ARTICLE
Au cours de ces dernières années, la biologie moléculaire
a modifié considérablement le diagnostic de routine des
maladies infectieuses, génétiques et néoplasiques.
Toute étude de génétique moléculaire implique
la disposition d'échantillons d'acides nucléiques. Les applications
médicales (diagnostic moléculaire et anténatal de
maladies héréditaires et de maladies infectieuses, identification
génétique en cas de recherche de paternité...) concernent
en général l'étude du génome lui-même,
c'est-à-dire de l'ADN ; toutefois, l'étude des ARN est nécessaire
dans certains cas précis : quantification d'ARN viral, étude
de l'expression de certains gènes (cytokines, récepteurs...)
dans des tumeurs...
Dans la plupart des études de routine en médecine, les
leucocytes sanguins représentent la source majeure d'ADN. Les autres
sources cellulaires peuvent être des biopsies (biopsie de villosités
choriales...) ou des cultures de cellules (amniocytes, fibroblastes, lignées
lymphoblastiques...). La détection de la présence d'un ou
de plusieurs micro-organismes et virus peut se réaliser dans d'autres
milieux biologiques tels que sérum, liquide céphalorachidien,
urine, salive, crachat, exsudat, écouvillonnages (gorge, œil...),
etc.
Dans la grande majorité des cas, la technique d'extraction des
acides nucléiques doit être adaptée à l'échantillon
biologique, à la nature du génome (cellulaire, exogène),
au nombre de copies dans l'échantillon et aux méthodes de
biologie moléculaire utilisées ultérieurement (polymerase
chain reaction (PCR), Southern-blot, électrophorèse
en champ pulsé...).
Au cours de ces vingt dernières années, de très
nombreux procédés d'extraction des acides nucléiques
ont été décrits, et des kits sont actuellement proposés
par un certain nombre d'industriels. L'objectif de ces méthodes
de purification est notamment d'éliminer les contaminants qui pourraient
perturber les techniques ou réactions effectuées par la
suite. Par exemple, l'hème est un puissant inhibiteur de la Taq
polymérase, qu'il est nécessaire d'éliminer au cours
de l'extraction. Il en est de même de l'héparine. C'est la
raison pour laquelle il est préférable de prélever
stérilement le sang frais sur un anticoagulant du type EDTA, qui,
de plus, est un inhibiteur des nucléases. De préférence,
l'extraction de l'ADN doit être réalisée sur du sang
frais, voire, en cas d'impossibilité technique, sur du sang stocké
au maximum 1-2 j à 25 °C (envoi possible par courrier) ou
7 j à 4 °C, sous peine notamment de réduire le rendement
de l'extraction d'au moins 15 %. En effet, la cristallisation lors de
la congélation suivie de la décongélation provoquent
des contraintes mécaniques qui se traduisent par de nombreuses
cassures de la molécule d'ADN.
Ce texte a pour objectif de décrire les principaux procédés
d'extraction des acides nucléiques et de donner au biologiste les
principaux éléments nécessaires au choix de la technique
d'extraction des acides nucléiques à partir d'un échantillon
sanguin la plus adaptée à son laboratoire.
Les principaux procédés
d'extraction des acides nucléiques
Les méthodes d'extraction des acides nucléiques peuvent
se classer en trois principales classes en fonction du principe auquel
elles font appel : les méthodes utilisant des solvants organiques,
les méthodes utilisant des solvants non organiques, les méthodes
basées sur l'utilisation de microcolonnes de résines échangeuses
d'ions.
Quelle que soit la méthode d'extraction des acides nucléiques
utilisée à partir du sang fraîchement recueilli ou
décongelé, le sang doit être initialement vigoureusement
mélangé à une solution hypotonique pour faire éclater
les globules rouges. Les solutions de lyse des globules rouges sont nombreuses
et variées. Par exemple, les solutions suivantes peuvent être
utilisées : a) Tris 10 mM/MgCl2 10 mM/NaCl 10 mM, b)
NH4CO3H 0,9 mM/NH4Cl 131 mM, c) Tris
20 mM pH7,5/MgCl2 5 mM et d) Tris 10 mM pH7,4/EDTA (ethylene
diamine tetra-acetic acid) 10 mM. La lyse est en général
réalisée à 4 °C pendant 20 à 30 minutes.
Le lysat est centrifugé (15 min, 1 500 g) et, après élimination
du surnageant, le culot cellulaire contenant les leucocytes (0,3 % des
cellules circulantes) est repris dans une solution saline (NaCl 0,15 M/EDTA
0,1 M pH 10,5, par exemple) et est traité par une solution de lyse
des globules blancs. Il existe un grand nombre de solutions de lyse en
fonction de la nature du détergent anionique utilisé. Par
exemple, les solutions aqueuses suivantes peuvent être utilisées
: a) TPNS (tri-iso-propyl-naphtalene-sulfonique acid) 6 %/butanol-2
8 %/SDS (sodium dodecyl sulfate) 3 %, b) Tris 10 mM pH 7,4/EDTA
10 mM pH 8/NaCl 50 mM/Sarcosyl 2 %, c) Tris 20 mM pH 7,5/NaCl 400 mM/EDTA
2 mM/Sarcosyl 2 %. L'ADN nucléaire libéré dans le
milieu est alors le plus souvent traité par une protéinase
très active, la protéinase K, qui a pour but de digérer
les protéines qui lui étaient associées. En fonction
des protocoles, le traitement par la protéinase K (10 mg/ml) est
effectué 1 à 2 h à 65 °C ou 30 min à
1 h à 55 °C ou 3 à 18 h à 37 °C.
C'est à ce stade en général que les procédés
d'extraction et de purification varient.
Méthodes utilisant des solvants organiques
* Méthode au phénol-chloroforme
[1]. Dans cette méthode dite « de référence
», le principe consiste à traiter le lysat cellulaire dans
un premier temps par du phénol volume à volume, puis, après
centrifugation (3 000 g, 10 min) à éliminer la phase phénolique,
par un mélange chloroforme-alcool isoamylique (24:1), qui a notamment
pour objectif d'éliminer les traces éventuelles de phénol
qui auraient pu être emportées avec la phase aqueuse et qui
sont fortement inhibitrices des réactions enzymatiques. Le phénol,
équilibré à pH 8,0, saturé en eau, dégazé,
avec ou sans agent anti-oxydant (8-hydroxyquinoléine), est un puissant
agent déprotéinisant dans lequel les acides nucléiques
ne sont pas solubles. D'autres alternatives à son utilisation ont
été préconisées, telle que l'utilisation du
perchlorate de sodium à 5 M (Nucleon-Bacc, Amersham Pharmacia Biotech)
[3].
* Méthode au chlorure de guanidium
[2]. Le principe consiste à traiter le lysat cellulaire
obtenu après action de la solution de lyse des globules rouges
par une solution d'un agent chaotropique, le chlorure de guanidium (hydrochloride
de guanidium 6 M 10 ml/acétate d'ammonium 7,5 M 0,5 ml), puis par
une solution détergente et déprotéinisante (protéinase
K 10 mg/ml, 300 ml/sarcosyl 5 % 1,5 ml) 2 h à 56 °C.
Méthodes utilisant
des solvants non organiques [4]
Dans ces méthodes, le principe consiste à traiter uniquement
le lysat cellulaire par une solution saline, dont l'objectif est d'éliminer
par précipitation sélective les protéines. En fonction
des protocoles, des étapes de prétraitement par la RNase
sont proposées. Différentes solutions salines ont été
préconisées : par exemple, NaCl 2,5 M. Quelques kits commercialisés
par des industriels utilisent ce procédé.
Méthodes basées sur l'utilisation
de colonnes résines échangeuses d'ions
Ces méthodes d'extraction et de purification des acides nucléiques
sont les dernières récemment apparues. Elles sont basées
sur la propriété qu'ont les particules de silice d'adsorber
sélectivement les acides nucléiques. Les solutions de lavage
permettent de se débarrasser des contaminants tels que l'hémoglobine,
les protéines plasmatiques ou les ions Fe2+.
Quelle que soit la méthode utilisée pour l'extraction
et la purification des acides nucléiques, la récupération
des acides nucléiques se fait en général par une
élution, puis par une précipitation.
La précipitation est le plus souvent réalisée par
l'alcool éthylique absolu froid à haute concentration (2,5
volumes par volume d'échantillon) à haute force ionique
(acétate d'ammonium 2,5 M). Dans ces conditions, l'ADN précipite
sous forme de filaments, visibles à l'œil nu, qui peuvent
être récupérés par enroulement sur une fine
baguette de verre. Le temps de précipitation varie en fonction
de la concentration des acides nucléiques, de 15 min à 10
h. Une alternative séduisante à l'alcool éthylique
consiste à utiliser l'isopropanol ; dans ce cas, le sel n'est pas
nécessaire, la précipitation se fait en général
volume à volume et est particulièrement adaptée aux
grands volumes.
Dans tous les cas, le précipité est ensuite lavé
avec une solution d'alcool éthylique à 70 °C pour se
débarrasser des traces éventuelles de sels ou d'isopropanol,
puis séché et resuspendu dans une solution d'hydratation
(en général, Tris 10 mM pH 7,5/EDTA 1 mM).
Place des méthodes
basées sur l'utilisation des microcolonnes de résines échangeuses
d'ions
Au cours de ces vingt dernières années, la majorité
des études de biologie moléculaire ont été
réalisées à partir d'ADN génomique extrait
du sang total, soit par la méthode au phénol-chloroforme,
soit par une méthode basée sur la précipitation sélective
des protéines [1]. À titre d'exemple, sur les 26 laboratoires
de biologie moléculaire effectuant le diagnostic moléculaire
de la mucoviscidose en France, 10 utilisent la méthode au phénol-chloroforme,
6 la méthode au chlorure de guanidium, 5 la précipitation
saline, 5 autres des méthodes rapides de lyse cellulaire et 1 des
colonnes de résine échangeuse d'ions [5]. Si la méthode
au phénol-chloroforme est reconnue comme la méthode de «
référence » permettant l'extraction d'un ADN hautement
purifié débarrassé de la très grande majorité
des contaminants possibles, elle a l'inconvénient majeur d'utiliser
le phénol, produit toxique, qui doit être manipulé
avec grande précaution. Cette méthodologie est donc peu
adaptée au laboratoire d'analyse médicale de ville. Une
alternative séduisante repose sur l'utilisation de colonnes de
résine échangeuse d'ions.
Dans le cadre de l'évaluation de ce procédé d'extraction
de l'ADN à partir du sang total, nous avons comparé les
méthodes d'extraction de l'ADN basées sur l'utilisation
de colonnes de silice avec les méthodes basées sur l'utilisation
de solvants organiques (phénol-chloroforme et chlorure de guanidium).
Matériels et méthodes
* Produits concernés.
a) Colonnes Nucleospin Blood® (cat n° 740951) (Macherey-Nagel),
préconisées pour l'extraction d'ADN génomique et
pour permettre d'utiliser de petites quantités de sang total (200
µl) (intérêt pour l'analyse du sang fœtal, du sang
de nouveau-né et de nourrisson). Les différentes solutions
sont passées par centrifugation.
b) Colonnes Nucléobond AXG 100® (cat n° 740508)
(Macherey-Nagel), préconisées pour l'extraction d'ADN génomique
à partir de 2 à 5 ml de sang total. Les différentes
solutions passent par sédimentation.
c) Colonnes Quiagen Blood Kit Maxi® (cat n° 24164)
(Quiagen SA), préconisées pour l'extraction d'ADN génomique
à partir de 10 ml de sang. Les différentes solutions sont
passées par centrifugation.
* Échantillons. Trente
prélèvements sanguins de sujets adressés aux différents
laboratoires pour un diagnostic moléculaire d'une maladie génétique
(consentement écrit des sujets) ont été testés,
comprenant chacun 16 ml de sang total recueilli sur EDTA, conservé
à 4 °C au maximum 1 j. Pour chaque prélèvement,
200 µl ont été utilisés pour la méthode
Nucleospin Blood®, 5 ml pour la méthode Nucleobond
AXG 100® et 10 ml pour la méthode de « référence
» au phénol-chloroforme. Par ailleurs, 30 autres prélèvements
sanguins ont été testés, comprenant chacun 10 ml
de sang total recueilli sur EDTA, conservé à 4 °C au
maximum 1 j. Pour chaque prélèvement, 5 ml ont été
utilisés pour la méthode Quiagen Blood Maxi®
et 5 ml pour la méthode de « référence »
au phénol-chloroforme ou pour la méthode basée sur
l'utilisation du chlorure de guanidium.
* Techniques
a) Nucleospin blood®. Le protocole utilisé
a été celui proposé par le fabricant ; les tampons
B3, B5 et la protéinase K ont été préparés
suivant ses recommandations. À 200 µl de sang total sont ajoutés
25 µl de la solution de protéinase K (20 mg/ml) et 200 µl
de tampon B3. Après homogénéisation et incubation
10 min à 70 °C, 210 µl d'éthanol absolu sont ajoutés.
La solution obtenue est alors déposée sur une colonne nucleospin,
puis centrifugée 1 min à 6 000 g. La colonne est ensuite
lavée à deux reprises avec 500 µl de tampon B5, suivi
d'une centrifugation de 1 min à
6 000 g. Après une nouvelle centrifugation 2 min à
6 000 g, l'ADN est élué par 200 µl de tampon Tris-HCl
10 mM pH 9 préchauffé à 70 °C suivi d'une centrifugation
1 min à 6 000 g.
b) Nucleobond AXG 100®. À 5 ml de sang
sont ajoutés 5 ml de tampon G1 et 15 ml d'eau distillée.
Après agitation par retournement, la solution est incubée
10 min dans la glace. Après centrifugation 15 min à 1 300
g à 4 °C, le culot est repris par 1 ml de tampon G1 et 3 ml
d'eau distillée. Après une nouvelle centrifugation 15 min
à 1 300 g à 4 °C, le culot est resuspendu dans 5 ml
de tampon G1 et 100 µl de protéinase K (20 mg/ml) et incubé
60 min à 50 °C. La solution additionnée de 5 ml de
tampon N2 est déposée sur la colonne, préalablement
équilibrée avec 2 ml de tampon N2. Après écoulement
de la solution par sédimentation, la colonne est lavée avec
le tampon N3. L'ADN est ensuite élué avec 2 fois 4 ml de
tampon N5. L'ADN est ensuite précipité par l'adjonction
d'une solution d'isopropanol (0,7 volume), puis la solution est centrifugée
à 5 000 g à 4 °C pendant 25 min. Le précipité
est lavé avec une solution d'alcool éthylique à 70
%. Après centrifugation à 6 000 g à 4 °C, le
culot est dissous dans 250 µl de tampon Tris-EDTA 10/1 pH 8.
c) Méthode de « référence » au phénol-chloroforme.
À 10 ml de sang total sont ajoutés 30 ml de solution de
lyse des globules rouges (Tris 20 mM pH 7,5/MgCl2 5 mM). Après
incubation 15 min dans la glace, la solution est centrifugée 5
min à 4 °C à 2 900 rpm. Le culot est resuspendu dans
3,5 ml d'une solution NaCl 400 mM/EDTA 2 mM. Après addition de
200 µl de SDS à 10 % et 80 µl de protéinase K
(10 mg/ml), la solution est incubée 4 h à 56 °C. Une
solution de phénol saturée avec anti-oxydant est additionnée
volume à volume. Après centrifugation à 4 000 rpm
pendant 5 min, la phase aqueuse est recueillie et traitée volume
à volume par le mélange chloroforme-alcool isoamylique 24:1.
Après une nouvelle centrifugation de 10 min à 4 000 rpm,
la phase aqueuse est recueillie et l'ADN est précipité par
l'addition d'une solution d'éthanol absolu (2 volumes) et de NaCl
5 M. Après centrifugation à 6 000 g à 4 °C,
l'ADN est lavé par une solution d'éthanol à 70 %,
puis séché et redissous dans 500 µl de tampon Tris-EDTA
10/1 pH 8.
d) Quiagen Blood Kit Maxi®. Le protocole utilisé
a été celui proposé par le fabricant. À 5
ml de sang total sont ajoutés 500 µl de la solution de protéinase
K (20 mg/ml) et 6 ml de tampon AL. Après homogénéisation
et incubation 10 min à 70 °C, 6 ml d'éthanol absolu
sont ajoutés. La solution est alors déposée sur une
colonne QiAmp maxi, puis centrifugée 3 min à 1 850 g. La
colonne est ensuite lavée avec 5 ml de tampon AW1 suivi d'une centrifugation
de 1 min à 4 500 g. Elle est de nouveau lavée avec 5 ml
de tampon AW1. Après centrifugation 1 min à 4 500 g et évaporation
des restes d'alcool éthylique à 70 °C pendant 10 min,
l'ADN est élué par 1 ml de tampon AE équilibré
à température ambiante suivi d'une centrifugation 5 min
à 4 500 g.
e) Méthode au chlorure de guanidium. À 5 ml de
sang total sont ajoutés 30 ml de solution de lyse des globules
rouges (Tris 10 mM pH 7,4/EDTA 10 mM). Après incubation 30 min
dans la glace, la solution est centrifugée 10 min à 4 °C
à 4 000 rpm. Le culot est resuspendu dans 40 ml d'une solution
Tris 10 mM pH 7,4/EDTA 10 mM. Après incubation 10 min dans la glace,
la solution est centrifugée 10 min à 4 °C à
4 000 rpm. Le culot est resuspendu dans 2 ml d'une solution Tris 10 mM
pH 7,4/EDTA 10 mM pH 8/NaCl 50 mM, additionnée de 10 ml de chlorure
de guanidium 6 M et de 500 µl d'acétate d'ammonium 7,5 M.
Après agitation pendant 1 h, et addition de 1,5 ml de sarcosyl
à 5 % et 300 µl de protéinase K (10 mg/ml), la solution
est incubée 2 h à 56 °C. L'ADN est ensuite précipité
par l'addition d'une solution d'éthanol absolue (2,5 volumes).
L'ADN est récupéré à l'aide d'une baguette
en verre, puis lavé à deux reprises par une solution d'éthanol
à 70 %, puis séché et redissous dans 500 µl
de tampon Tris-EDTA 10/1 pH 8.
* Critères d'évaluation de la qualité
de l'ADN
Les critères d'évaluation des différents procédés
ont été :
La taille des fragments d'acides nucléiques. La
taille des fragments a été contrôlée par électrophorèse
sur un gel d'agarose à 0,8 %. Deux à 5 µl (selon le
procédé) de la solution d'ADN ont été déposés
dans chaque puits d'un gel d'agarose à 0,8 % soumis à une
migration sous un courant de 100 volts pendant 2 h. Cette analyse permet,
par ailleurs, d'observer une éventuelle dégradation de l'ADN
survenue au cours de l'extraction.
Le rendement de l'extraction. La concentration de l'ADN
extrait a été déterminée en mesurant l'absorbance
à 260 nm des solutions diluées au 1/100 ou 1/50 (selon le
procédé), sachant que 1 U DO correspond à 50 mg/ml
d'ADN. Le rendement a été calculé en réalisant
le rapport entre la quantité d'ADN obtenue et le volume initial
de sang total utilisé.
La pureté. La contamination de l'ADN extrait par
des protéines a été appréciée en mesurant
la densité optique des extraits à 260 et 280 nm et en effectuant
le rapport DO 260 nm/DO 280 nm. La pureté a été aussi
appréciée en vérifiant l'amplification d'un fragment
d'ADN par la Taq polymérase. L'amplification d'une région
de 255 pb contenant l'exon 4 du gène codant pour la protéine
SpB du surfactant ou l'amplification d'un fragment de 91 pb correspondant
à l'exon 10 du gène CFTR ont été ainsi réalisées.
Les fragments amplifiés par PCR ont été contrôlés
par électrophorèse sur un gel d'agarose à 2 %. La
pureté a enfin été vérifiée en appréciant
l'efficacité de la simple digestion par Bcl I, et de la double
digestion par les enzymes de restriction EcoRI et EagI. Les produits de
digestion ont été séparés par électrophorèse
sur un gel d'agarose à 0,8 %, transférés sur une
membrane Neutral (Appligène-Oncor) et hybridé avec la sonde
StB12 ou la sonde A [6].
La rapidité. Le temps nécessaire pour réaliser
une extraction a été déterminé : temps réel
et temps de travail.
Résultats
Les principaux résultats quantitatifs sont regroupés dans
le tableau 1. Le rendement
moyen de l'extraction de l'ADN, calculé en réalisant le
rapport de la quantité d'ADN obtenu et du volume initial de sang,
était plus élevé avec les méthodes utilisant
les solvants organiques qu'avec les méthodes basées sur
l'utilisation de colonnes de résine échangeuse d'ions. Avec
la méthode Nucléobond AXG 100®, le rendement
pouvait varier selon l'échantillon de 4,5 à 42,6 µg/ml
de sang frais. Pour ces mêmes échantillons situés
aux valeurs extrêmes, le rendement obtenu avec la méthode
« de référence » au phénol-chloroforme
était de 31,7 et de 35,5 µg/ml, respectivement. La pureté,
appréciée en effectuant le rapport DO 260 nm/DO 280 nm,
est correcte quelle que soit la méthode utilisée. On observe
une plus grande variation inter-échantillon avec la méthode
Nucléobond AXG 100® qu'avec la méthode «
de référence ». Les rapports de DO 260 nm/DO 280 nm
varient de 1,2 à 2,05 avec la méthode Nucléobond
AXG 100®, alors que ce rapport ne varie que de 1,52 à
1,97 avec la méthode « de référence ».
Avec la méthode au chlorure de guanidium, ce rapport varie de 1,62
à 1,82. Avec la méthode Quiagen Blood Maxi®,
les rapports se répartissent entre 1,62 et 1,93. Avec la méthode
Nucléospin Blood®, les rapports de DO 260 nm/DO
280 nm étaient inexploitables variant de 0,6 à 3,2. Ces
rapports sont la conséquence de la coloration brunâtre des
solutions d'ADN obtenues avec cette méthode, due probablement à
l'impossibilité d'éliminer la totalité de l'hémoglobine.
Cette purification imparfaite de l'ADN est probablement à l'origine
de la dégradation de l'ADN lors de sa conservation à 4 °C
(4 échantillons/30 en un mois). Les concentrations finales d'ADN
étaient plus élevées avec les méthodes utilisant
les solvants organiques qu'avec les méthodes basées sur
l'utilisation de microcolonnes de résine échangeuse d'ions.
Avec la méthode « de référence », les concentrations
variaient de 385 ng/µl à 1 140 ng/µl. Au contraire, avec
la méthode Nucléobond AXG 100®, les concentrations
variaient de 60 à 852 ng/µl. De même, avec la méthode
Quiagen Blood Maxi®, les concentrations finales étaient
relativement faibles de 150 à 495 ng/µl en fonction du volume
final (350 à 700 µl).
Sur un plan qualitatif, l'amplification du fragment de 255 pb ou de
91 pb a été réalisée avec succès pour
tous les échantillons extraits par les méthodes au phénol-chloroforme,
au chlorure de guanidium et par Quiagen Blood Kit Maxi®.
Avec la méthode Nucléospin Blood®, l'amplification
du fragment d'ADN de 255 pb a été réalisée
avec succès pour 26 des 30 échantillons dès le premier
essai. Les 4 échantillons n'ayant pas amplifié au premier
essai ont été amplifiés correctement lors d'une deuxième
tentative, suggèrant plus un problème technique lors de
l'amplification que la présence d'inhibiteurs de réactions.
Avec la méthode Nucléobond AXG 100®, l'amplification
du fragment d'ADN de 255 pb a été réalisée
avec succès pour 27 des 30 échantillons. Les 3 échantillons
d'ADN n'ayant pas ou faiblement été amplifiés au
premier essai ont tous été correctement amplifiés
au cours de la deuxième tentative.
Les contrôles réalisés par électrophorèse
sur gel d'agarose ont permis d'apprécier la qualité et la
taille des ADN extraits par les différentes méthodes. Les
ADN obtenus avec les méthodes au chlorure de guanidium, au phénol-chloroforme,
par Quiagen Blood Kit Maxi®, Nucléobond AXG 100®
et Nucléospin Blood® sont en très grande
majorité des fragments de grande taille (> 21 kb) très
faiblement dégradés. La concentration des ADN obtenus avec
la méthode Nucléospin Blood® est significativement
plus faible (20 ng/µl environ) qu'avec les autres méthodes,
mais la variation inter-échantillon apparaît être faible.
Des échantillons d'ADN extrait par chacune des différentes
méthodes (à l'exception de la méthode Nucléospin
Blood®) ont été digérés par
les enzymes de restriction EcoRI et EagI et ont été soumis
à une analyse par Southern-Blot en utilisant la sonde StB12. La
double digestion a été correcte pour tous les échantillons
d'ADN testés, ainsi que le transfert et l'hybridation. Les fragments
attendus de 2,8 et 5,2 kb ont été correctement visualisés
avec tous les ADN testés (figure
1). Par ailleurs, nous avons digéré par l'enzyme
de restriction Bcl I des échantillons d'ADN extrait par les méthodes
phénol-chloroforme, chlorure de guanidium et Quiagen Blood Kit
Maxi® (figure 2).
Les fragments d'ADN digérés ont été soumis
à un Southern-blot en utilisant la sonde A utilisée pour
le diagnostic de l'inversion dans l'hémophilie A. Cette technique
nous a permis de vérifier la possibilité de détecter
des fragments génomiques de grande taille de 21 Kb avec les trois
méthodes testées.
Commentaires
Quelle que soit la méthode d'extraction et de purification des
acides nucléiques utilisée, nous avons obtenu de l'ADN en
qualité et en quantité suffisantes pour réaliser
des actes de biologie moléculaire. Le rendement moyen d'extraction
était de 15 à 41 µg/ml de sang frais en fonction des
méthodes. Cette quantité permet de réaliser au minimum
une analyse par Southern-blot et plusieurs dizaines de réactions
de PCR par ml de sang. La méthode Nucléospin Blood®
ne permet toutefois pas d'obtenir un ADN en qualité et en concentration
suffisante pour réaliser avec sécurité un Southern-blot.
La pureté est considérée comme satisfaisante avec
toutes les méthodes testées. Le rapport de DO 260/280 nm
a été notamment excellent avec la méthode Quiagen
Blood Kit Maxi®. En revanche, les concentrations en ADN
sont nettement plus faibles avec les méthodes basées sur
l'utilisation de colonnes de résine échangeuse d'ions par
rapport aux méthodes utilisant des solvants organiques. Les concentrations
en ADN obtenues avec les méthodes Quiagen Blood Kit Maxi®
et Nucléobond AXG 100® sont en moyenne de 217 et
306 ng/µl. Ces concentrations, bien adaptées à la méthode
PCR, ne sont pas adaptées à des expériences ultérieures
de Southern-blot, nécessitant environ 10 µg dans un faible
volume (10 à 30 µl). Il faut dans ces cas effectuer des concentrations
par précipitation.
Les échantillons d'ADN extrait par les différentes méthodes
testées ont été correctement amplifiés par
PCR et digérés par une ou plusieurs enzymes de restriction.
Les techniques de Southern-blot ont été réalisées
avec succès avec tous les échantillons d'ADN testés,
permettant de détecter aisément des fragments de 20 kb.
En termes de temps, la méthode testée la plus rapide a
été la méthode Nucléospin Blood®
qui permet d'obtenir un ADN en solution en 30 min (20 min de travail effectif).
Cette méthode est ainsi particulièrement adaptée
aux échantillons sanguins de petit volume (sang fœtal, sang
de nouveau-né et de nourrisson...). La méthode Quiagen Blood
Kit Maxi® permet d'obtenir un ADN en solution en 2 h 30
(dont 1 h 35 de travail effectif). La méthode Nucléobond
AXG 100®, en l'absence de centrifugation, est plus longue,
environ 5 h (dont 2 h 40 de travail effectif). Les méthodes les
plus longues sont celles utilisant les solvants organiques (6 h avec la
méthode au chlorure de guanidium et 6 h avec la méthode
au phénol-chloroforme (dont 5 h 20 de travail effectif, sans compter
le temps de resuspension et d'homogénéisation de l'ADN en
solution). Des méthodes très rapides, adaptées uniquement
à l'amplification par PCR de fragments génomiques, ont été
récemment commercialisées : Genereleaser®
de ATGC Biotechnologie, qui consiste à ajouter 1 µl de sang
directement dans un tube PCR contenant une solution de lyse (10 mn), et
Dynabeads DNA direct® de Dynal, qui consiste à purifier
de l'ADN dans un seul tube à partir de 10 µl de sang à
l'aide de microbilles magnétiques (10 mn). L'avenir est probablement
dans l'automatisation de ces méthodes d'extraction de l'ADN.
En termes de coût en matériel et réactifs (tableau
2), les méthodes conventionnelles (phénol-chloroforme,
chlorure de guanidium) sont les moins coûteuses. La méthode
Nucléospin Blood® semble toutefois bien adaptée
aux analyses par PCR limitées en nombre et dans le temps (absence
d'analyse complémentaire ultérieure). Les méthodes
Quiagen Blood Maxi® et Nucléobond AXG 100®,
plus simples et plus rapides que les méthodes conventionnelles,
réduisent le coût en personnel et peuvent ainsi être
des alternatives intéressantes dans certains laboratoires.
Le tableau 3 récapitule
les principales qualités et les principaux inconvénients
des différents procédés d'extraction des acides nucléiques
à partir d'un échantillon sanguin et devrait ainsi aider
les biologistes à choisir la méthode d'extraction la plus
adaptée à leur besoin.
La conservation des acides nucléiques n'a pas été
testée dans cette étude. Il apparaît toutefois que
pour des préparations d'ADN purs conservés à
20 °C, l'ADN se conserve plus de 10 ans [7].
Article reçu le 7 juillet 1998, accepté le 26 octobre 1998.
REFERENCES
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a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor,
New York, 1989.
2. Jeanpierre M. A rapid method for the purification of DNA from
blood. Nucleic Acids Res 1987 ; 15 : 9611.
3. Johns MB, Paulus-Thomas JE. Purification of human genomic
DNA from whole blood using sodium perchlorate in place of phenol. Anal
Biochem 1989 ; 180 : 276-8.
4. Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting-out for
extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res 1988
; 16 : 1215.
5. Atelier Biomed « Mucoviscidose », Créteil,
22-24 avril 1997.
6. Wion KL, Tuddenham EDG, Lawn RM. A new polymorphism in the
factor VIII gene for prenatal diagnosis of hemophilia A. Nucleic Acids
Res 1986 ; 14 : 4535-42.
7. Madisen L, Hoar DI, Holroyd CD, Crisp M, Hodes ME. DNA banking
: the effects of storage of blood and isolated DNA on the integrity of
DNA. Am J Med Genet 1987 ; 27 : 379-90.
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