John Libbey Eurotext

Annales de Biologie Clinique

Recommandations pour l’analyse du liquide céphalorachidien au cours des leucémies aiguës Volume 75, numéro 5, Septembre-Octobre 2017

Le liquide céphalorachidien (LCR) est sécrété par les plexus choroïdes ventriculaires et, a minima, par l’épendyme ventriculaire et les vaisseaux sanguins des espaces sous-arachoïdiens ; le LCR occupe les cavités ventriculaires cérébrales et les espaces arachnoïdiens. Le volume total de LCR est de 140 mL chez l’adulte, 100 mL chez l’enfant de 10 ans et 50 mL chez le nourrisson. Il est produit par filtration et sécrétion active et est renouvelé 3 fois/jour. La résorption a lieu entre les espaces sous-arachnoïdiens et le sang veineux, par différence de pression au niveau des villosités de l’arachnoïde. Les échanges entre le LCR et le système nerveux central se font au niveau de la barrière méningo-encéphalique, et ceux entre le sang et le LCR au travers de la barrière hémato-méningée.

Le LCR peut être le siège d’une atteinte tumorale au cours des hémopathies aiguës, au diagnostic initial ou lors de leur évolution. Au diagnostic de leucémie aiguë lymphoblastique (LAL), un envahissement méningé est identifié dans 3 à 5 % des cas chez l’enfant et 5 à 10 % des cas chez l’adulte, avec une plus grande fréquence au cours des LAL T et des formes hyperleucocytaires [1-7]. Dans les leucémies aiguës myéloblastiques (LAM), l’atteinte représente 10 % des cas chez l’enfant et moins de 5 % des cas chez l’adulte, et est plus fréquemment identifiée dans les LAM4 (FAB), LAM5 (FAB) et les formes hyperleucocytaires [5, 8-15]. L’identification d’une atteinte méningée blastique au diagnostic d’une LA est de mauvais pronostic. Lors des rechutes, l’atteinte méningée, isolée ou non, est surtout observée dans les LAL, en pédiatrie et chez l’adulte, avec des pourcentages variant entre 1 et 15 % des patients selon les études [9, 10, 16-18]. Le pronostic après rechute avec atteinte méningée est très péjoratif. Chez l’adulte, jusqu’à 15 % des rechutes ont une atteinte méningée [19]. Chez l’enfant, les séries actuelles font état d’une nette diminution de cette localisation représentant dans certains essais cliniques moins de 2 % des cas [20]. Ce progrès est la conséquence de la mise en place de thérapeutiques adaptées, telles que l’intensification de chimiothérapies intra-thécales basées sur un risque méningé défini au diagnostic selon une classification standard internationale. Établie en 1993 lors du National cancer institute workshop, puis suivie de quelques évolutions, cette classification prend en compte le nombre d’hématies, d’éléments nucléés par mm3 et la présence ou non de blastes trouvés sur les étalements de cytocentrifugation de LCR natif [21]. Les patients sont alors traités en fonction du status de leur atteinte méningée [22, 23].

La cytologie du LCR, qui permet d’identifier la présence de blastes au microscope, reste donc le gold standard dans la détection des envahissements neuro-méningés, et ce malgré les progrès de l’imagerie (IRM), et le développement de techniques non cytologiques telles que l’immmunophénotypage par cytométrie en flux, l’hybridation fluorescente in situ, la PCR, ou la recherche de marqueurs protéomiques [24-26]. Il est donc important de disposer d’une technique optimale pour réaliser les étalements puis l’identification cytologique éventuelle des blastes.

Définition de l’atteinte méningée dans les hémopathies aiguës et le central nervous system status

Les atteintes méningées des leucémies aiguës (LA) correspondent à la présence de foyers de cellules pathologiques situés le plus souvent au niveau de la dure-mère, de l’arachnoïde ou du parenchyme cérébral [27-30]. La diffusion dans ces espaces des cellules blastiques est d’origine vasculaire, par emboles hématogènes. La présence d’une cellule blastique par mm3 dans le LCR correspond approximativement à la présence de 105 cellules blastiques dans l’ensemble de l’espace intra-thécal.

Avant les années 1980, le diagnostic d’infiltration blastique neuro-méningée dans les hémopathies aiguës était affirmé en morphologie après identification de blastes dans le LCR comportant en valeur absolue plus de 10 leucocytes/mm3[31]. En 1985, lors du Rome leukemia workshop, la valeur absolue des leucocytes a été abaissée à 5/mm3[21]. Puis au cours des années 1990, l’équipe du St Jude Children's Hospital observa un risque élevé de rechute méningée chez des enfants dont le LCR était blastique avec une valeur absolue des leucocytes inférieure à 5/mm3[1]. Une révision de la définition de l’atteinte méningée fut alors réalisée tenant compte de la proportion des leucocytes et la classification du Central nervous system (CNS) status(CNS status) fut adoptée en 1993 lors du National cancer institute workshop (tableau 1).

Dès 1996, les ponctions lombaires traumatiques, contaminées par des éléments du sang périphérique et notamment comportant plus de 10 hématies par mm3 et des blastes étaient considérées comme « contaminées » [22, 32].

En 2003, la description dans plusieurs études cliniques de ponctions traumatiques (traumatic lumbar puncture : TLP) avec plus de 10 hématies par mm3 infiltrées ou non par des blastes (respectivement TPL + et TLP -), a permis de faire à nouveau évoluer le CNS status[23] (tableau 2).

Appliquée initialement dans les LA pédiatriques, cette classification, établie en 2003, est aujourd’hui utilisée également chez les patients adultes. L’utilisation de ce CNS status a pour but de permettre une meilleure comparaison entre les études cliniques et d’harmoniser les attitudes thérapeutiques lors des atteintes méningées. Elle est basée sur le résultat de la numération des leucocytes et des hématies à l’hématimètre, méthode de comptage de référence, et sur l’identification ou non de blastes sur l’étalement cytocentrifugé du LCR natif homogénéisé. Elle nécessite, dans le cadre des bilans d’extension et de suivi des hémopathies, d’avoir un protocole technique d’analyse du LCR standardisé, commun entre les centres [33]. L’immunophénotypage par cytométrie en flux du LCR, qui a pour but de confirmer les résultats de l’analyse cytologique, n’entre pas dans la définition du risque méningé puisque la classification est basée sur des données cytologiques de présence ou d’absence d’infiltration blastique. Par ailleurs, certaines études ont révélé la mauvaise corrélation entre la numération en valeur absolue des leucocytes obtenue par la méthode de référence à l’hématimètre et celle obtenue par cytométrie en flux [34]. Cette technique peut donc être utilisée pour vérifier la nature blastique d’élément difficile à classer mais ne doit pas être utilisée pour appliquer la classification du CNS status. En effet d’une part, la numération des leucocytes peut être différente de celle de l’hématimètre et, d’autre part, la détection de blastes plus fréquente puisque plus sensible et spécifique.

Au diagnostic, le risque méningé est alors défini par le CNS status initial. Si une infiltration blastique méningée est détectée initialement (cas des status CNS-2, TLP + et CNS-3), celle-ci sera contrôlée quelques jours tard selon les indications du protocole de traitement et ce jusqu’à disparition du clone blastique.

Une harmonisation des modes opératoires techniques est nécessaire

Afin de pouvoir utiliser la classification du CNS status et obtenir des résultats d’analyse du LCR comparables entre les laboratoires de biologie médicale, il est nécessaire d’uniformiser le mode opératoire technique de cette analyse dans les hémopathies aiguës.

Puisque les indications des protocoles de traitement sont limitées ou absentes, il était nécessaire, avant d’établir cette harmonisation, de réaliser dans un premier temps, un état des lieux des pratiques nationales de 25 centres hospitalo-universitaires prenant en charge cette analyse.

Les questions de l’enquête, réalisée par mailing, portaient sur le délai d’acheminement du prélèvement au laboratoire, la description des étapes de la technique, le matériel utilisé, le volume de LCR étudié, les caractéristiques de la vitesse et du temps de la cytocentrifugation, l’addition ou non de sérum enrichi en protéine avant cytocentrifugation avec précision du volume ajouté. La synthèse des réponses a permis de mettre en évidence la grande variabilité des modes opératoires et le manque de comparabilité entre les centres (tableau 3).

Par ailleurs, il a été constaté que les protocoles d’analyses proposés par la société Shandon (Thermo Shandon Pittsburgh, PA, USA), qui est le fournisseur principal des cytocentrifugeuses des CHU évalués, n’étaient pas respectés. Pour information, le constructeur conseille la cytocentrifugation d’un volume compris entre 200 et 500 μL de LCR avec addition d’environ 50 μL d’albumine et une centrifugation de 5 à 15 minutes à 54 g [35].

Dans un second temps, un protocole d’analyse a été établi dans deux centres hospitalo-universitaires à fort recrutement en hématologie pédiatrique (Assistance publique des hôpitaux de Paris (AP-HP) et Hospices civils de Lyon). Un travail collaboratif a été entrepris entre les laboratoires de biologie de l’Hôpital Robert Debré de l’AP-HP (Dr Odile Fenneteau) et le Laboratoire de biologie médicale multi-sites des Hospices civils de Lyon (Dr Sandrine Girard). Plusieurs études comparatives ont été menées dont les résultats ont permis de proposer des recommandations techniques d’analyse du LCR chez l’enfant au cours du diagnostic et du suivi des hémopathies aiguës, applicables à l’ensemble des laboratoires.

Entre octobre 2010 et mars 2012, des échantillons de LCR de patients leucémiques (âge < 18 ans) en cours de diagnostic ou en cours de suivi (< 2 ans du diagnostic initial) ont été analysés. Le matériel utilisé était composé de cytocentrifugeuses cytospin Shandon. Dans chaque chambre de cytocentrifugation était dispensé un volume final de 350 μL de LCR. Il s’agissait soit de LCR pur comportant moins de 500 GB/mm3 et/ou moins de 500 GR/mm3, soit de LCR dilué dans une solution saline pour les prélèvements plus leucocytaires et/ou hématiques. Chez 76 patients, a été testée l’addition de 30 ± 10 μL de sérums enrichis en protéines (sérum de veau fœtal (SVF) 1 % ou albumine 30 %) versus LCR pur. Les paramètres de cytocentrifugation ont été testés avec variations du temps et de la vitesse dans les limites des indications du constructeur. Les étalements obtenus ont été observés par 2 biologistes hématologistes cellulaires spécialisés dans l’étude morphologique du LCR (Odile Fenneteau et Sandrine Girard). Leurs observations sont à l’origine des propositions développées ensuite. L’étude portant sur les paramètres de cytocentrifugation a été réalisée dans le centre du Dr Odile Fenneteau. L’étude avec ajout ou non de sérum enrichi en protéine a été réalisée dans le centre du Dr Sandrine Girard. Les analyses cytologiques ont été réalisées sur chaque site indépendamment avec une première lecture assurée par les biologistes du site et une seconde lecture à l’aveugle par l’hématologiste cellulaire spécialisée dans l’étude du LCR du site concerné.

L’étude cytologique et le rendement cellulaire ont été vérifiés dans une série de 76 LCR de patients atteints de leucémie prélevés au diagnostic ou au cours de leur suivi (tableau 4). Deux cytocentrifugations ont été réalisées pour chaque LCR avec et sans addition de sérum enrichi en protéine (SVF ou albumine).

Parmi ces 76 échantillons, 38 ont été analysés avec ou sans ajout de SVF et 38 avec ou sans ajout d’albumine. Les résultats obtenus ont été comparés. Les cytospins du groupe « ajout de sérum enrichi en protéine » comportaient en moyenne 4 fois plus de leucocytes dont 3 fois plus de polynucléaires neutrophiles, 4 fois plus de lymphocytes et 7 fois plus de monocytes (tableau 4) que ceux du groupe « sans ajout de sérum enrichi en protéine. Cette différence de composition a confirmé que l’ajout de sérum enrichi en protéine, SVF ou albumine, améliorait l’adhérence cellulaire et permettait d’obtenir des cytospins de densité cellulaire plus riche et donc contribuait à augmenter la sensibilité de détection de l’infiltration blastique. Aucune différence notable n’a été décelée entre les 2 sérums enrichis en protéine utilisés, SVF et sérum albumine (p = 0,71).

L’analyse comparative a permis également de déceler la présence de blastes chez 4 patients du groupe « ajout de sérum enrichi en protéine » (status CNS-2 ou TLP+), tandis qu’aucun blaste n’était détecté sur le culot de centrifugation obtenu sans ajout de sérum.

Nous avons testé les préconisations de durée de cytocentrifugation en comparant le nombre et l’aspect des éléments présents sur les lames après centrifugation durant 8 et 10 minutes. Aucune différence notable n’a été identifiée sur ce critère.

Nous avons établi une grille de correspondance entre la numération cellulaire en mm3 obtenue après comptage à l’hématimètre et le nombre de cellules qu’il est attendu d’obtenir sur la lame cytocentrifugée (tableau 5). Cette correspondance permet de s’assurer de l’absence de problèmes techniques au moment de la cytocentrifugation.

Recommandation technique d’analyse du LCR en hématologie pédiatrique

Phase préanalytique

Le LCR doit être prélevé dans un tube stérile. L’ordre de distribution du LCR dans les différents tubes de conditionnement destinés aux analyses biochimiques, bactériologiques et cytologiques est à respecter. Ainsi le dernier tube de prélèvement est réservé à l’analyse cytologique. Dans le cas d’un prélèvement en très faible quantité, ne permettant de ne recueillir qu’un seul tube, l’analyse cytologique est à privilégier. Les 4 premières gouttes ne doivent pas être recueillies puisque contaminées par du sang périphérique issu de l’effraction.

Les échantillons sont à acheminer au laboratoire de biologie médicale le plus rapidement possible après le prélèvement, à température ambiante, idéalement dans un délai inférieur à 2 heures et toléré jusqu’à 4 heures. En effet, l’altération des cellules nucléées et des hématies apparaît dès la première heure suivant le prélèvement [36]. Cependant, jusqu’à 4 h, l’identification des cellules y compris blastiques est possible.

Dans le cas d’un transport avec un délai d’acheminement supérieur à 4 heures, le prélèvement est à conserver et à transporter à +4 ̊C durant 24 heures maximum [33].

Phase analytique

L’analyse cytologique nécessite le prélèvement d’un minimum de 500 μL de LCR. Ce volume minimum est important à respecter puisqu’il conditionne la proportion de faux négatifs. En effet, le taux de faux négatifs diminue lorsque le volume analysé augmente [37]. Les volumes prélevés pour l’analyse cytologique dans le cadre des bilans d’extension et suivi des hémopathies aiguës adultes ou pédiatriques étant inférieurs à 2 mL, la technique de concentration de choix est la cytocentrifugation directe [38]. Après réception au laboratoire, l’échantillon est traité le plus rapidement possible. Le LCR natif est homogénéisé par une dizaine de retournements manuels lents. Les hématies et éléments nucléés sont comptés par méthode manuelle selon la méthode du laboratoire : du LCR natif est introduit dans un hématimètre conventionnel réutilisable (cellule de Nageotte, cellule de Malassez) ou à usage unique (C-CHIP). Avant comptage des hématies et des éléments nucléés, il convient de laisser se déposer les éléments dans la chambre de comptage durant 3 à 5 minutes en chambre humide. Les systèmes d’analyse automatique actuels ne sont pas performants en termes de seuil de sensibilité, notamment pour les GR, et ne peuvent donc être une alternative à la numération des éléments par la méthode de référence manuelle en cellule de comptage [39].

Une cytocentrifugation directe est ensuite réalisée ; 30 ± 10 μL de sérum enrichi en protéine (sérum albumine 30 % ou, à défaut, de SVF 1 %) sont préalablement introduits dans le dispositif de centrifugation suivi d’un volume défini de LCR natif. Ce volume de LCR à cytocentrifuger dans chaque dispositif varie selon la proportion d’éléments nucléés et d’hématies, et conditionne le nombre de cytospins à obtenir. En effet, plus l’échantillon est hématique et/ou hyperleucocytaire, plus il devra être dilué et le nombre de cytospins augmentera (2 au lieu de 1 en cas de dilution au ½). Il n’a pas été noté d’incidence de la variation du volume de sérum enrichi en protéine ajouté sur le résultat de la cytocentrifugation lorsque celui-ci était compris entre 20 et 50 μL.

Cependant, l’addition de ce sérum permet d’obtenir une concentration protéique qui optimise l’adhérence cellulaire sur la lame de verre, et diminue les phénomènes de distorsion cellulaire provoqués par la force de centrifugation (qui modifie la morphologie des cellules).

Au final, le volume de LCR natif à cytocentrifuger par lame dépend du compte en éléments nucléés et hématies et doit être au final le même pour tous les patients, selon le tableau 6.

L’échantillon (± la solution saline en cas de dilution) est introduit dans le dispositif de dispensation de la cytocentrifugeuse après le sérum enrichi en protéine. Le volume total à introduire quel que soit le nombre d’éléments nucléés et d’hématies est toujours de 380 μL.

L’homogénéisation de l’équipement utilisé dans les laboratoires réalisant cette analyse contribue à améliorer la comparabilité des résultats. Il est préférable d’utiliser un même type de cytocentrifugeuse. Le volume maximal total à introduire dans le dispositif de dispensation correspondant à la capacité maximale d’absorption du filtre est de 500 μL, tandis que le volume minimal est de 200 μL. Le volume total préconisé dans les recommandations étant de 380 μL, nous sommes dans les conditions optimales d’utilisation du dispositif de dispensation puisque nous distribuons 350 μL de LCR natif et 25 ± 5 μL de sérum enrichi en protéine.Les paramètres de cytocentrifugation suivent les préconisations du fournisseur, à savoir une vitesse de centrifugation comprise entre 700 ± 100 rpm (soit entre 39 à 70 g) durant 11 ± 3 minutes, avec sélection d’une accélération « LOW » puisque le LCR est habituellement paucicellulaire. Une fois la cytocentrifugation terminée, les lames sont séchées à l’air libre puis colorées au May-Grünwald-Giemsa, méthode de coloration de référence de l’hématologie. À défaut, le Wright-Giemsa peut être utilisé. La lecture cytologique est réalisée au microscope optique ou peut être automatisée par utilisation de systèmes d’analyses d’image. Lorsque le prélèvement est hémorragique et qu’une dilution de l’échantillon de LCR natif est effectuée, l’ensemble des lames de cytocentrifugation obtenues doit être analysé en continuité.

Phase post-analytique

Après analyse microscopique, les échantillons de LCR sont conservés au moins 24 h à +4 ̊C tout en notant qu’ils ne sont plus analysables après 4 h à température ambiante et 24 h à +4 ̊C. La conservation des lames obéit au code de la santé publique R 6211-44 modifié par le décret n̊ 2007-1131 du 23 juillet 2007. Leur délai de conservation est de dix ans. Cependant, la durée de conservation des résultats étant au minimum de vingt ans selon l’arrêté du 26 novembre 1999 relatif à la bonne exécution des analyses de biologie médicale, modifié par l’arrêté du 26 avril 2002, nous recommandons de conserver les cytospins d’intérêt au moins 20 ans.

Conclusion

L’analyse cytologique du LCR permet de déceler une infiltration blastique méningée des hémopathies aiguës et d’en suivre l’évolution au cours du traitement. La stratification des patients, l’apparition de nouvelles thérapeutiques (aracytine liposomal par exemple), l’adaptation du traitement avec, notamment la diminution voire la disparition de l’indication des irradiations crâniennes, et l’adéquation du traitement par injection intrathécale avec le risque méningé (CNS status) ont permis de diminuer considérablement la proportion des rechutes méningées au cours des LA. Il était donc nécessaire que des recommandations techniques de l’analyse cytologique du LCR soient établies dans le but d’obtenir des résultats homogènes, fiables et reproductibles. Nos propositions ont pour but d’améliorer la qualité de cette analyse et de tenter d’harmoniser les pratiques.

Remerciements.

Les auteurs tiennent à remercier pour leur participation active à l’enquête sur les modes opératoires d’étude cytologique du LCR au cours des hémopathies aiguës : V. Augis (Bordeaux), F. Bailly (Dijon), C. Bret (Montpellier), C. Brouzes (AP-HP Necker), M.P. Callat (Rouen), S. Daliphard (Reims), E. Duchayne (Toulouse), M. Eveillard (Nantes), C. Ferraro-Vacher (Nice), C. Fossat (Marseille), M. Fournier (Lille), F. Genevieve (Angers), H. Lapillone (AP-HP Trousseau), V. Latger-Cannard (Nancy), F. Lellouche (Poitiers), M. Malet (Caen), G. Mareynat (Clermont-Ferrand), V. Marion (Brest), A. Petit (Tours), F. Schillinger (Besancon), F. Trimoreau† (Limoges), C. Vasselon (Saint-Étienne), C. Vettier (Grenoble), E. Zink† (Strasbourg).

Liens d’intérêts

Les auteurs déclarent ne pas avoir de lien d’intérêt en rapport avec cet article.