenant de différents groupes hospitaliers français et comprenant 239 prélèvements issus de patients immunodéprimés et 364 prélèvements issus de patients immunocompétents [59]. Cette étude a permis de trouver 12 cas de lymphomes non hodgkiniens présentant un phénotype MSI indiscutable et ce, uniquement chez des patients immunodéprimés. La fréquence du type MSI a été estimée à 2,3 % chez les patients atteints de sida et à 8,1 % chez les sujets greffés. Ces résultats sont à rapprocher de ceux qui ont mis ultérieurement en évidence un phénotype MSI dans des leucémies aiguës ou dans des syndromes myélodysplasiques secondaires à des chimiothérapies comportant des traitements immunosuppresseurs (Imurel) alors que ce phénotype n’existe pas dans les formes primaires de ces tumeurs [60]. Ils soulèvent la question du lien entre immunodépression et instabilité des microsatellites.

Autres mécanismes dans lesquels le système MMR est impliqué

La stabilité du génome est assurée grâce à l’existence de systèmes multiples intervenant dans les processus de réplication, de recombinaison et de réparation de l’ADN. Le système MMR, capital pour la cellule, en est un exemple. En plus de leur rôle dans la réparation des mésappariements, certaines protéines du système MMR participent à la recombinaison, la réparation des cassures double brin, l’apoptose et la régulation du cycle cellulaire. Les études réalisées dans différents organismes ont montré que le système MMR intervenait pour réguler la recombinaison entre séquences homéologues, c’est-à-dire partiellement homologues [61], soit en faisant avorter le processus de recombinaison entre des séquences divergentes, soit en procédant à l’élimination des séquences non appariées.

Plus indirectement, de nombreux gènes impliqués dans la signalisation et la réparation des dommages de l’ADN sont des gènes cibles d’instabilité fréquente dans les cancers MSI [62]. Ainsi, pour le complexe MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) qui joue un rôle essentiel dans la réparation des cassures double brin par recombinaison, le gène MRE11 possède une répétition T11 intronique dont le raccourcissement perturbe l’épissage [38, 62] et RAD50 possède une répétition A9 codante fréquemment mutée par instabilité [35, 62]. Un autre exemple est celui de la DNA-PKcs, une kinase impliquée dans la réparation des cassures double brin par recombinaison non homologue pour laquelle un rôle a été formellement établi en réponse à la bléomycine, et qui contient une répétition A10 codante également cible d’instabilité [35, 62].

C’est probablement à cause de ces raisons multiples que les tumeurs MSI montrent une sensibilité particulière (hypersensibilité ou résistance) à certaines drogues, génotoxiques ou pouvant causer des cassures double brin, utilisées en chimiothérapie, comme nous l’avons rapporté ci-dessus.

Comment collecter les échantillons à analyser

Congélation

Toutes ces analyses nécessitent le développement de tumorothèques constituées selon des règles bien établies. Un rapport récent réalisé à la demande de l’Institut national du cancer (INCa) définit l’intérêt et les recommandations pour constituer une tumorothèque à visée sanitaire [63]. Une standardisation européenne des procédures de cryoconservation pour les banques de tissus a été récemment publiée [64]. La qualité du prélèvement congelé est multifactorielle. Il s’agit tout d’abord d’établir une bonne coordination entre les différents services hospitaliers. Idéalement la pièce chirurgicale fraîche et non fixée doit arriver rapidement après l’exérèse dans un récipient stérile déposé sur de la glace pour limiter la dégradation des tissus. Le médecin procède à l’examen macroscopique et prélève des échantillons tumoraux et normaux en utilisant du matériel stérile ainsi que des cryotubes annotés. Depuis l’exérèse jusqu’à la congélation, le délai doit être minimal. Il est recommandé de ne pas dépasser 30 minutes (temps moyen estimé où les changements de profil d’expression sont d’environ 20 % par rapport à la normale). Si ce délai est dépassé, la congélation n’est pas proscrite, mais il est nécessaire de le notifier sur la base de données. Il est à noter l’existence de milieux de transport qui facilitent la conservation des prélèvements et empêchent notamment les RNases d’agir et de dégrader les ARN au sein des tissus.

En matière de congélation, il semblerait que le protocole le plus adéquat soit l’utilisation de l’isopentane refroidi dans l’azote liquide. L’isopentane est un cryoconducteur très efficace qui permet une congélation très rapide en causant moins de dommages que l’azote liquide. Mais cette procédure comporte de nombreux inconvénients (durée, complexité, équipement...). Si le tissu est destiné à des analyses de biologie moléculaire, il est déconseillé d’utiliser un cryoprotecteur qui pourtant préserve bien mieux l’histologie du tissu et minimise la contamination biologique du tissu. Le stockage des tissus congelés est optimal dans des cuves à azote liquide ou dans des congélateurs – 80 °C à partir du moment où ils sont couplés à un équipement de gestion des risques (alarme locale, alarme distante).

Fixation

En matière de fixation des prélèvements anatomiques, il n’existe pas réellement de fixateur optimal et unique. Suivant les analyses qui seront faites par la suite (analyse histologique, coloration spéciale, études immunohistochimiques, extraction d’ADN, analyses de biologie moléculaire…), le fixateur idéal n’est pas le même. Pour la coloration, la fixation en AFA (alcool-formol acétique) est la meilleure, alors que pour l’immunohistochimie, la fixation d’environ 24 heures (mais n’excédant pas 48 heures) en formol convient le mieux. C’est également le cas pour l’extraction d’acides nucléiques. Si on considère toutes les analyses possibles, le fixateur qui pose le moins de problème est le formol 4 % prédilué et tamponné à pH 7,2-7,4. Il faut absolument proscrire le Bouin qui pose d’énormes problèmes pour les analyses moléculaires des protéines et des acides nucléiques.

Conclusion

L’importance de la détermination du statut MSI des tumeurs (ou de certaines tumeurs) n’est plus mise en doute pour aider à reconnaître les patients des familles HNPCC. L’impact clinique du phénotype MSI sur la réponse à la chimiothérapie des patients atteints de cancer colorectal a été démontré dans des études récentes, comme cela a été rapporté ici et dans une revue plus complète sur le sujet [65]. Mais avant que les recommandations de traitement des patients ne soient adaptées en fonction du statut MSI, d’autres études cliniques impliquant de plus grandes cohortes, randomisées et prospectives sont indispensables pour valider les premières observations. On peut également anticiper qu’une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires associés directement, ou indirectement, au défaut du système MMR caractéristique des tumeurs MSI, permettra de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour cibler directement ce type tumoral.

Remerciements

Nous tenons également à remercier Madame Evelyne Thai, secrétaire-gestionnaire, et Madame Marie-Annick Marry, aide technique de l’unité Inserm U762, Instabilité des Microsatellites et Cancers. Et bienvenue aux nouveaux entrants dans le monde MSI : Coralie Dorard, Illiasse Massaoudi, Yan Ansquer et François Radais.

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