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Annales de Biologie Clinique

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Diagnostic biologique du déficit en alpha-1-antitrypsine : développement d’un test simplifié sur goutte de sang recueillie sur papier-filtre Volume 72, numéro 6, Novembre-Décembre 2014

Illustrations

  • Figure 1
  • Figure 2
  • Figure 3
  • Figure 4
  • Figure 5
  • Figure 6

Tableaux

La structure des protéines joue un rôle crucial dans nombre de maladies humaines. De récentes découvertes ont montré qu’une minime modification de la structure primaire consistant dans le remplacement d’un acide aminé par un autre était susceptible d’affecter la fonctionnalité et/ou la quantité de la protéine mutée. Une simple mutation ponctuelle d’un acide aminé peut en effet être à l’origine d’une instabilité conformationnelle empêchant la protéine de se replier et la contraignant à contracter des liaisons avec d’autres molécules de conformation identique. Un repliement incomplet apparaît donc comme étant à l’origine d’un grand nombre de ces maladies dites conformationnelles, parmi lesquelles on individualise non seulement l’amylose mais aussi les serpinopathies [1].

Les serpinopathies regroupent donc l’ensemble des manifestations pathologiques qui résultent d’une anomalie structurale d’une classe particulière de protéines appelées serpines (acronyme pour serine protease inhibitors). Ces serpines constituent une superfamille dotée de plus de 500 membres dont la fonction est d’inhiber l’activité enzymatique des protéases à sérine mais aussi de protéases appartenant à d’autres classes. Le représentant emblématique de cette famille est connu sous plusieurs dénominations, la plus couramment utilisée étant alpha-1-antitrypsine (A1AT), appelée aussi alpha-1-protéase inhibiteur (alpha-1-PI).

L’A1AT est une glycoprotéine monocaténaire dont la synthèse hépatocytaire est sous la dépendance du gène SERPINA1, situé sur le bras long du chromosome 14. Ce gène de 12,2 kb s’organise en quatre exons codants (II, III, IV et V) et trois exons non codants (Ia, Ib et Ic) [2]. Les deux allèles parentaux sonttransmis de façon autosomale codominante. De masse moléculaire relative 52 000 Da et de mobilité α1 à l’électrophorèse des protéines sériques, l’A1AT est une antiprotéase qui joue un rôle important dans le contrôle de l’inflammation aiguë au cours de laquelle sa concentration circulante augmente et sa fonction principale s’exerce en inhibant spécifiquement l’élastase libérée par le neutrophile au cours des processus inflammatoires locaux, et particulièrement pulmonaires. Il existe, pour cette antiprotéase, un polymorphisme génétique important, plus de 120 mutations ayant été identifiées au niveau du gène SERPINA1 [2]. Ces mutations génétiques se traduisent pour les variants protéiques codés correspondants par des différences de mobilité électrophorétique dont rend compte l’utilisation de l’alphabet : le variant le plus ancien et le plus fréquent est le variant PIM : toutes les protéines d’A1AT de plus grande mobilité que la protéine PIM seront dénommées par une lettre dont la position dans l’alphabet sera comprise entre A et M et celles de mobilité plus faible par une lettre comprise entre M et Z. La plupart de ces mutations sont sans conséquence sur la synthèse, la sécrétion et la fonctionnalité de l’A1AT (protéines B, E, G, L, etc.), certaines ont des effets modérés (protéines S, I, P, F) et d’autres ont des effets délétères parce que survenant sur des zones structurales clés de la protéine (Z, Mmalton, Siiyama). Certaines mutations ont également pour conséquence l’absence totale d’A1AT circulante (allèle Q0) [3].

L’A1AT partage avec les autres serpines une structure commune comportant 9 hélices α et 3 feuillets plissés β (A à C) de 4 brins chacun et un mécanisme d’inhibition des enzymes protéolytiques commun dont les modalités ont été comparées au fonctionnement d’un piège à souris [4, 5] et qui repose sur l’existence d’un site actif externe mobile en forme de boucle localisé au pôle apical de la protéine. Ce centre actif comporte une séquence particulière de 20 acides aminés qui joue un rôle de pseudo-substrat pour l’enzyme cible et qui constitue le morceau de fromage du piège à souris. La liaison de l’enzyme à son pseudo-substrat entraîne un drastique changement conformationnel de l’inhibiteur caractérisé par l’insertion de la boucle réactive dans le feuillet β-A la transformant en brin β supplémentaire et par le passage de l’enzyme du pôle apical au pôle basal de la protéine où il se trouve sous forme d’un complexe serpine-protéase complètement inactif qui va être éliminé de la circulation. Ce mécanisme très évolué porte en lui-même le germe de ses faiblesses : des mutations qui vont porter sur des acides aminés proches du site actif (mutation Z), de la boucle réactive ou encore de la zone dite de l’obturateur (mutations Siiyama et Mmalton) vont être à l’origine de transitions conformationnelles aberrantes résultant en une accumulation de la serpine sur son lieu de synthèse créant ainsi une surcharge locale néfaste pour la vie de la cellule et une diminution de l’excrétion d’une protéine en conformation stable et fonctionnelle et à l’origine d’un déficit [6, 7].

La plus fréquente des mutations à l’origine d’un déficit sévère en A1AT est la mutation Z qui survient au niveau de l’acide aminé situé en position 342 de l’axe peptidique, entre l’extrémité du feuillet β-A et à 17 acides aminés de distance du site actif et a pour conséquence le remplacement d’un résidu d’acide glutamique par un résidu de lysine. Dans les conditions physiologiques, le processus de repliement d’une molécule d’A1AT nouvellement synthétisée est un processus d’une durée de quelques microsecondes se déroulant dans la lumière du réticulum endoplasmique (RE). Ce processus est encadré par des protéines chaperonnes dont la fonction est d’assister la protéine en l’aidant à adopter la structure tridimensionnelle requise, celle-ci étant sous le contrôle d’un équivalent du contrôle de qualité. Si la conformation adoptée est reconnue adéquate par le contrôle de qualité, l’A1AT nouvellement synthétisée va quitter le RE pour atteindre son site définitif en suivant la voie sécrétrice via l’appareil de Golgi. Si au bout de plusieurs cycles de prise en charge par les protéines chaperonnes, une molécule d’A1AT ne parvient pas à se replier correctement, elle se lie à la calnexine puis est ubiquitinylée par au moins 4 molécules d’ubiquitine et adressée au protéasome par le processus Erad (endoplasmic reticulum associated degradation) pour y être dégradée [4]. 15 % seulement des variants PIZ d’A1AT parviennent à se replier correctement et à suivre la voie sécrétrice physiologique et se retrouvent donc dans le sang circulant [8]. Les protéines PIZ mal repliées se retrouvent sous forme d’un composé instable où la boucle réactive est partiellement insérée au sommet du brin central du feuillet β-A dont l’extrémité basale est ouverte et à même de se lier à la boucle réactive d’une autre molécule de protéine PIZ. Il s’effectue une dimérisation qui de proche en proche va aboutir à la formation de polymères [9]. Ces polymères vont activer la réponse EOR (endoplasmic reticulum overload response) qui va aboutir à l’activation des gènes de l’inflammation et du système immunitaire et notamment de l’activation du facteur transcriptionnel nuclear factor-KB (NF-κB) [10]. En raison de leur structure très ordonnée, les polymères d’A1AT échappent au moins partiellement à la réponse UPR (unfolded protein response) normalement déclenchée par l’accumulation dans le cytoplasme de protéines malformées à l’origine d’un stress du réticulum endoplasmique [11]. La protéine PIZ va donc s’accumuler sous forme d’agrégats polymériques qui vont être à l’origine de l’apparition dans l’hépatocyte de globules PAS positifs à l’origine des pathologies hépatiques néonatales et adultes associées au déficit sévère en A1AT [12]. Il va en être de même pour les protéines PISiiyama et PIMmalton dont les acides aminés mutés sont localisés dans la zone sensible dite de l’obturateur. En revanche, si la protéine PIS résultant du remplacement, dans la zone de l’obturateur, de l’acide glutamique en position 264 par un résidu de valine et la protéine PII issue du remplacement, également dans la zone de l’obturateur, de l’arginine en position 39 par un résidu de cystéine peuvent également former des polymères in vivo, ils se forment en fait à une vitesse particulièrement lente qui se traduira simplement par un déficit quantitatif modéré de l’ordre de 40 % de la concentration physiologique versus 80 % pour la protéine PIZ [13]. Par contre, l’association d’une protéine PIZ à une protéine PIS ou PII entraînera la formation d’hétéropolymères potentiellement cirrhogènes.

L’A1AT PIZ dont la concentration circulante est de 5 à 10 fois plus basse chez les sujets homozygotes que celle de la protéine normale PIM (0,25 g/L vs 1,5) conserve une tendance à l’instabilité conformationnelle et a donc capacité à se polymériser. En outre, elle perd une grande partie de sa capacité fonctionnelle à inhiber l’élastase. Chez le sujet déficitaire, les polymères Z se déposent sur la paroi des alvéoles pulmonaires. Il s’ensuit une activation de la réponse EOR avec production de NF-κBet création d’une inflammation locale induisant un afflux de polynucléaires neutrophiles qui vont se lyser, libérant, par dégranulation, de l’élastase qui, en raison du déficit fonctionnel et quantitatif en A1AT, va détruire la paroi alvéolaire et être à l’origine du développement d’un emphysème pulmonaire [14].

Le déficit sévère en A1AT de type Z n’est pas en soi une maladie, mais il constitue un terrain particulier sur lequel, en fonction de facteurs environnementaux, encore mal définis à ce jour, peuvent se développer des états morbides spécifiques à l’origine de décès prématurés chez les sujets atteints. Afin d’en prévenir la survenue, il serait nécessaire de développer, à l’instar de ce qui se passe dans d’autres pays [15-17], un dépistage de ce déficit, actuellement largement sous-diagnostiqué [18], sachant que la fréquence de l’allèle PIZ sous notre latitude est d’environ 1 %, celle de l’allèle PIS de 10 %. Par conséquent, environ 10 000 personnes de génotype PIZ et 60 000 de génotype PISZ sont susceptibles, et sans s’en douter le moins du monde, de présenter cette prédisposition aux pathologies hépatiques et pulmonaires dans notre pays.

Plusieurs travaux ont montré [19-22] qu’il était possible de doser, phénotyper et génotyper par séquençage du gène SERPINA1, l’A1AT à partir de sang capillaire prélevé au bout du doigt et déposé sur un papier-filtre. C’est pourquoi, nous avons envisagé en collaboration avec le laboratoire LFB Biomédicaments, de mettre à disposition des pneumologues en exercice hospitalier ou privé, un coffret comportant tout le matériel nécessaire à ce type de prélèvement afin que celui-ci soit directement adressé au laboratoire concerné, l’objectif étant de dépister les patients présentant une symptomatologie pulmonaire et un déficit sévère en A1AT. Cette détection plus précocement faite du déficit devrait permettre de mettre en place des mesures prophylactiques visant à en réduire l’impact voire permettre la mise en place d’une thérapeutique substitutive [23].

Le préalable à cette ambition était de s’assurer de l’adaptabilité des données de la littérature à propos du diagnostic sur sang séché et d’homogénéiser les pratiques des trois laboratoires hospitaliers engagés dans cette collaboration et spécialisés dans l’exploration biologique des déficits en A1AT.

Nous rapportons donc ici les différentes phases de l’étude préliminaire technique que chacun des trois centres a effectuée afin d’assurer la transférabilité de ses résultats tant quantitatifs (mesure de la concentration en A1AT) que qualitatifs (phénotype/génotype) obtenus sur des prélèvements de sang total déposé sur papier-filtre.

Matériel et méthodes

Collecte des échantillons

Une étude préliminaire visant à mettre au point les différentes étapes du traitement d’un prélèvement sur papier-filtre de sang séché a été menée dans le laboratoire de biochimie et de biologie moléculaire du CHRU de Lille (Lille). Elle a porté sur une cohorte de 150 patients, âgés de 20 à 86 ans, hospitalisés dans le Service de Pneumologie du CHRU de Lille, pour lesquels un dosage et un phénotypage d’A1AT étaient demandés. Le prélèvement a été effectué par ponction veineuse au pli du coude et pour chaque patient, deux échantillons de sang, anonymisés, ont été recueillis en parallèle : l’un sans anticoagulant, destiné à la mesure de l’A1AT sérique et l’autre sur EDTA, destiné au dépôt sur papier-filtre.

Le laboratoire d’immunologie du centre de biologie sud du CHU de Lyon (Lyon) et le laboratoire de biochimie de l’Hôpital européen Georges Pompidou (HEGP) – APHP (Paris) se sont appuyés sur les résultats de cette étude préliminaire pour adapter à leurs laboratoires respectifs les protocoles d’extraction, quantification et phénotypage définis par Lille. Une étude comparative a pu ainsi être lancée et a reposé sur une analyse de 90 échantillons de sang anonymisés, prélevés sur EDTA, destinés à l’exploration du déficit en A1AT, réalisée dans les laboratoires de Lille, Lyon et Paris. Aucun prélèvement supplémentaire n’a été effectué spécialement pour réaliser cette étude.

Préparation des échantillons

Ainsi, 30 μL de sang recueilli sur EDTA ont été déposés sur papier Whatman 903® (GE Healthcare, Vélizy-Villacoublay, France), au centre de cercles prédéfinis de 9 mm de diamètre. Les papiers filtres ont été ensuite laissés une nuit à température ambiante pour séchage.

Au sein de la cohorte de Lille, 6 patients, ayant signé un consentement éclairé pour l’analyse du gène SERPINA1, ont bénéficié d’un génotypage. Celui-ci a été réalisé en parallèle après extraction d’ADN à partir du sang total prélevé sur EDTA et à partir du même échantillon de sang déposé sur papier-filtre.

Extraction de l’A1AT du sang séché sur papier-filtre

Pour le dosage de l’A1AT, un disque de 4 mm de diamètre a été découpé à l’aide d’un emporte-pièce, au centre du cercle formé par le dépôt et introduit dans un microtube en polypropylène de 1,5 mL.

De façon globale, l’élution a été réalisée par agitation mécanique pendant 15 secondes après addition d’un volume variable d’eau distillée, selon les sites. L’éluat a été ensuite laissé une nuit à + 4 °C. Après centrifugation pendant 5 min à 4 000 G, le surnageant a été recueilli prêt à être dosé en A1AT. Le volume de l’éluant a été adapté aux caractéristiques techniques des automates utilisés et en conséquence le volume adopté a été de 266 μL à Lille, de 200 μL à Paris et enfin de 150 μL à Lyon.

De la même manière, pour la réalisation du phénotypage, un disque de 4 mm de diamètre a été découpé et introduit dans un microtube de 1,5 mL pour élution par 90 μL d’éluant si la concentration sérique en A1AT était > 1 g/L ou par 60 μL d’éluant si celle-ci était ≤ 1 g/L. Après agitation mécanique pendant 15 secondes, l’éluat a été laissé 4 h à + 4 °C puis centrifugé et le surnageant a été recueilli pour la réalisation du phénotypage. Le choix de l’éluant et les modalités d’extraction de l’A1AT ont été basés sur les résultats de travaux publiés par différentes équipes [15, 16]. Ainsi, plusieurs agents d’élution ont été testés afin d’optimiser la qualité de l’éluat en vue du phénotypage sur ce type de prélèvement : eau distillée seule, tampon glycine 1 M, pH 7,40 contenant 0,5 M de dithiotreïtol (DTT) comme agent réducteur ou tampon glycine 1 M, pH 7,40 avec ajout extemporané de DTT, à raison de 3 μL de DTT 0,5 M pour 9 μL d’éluat, avant réalisation du phénotypage.

Pour la réalisation du génotypage, trois disques de 4 mm de diamètre ont été découpés et l’ADN leucocytaire a été extrait sur l’automate d’extraction EZ1® (Qiagen SA, Les Ulis, France) selon le protocole « DNA dried blood », à l’aide de la trousse “ EZ1 DNA Tissue Kit”, d’après les recommandations du fournisseur. L’ADN extrait a été élué dans un volume final de 50 μL. En parallèle, une extraction à partir de 350 μL de sang prélevé sur EDTA a été réalisée sur le même automate avec le protocole « DNA Blood » et le kit correspondant “EZ1 DNA Blood Kit”, l’ADN extrait étant élué dans un volume final de 100 μL.

Dosage de l’A1AT

À Lille, le dosage de l’A1AT par immunoturbidimétrie a été réalisé, à l’aide d’un kit commercial, (Konelab α1 antitrypsin, Thermo Scientific, Cergy Pontoise, France) utilisant des anticorps polyclonaux spécifiques et automatisé sur analyseur multiparamétrique Konelab 60 (Thermo Scientific, Cergy Pontoise, France), selon les recommandations du fournisseur. Dans les conditions classiques utilisées pour le dosage immunoturbidimétrique de l’A1AT sérique, la zone de mesure se situe entre 0,10 et 5,13 g/L. L’adaptation de cette technique aux échantillons de sang séché dans le cadre de l’étude préliminaire a nécessité une nouvelle calibration et a ainsi permis de définir une zone de mesure comprise entre 0,005 et 0,130 g/L. La concentration en A1AT dans l’éluat de sang séché a donc été calculée à partir de l’équation de la nouvelle droite de régression de calibration.

À Lyon, le dosage de l’A1AT a été réalisé sur néphélomètre BN ProSpec® (Siemens Healthcare Diagnostics Products 35041 Marburg, Germany) avec les réactifs (antisérum anti-A1AT, calibrateur, contrôles, tampon de réaction et diluant) du même fabricant. La courbe d’étalonnage a été obtenue par un étalonnage en 6 points en adaptant l’étalonnage pour sérum et plasma à la problématique du prélèvement sur papier-filtre où le plasma contenu dans l’éluat est déjà dilué : il en est résulté une dilution du calibrateur allant du 1/10e au 1/320e et la suppression de sa dilution au 1/5e. Pour un calibrateur où l’A1AT est à une concentration de 1,46 g/L, une courbe de calibration allant de 4,56 mg/L à 146 mg/L a donc été réalisée et les échantillons passés sans dilution.

À Paris, le dosage de l’A1AT a été réalisé en utilisant le kit et l’automate d’immunochimie Immage® et le Calibrateur 2-663940 (Beckman-Coulter – Fr 93420 Villepinte), par néphélométrie cinétique, après modification du facteur de dilution de l’échantillon. Pour les concentrations supérieures à 2,5 g/L, une dilution au ½ de l’échantillon a été pratiquée.

Tous les calibrateurs et contrôles fournis par l’ensemble des fabricants ont été standardisés par rapport à la préparation-étalon de référence ERM-DA 470k/IFCC (anciennement dénommée CRM 470).

Quelle que soit la méthode de dosage (turbidimétrique ou néphélométrique), la conversion de la concentration brute en A1AT du disque en son équivalent plasmatique fait intervenir le volume de sang complet contenu dans le disque de 4 mm de diamètre, le volume de plasma correspondant qui varie avec l’hématocrite et le volume d’élution. Dans la mesure où le recueil de sang capillaire sur papier-filtre ne permet pas la mesure de l’hématocrite, un hématocrite théorique de 45 % pour les hommes et 40 % pour les femmes a été utilisé. Le facteur de conversion dans les conditions définies plus haut a été respectivement pour les hommes et les femmes de 81,6 et 74,8 à Lille, de 45,68 et 41,87 à Lyon et enfin de 73,16 et 69,38 à Paris.

Chaque laboratoire a procédé à l’étude des caractéristiques de sa propre technique à partir d’échantillons issus de la population étudiée. La limite de quantification (LQ) a été déterminée par dilutions croissantes d’un échantillon de concentration faible, chaque dilution ayant été dosée quatre fois. La répétabilité a été évaluée par au moins 10 dosages dans la même série d’un même échantillon et ce à plusieurs niveaux de concentrations (bas, moyen et élevé). La reproductibilité a été évaluée sur 20 échantillons issus de la population analysée et qui ont été dosés 2 fois dans des séries différentes. Afin de mettre en évidence les limites éventuelles d’une telle approche quantitative du dosage de l’A1AT circulante, notamment l’impact des éléments figurés et de l’hémoglobine du sang complet, mais aussi la stabilité dans le temps du sang séché, nous avons comparé le comportement de l’A1AT issue d’un même prélèvement mais déposée sous deux formes différentes, sang complet et sérum. Pour cela nous avons utilisé un échantillon de sang prélevé sur tube sec et sur tube EDTA provenant d’un même patient pour lequel un dosage et un phénotypage d’A1AT étaient requis. Après avoir quantifié l’A1AT sérique et nous être assurés de l’absence d’inflammation aiguë ou subaiguë en dosant la CRP, nous avons déposé 5 fois 30 μL du prélèvement sous forme de sérum et 10 fois sous forme du sang complet correspondant en respectant le protocole établi. Dans le même temps, afin de nous assurer de la stabilité des échantillons, nous avons effectué élution et quantification 24 h après le dépôt du prélèvement sur le papier-filtre, et 1 mois plus tard. Sur 15 autres échantillons différents de sang séché, un test de stabilité a été réalisé 8 mois (J8mois) après l’extraction et la quantification initiale (J0). Quant à une interférence de l’hémoglobine sur le dosage proprement dit, elle n’a pas été recherchée. En effet, la concentration d’hémoglobine libre dans les éluats oscille entre 3 et 6 g/L selon les volumes d’élution utilisés. Or les notices d’utilisation et les modes d’emploi des réactifs fournis par les trois fabricants stipulent que pour des concentrations d’hémoglobine libre ≤ 10 g/L, aucune interférence n’a été mise en évidence.

Phénotypage de l’A1AT

Dans les trois centres, la détermination du phénotype de l’A1AT a été effectuée par focalisation isoélectrique (IEF) sur gel d’agarose suivie d’une révélation spécifique faisant appel à un anticorps anti-A1AT [24], l’ensemble automate (Hydrasys® focusing), supports de migration et réactifs de révélation (Hydragel 18 AAT Isofocusing®) étant commercialisé par Sebia (Evry, France).

Les conditions opératoires définies pour les échantillons de sérum ont cependant dû être modifiées pour tenir compte de la dilution inhérente à l’extraction de l’A1AT. Un programme spécifique a donc été développé pour le traitement des éluats par le fabricant et installé sur l’automate Hydrasys® Focusing. Dans ce programme, le temps nécessaire au dépôt des échantillons, la durée de migration et de révélation ont été modifiés et un nouveau substrat chromogène (TTF1/TTF2) a été utilisé pour accroître la sensibilité de la révélation immunoenzymatique.

Une étude portant sur la stabilité phénotypique de l’A1AT dans le sang a également été réalisée par deux des trois laboratoires : l’un a passé à l’identique 18 échantillons conservés à température ambiante et à l’abri de la lumière 4 mois après le premier passage et l’autre 15 autres échantillons 8 mois après.

Génotypage

L’analyse génotypique est soumise à une réglementation très stricte (décret n° 2008-321 du 4 avril 2008) qui impose notamment la signature d’un consentement éclairé par tout patient (ou son représentant légal) acceptant de se soumettre à ce type d’examen et la réalisation de l’analyse dans un laboratoire autorisé, validée par des biologistes disposant d’un agrément spécifique.

L’analyse du gène SERPINA1 a été effectuée par séquençage des exons codants du gène (exons II à V) et des jonctions introniques flanquantes, selon les conditions expérimentales décrites précédemment [25]. Les différents fragments ont été amplifiés par PCR, purifiés puis séquencés sur les deux brins de l’ADN selon la méthode de Sanger sur séquenceur automatique Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems, Villebon-sur-Yvette, France). Les séquences ont ensuite été comparées à la séquence de référence du gène SERPINA1 (NM_000295) pour caractérisation des variations de séquence à l’aide du logiciel SeqScape® Software (Applied Biosystems, Villebon-sur-Yvette, France). L’interrogation des bases de données permet de déterminer si les variants identifiés ont déjà été caractérisés et s’ils sont considérés comme déficitaires ou non.

Étude statistique

Elle a fait appel aux logiciels Statview® et Excel®et les résultats ont été exprimés sous forme de moyenne ± écart type. Elle a comporté l’étude de la corrélation intra-laboratoire observée entre la concentration en A1AT de l’éluat vs la concentration sérique ou plasmatique correspondante. Toujours en intra-laboratoire, a été étudiée la corrélation existante entre la concentration en A1AT de l’éluat transformée en son équivalent plasmatique ou sérique par le facteur de conversion prenant en compte l’hématocrite théorique vs la concentration sérique ou plasmatique correspondante. L’illustration de cette comparaison intra-laboratoire s’est également appuyée sur les diagrammes de Bland-Altman [26]. La comparaison inter-laboratoires des différents résultats a été réalisée selon le même schéma : corrélation et diagramme de Bland-Altman.

Résultats

Dosage de l’A1AT dans les éluats

Quelle que soit la méthode (turbidimétrie et néphélométrie) et la technique (immunonéphélométrie en temps fixé et immunonéphélométrie cinétique), les résultats portant sur la précision n’ont pas différé significativement entre les laboratoires. Nous rapportons, à titre d’exemple, dans le tableau 1, les résultats de répétabilité obtenus par immunoturbidimétrie. Toutes techniques et méthodes confondues, le coefficient de variation totale est < 10 %.

De même, les limites de détection et de quantification ayant été similaires pour les trois automates, nous rapportons ici un résultat global avec 1 mg/L pour la limite de détection et 4,5 mg/L pour la limite de quantification.

Concernant le rôle potentiel sur la mesure de la concentration en A1AT des constituants du sang complet autres que le sérum, soit donc éléments figurés et hémoglobine, il est apparu que le diamètre de diffusion des deux types de prélèvement étaient différents, les 30 μL de plasma diffusant selon un disque de 13 mm de diamètre en moyenne et les 30 μL de sang complet diffusant selon un disque de 9 mm de diamètre. La viscosité du sang complet, supérieure à celle du sérum correspondant est à l’origine d’une moindre diffusion. Quant à la stabilité de la concentration en A1AT au cours du temps, l’étude effectuée 1 mois plus tard sur le même prélèvement de sang séché déposé 10 fois et conservé à température ambiante et à l’abri de la lumière n’a pas montré d’évolution significative de cette concentration avec une moyenne et un écart type à J30jours de 0,0169 ± 0,00111 g/L vs 0,0163 ± 0,00106 g/L à J0 et un CV égal à 6,6 % dans les deux cas. Pour les 15 échantillons différents testés à J0 et J8 mois nous avons observé entre les deux groupes de mesures un coefficient de corrélation r de 0,96 < 0,987 < 0,996 et une équation de la droite de régression suivante :

Y J8 mois=1,134×J00,1154

L’étude initiale de faisabilité menée à Lille a porté sur 105 prélèvements issus de 105 patients pour lesquels ont été dosées parallèlement l’A1AT sérique et l’A1AT contenue dans le sang séché déposé sur papier-filtre. La figure 1A représente la droite de régression illustrant la corrélation existant entre les 105 couples d’échantillons analysés : Y = 0,984 * X + 0,035. Le coefficient de détermination R2 de 0,902 objective un haut niveau de corrélation puisque le comportement de plus de 90 % de l’ensemble des échantillons est décrit par la droite de régression. Si le niveau de concentration des échantillons est pris en compte, 49 d’entre eux ayant une concentration en A1AT < 1,5 g/L, l’intensité de la corrélation s’accroît, le nouveau coefficient de détermination R2 s’élevant à 0,931 vs 0,758 pour les 56 échantillons à concentration > 1,5 g/L. Dans la figure 1B est représenté le diagramme de Bland-Altman qui illustre le fait que les différences observées entre les mesures augmentent avec l’augmentation des concentrations : jusqu’à 1,5 g/L, les concentrations mesurées dans le papier-filtre et converties en leur équivalent sérique ne diffèrent pas de plus d’un écart type des concentrations sériques correspondantes. Dans ce cas, la concordance entre les deux méthodes est de 100 %. Entre 1,5 g/L et 2 g/L les concentrations ne différent pas de plus de 2 écarts types et la concordance est toujours de 100 %. En revanche, à partir de 2 g/L, on voit apparaître 6 points sur 27 qui sont en dehors de l’intervalle défini par la moyenne ± 2 ET soit une concordance qui n’est plus que de 77,7 %.

Ces résultats préliminaires satisfaisants ont permis aux deux autres laboratoires d’adapter cette méthode de quantification de l’A1AT à partir de prélèvements effectués sur papier-filtre.

Avant de procéder aux comparaisons inter-laboratoires, il a été nécessaire d’analyser les résultats obtenus au sein de chaque laboratoire en comparant d’abord les concentrations d’A1AT mesurées dans les éluats à celles observées dans les plasmas ou sérums correspondants. À Lyon,la droite de régression s’écrit Y(A1AT brute) papier-filtre = 0,0188X[A1AT) plasma + 0,0007 avec un coefficient de détermination R2 correspondant de 0,941. Pour une concentration plasmatique de 1 g/L en A1AT, la concentration brute mesurée dans le papier-filtre est de 0,0195 g/L. À Lille et à Paris, les droites de régression et les coefficients de détermination s’écrivent respectivement Y(A1AT brute) papier-filtre = 0,0152X(A1AT) plasma + 0,0001 (R2 = 0,932) et Y(A1AT brute) papier-filtre = 0,035X(A1AT) plasma + 0,0009 (R2 = 0,908) pour Lille et Paris avec, pour une concentration plasmatique de 1 g/L, des concentrations brutes respectivement de 0,0153 et 0,0144 g/L.

Après transformation de la concentration brute en A1AT de l’éluat en son équivalent plasmatique par le facteur de conversion prenant en compte un hématocrite théorique comme explicité précédemment, nous l’avons comparé au sein de chaque laboratoire à la concentration du plasma correspondant. Les résultats sont rapportés dans la figure 2 où sont représentés les droites de régression et les diagrammes de Bland-Altman obtenus. Pour ce qui est de Lyon, la droite de régression devient Y(A1AT convertie)papier-filtre = 0,8487X (A1AT)plasma + 0,0374 et le coefficient de détermination R2 diminue légèrement à 0,9164. Le diagramme de Bland-Altman correspondant illustre la sous-estimation observée entre la concentration mesurée dans le papier-filtre et la concentration plasmatique correspondante : pour une concentration plasmatique de 1 g/L en A1AT, la concentration convertie mesurée dans le papier-filtre est de 0,886 g/L. Par ailleurs, ce diagramme montre que seuls 3 points ne sont pas compris dans l’intervalle défini par la moyenne des différences ± 2 ET, soit une concordance de 96,7 %. Ces 3 points s’observent pour une concentration plasmatique > 2,5 g/L.

À Lille, la droite de régression s’écrit Y (A1AT convertie) papier-filtre = 1,1874 X(A1AT) plasma + 0,0067 et le coefficient de détermination s’élève à 0,918. Pour une concentration plasmatique en A1AT de 1 g/L la concentration de l’A1AT mesurée dans le disque de papier-filtre est convertie à 1,19 g/L. Cette surestimation apparaît manifeste sur le diagramme de Bland-Altman qui montre par ailleurs que 2/90 points sont en dehors de l’intervalle précédemment défini soit une concordance de 97,8 %.

À Paris, la droite de régression s’écrit Y (A1AT convertie) papier-filtre = 0,9622 X(A1AT) plasma + 0,0858avec un coefficient de détermination de 0,897. Donc ici pour une concentration plasmatique de 1 g/L, la concentration mesurée dans le disque de papier-filtre sera de 1,04 g/L. Dans ce cas de figure, contrairement aux deux autres centres, aucun biais n’est noté, ce qui est bien illustré par le diagramme de Bland-Altman où on observe une répartition homogène des points de part et d’autre de l’abscisse zéro et 4 points en dehors de l’intervalle précédemment défini soit une concordance de 95,6 %.

Bien que ces résultats fussent satisfaisants nous nous sommes interrogés sur la pertinence d’utiliser un facteur de conversion faisant intervenir un hématocrite théorique variable selon le sexe. En effet, notre but étant d’homogénéiser nos résultats et de faire en sorte que la concentration en A1AT d’un échantillon soit indépendante du lieu de mesure, nous avons jugé préférable d’utiliser un seul facteur déterminé par le rapport existant entre la moyenne des concentrations mesurées dans les plasmas identiques pour tous les sites (1,4145 g/L) et la moyenne des concentrations d’A1AT mesurées dans le disque de papier-filtre est de 0,02730 g/L à Lyon, de 0,02159 g/L à Lille et de 0,02004 g/L à Paris. Ce rapport a donc été de 65,5 pour Lille, de 51,8 pour Lyon et de 70,6 pour Paris. Comme le montre la figure 3 les droites de régression s’écrivent pour Lyon Y = 0,9734X + 0,0376 avec R2 égale à 0,9414, pour Lille Y = 0,9933X + 0,0095 avec R2 égale à 0,9315, et Paris Y = 0,9545X + 0,0648 avec R2 à 0,9081. Elles sont très proches de la droite Y = X et s’associent à un coefficient de détermination légèrement augmenté passant de 0,9164 à 0,9332 à Lyon, de 0,9181 à 0,9315 à Lille et de 0,8967 à 0,9081 à Paris.

Quant aux diagrammes de Bland-Altman, ils objectivent une répartition homogène des points de part et d’autre de X = 0, une absence de biais au sein de chaque laboratoire et dans tous les cas une concordance intra-laboratoire supérieure à 95 %.

De cette comparaison, il ressort que les deux méthodes de quantification de l’A1AT, ie sang séché sur papier-filtre vs sérum ou plasma sont non seulement hautement corrélées avec un coefficient de détermination R2 supérieur à 0,9 dans tous les cas mais aussi concordantes au sein de chaque laboratoire (concordance > 95 %).

Nous avons ensuite procédé à une comparaison inter-laboratoires dont n’est rapportée ici que celle concernant la comparaison entre la concentration de l’éluat transformée en son équivalent plasmatique par le facteur déterminé à partir des concentrations et celle du plasma correspondant. Les résultats sont rapportés dans la figure 4 où sont représentées les droites de régression obtenues pour chaque laboratoire où elles apparaissent pratiquement confondues.

Pour une concentration sérique de 1 g/L, on obtient une concentration de 1,00 g/L à Lille, de 1,01 g/L à Lyon et de 1,02 g/L à Paris. Pour une concentration sérique de 0,5 g/L, l’équivalent à Lyon serait de 0,521 g/L, de 0,506 g/L à Lille et de 0,542 g/L à Paris.

Phénotypage de l’A1AT dans les éluats

La technique d’IEF sur gel d’agarose utilisée permet l’identification des variants d’A1AT les plus courants comme le variant PI M et les variants déficitaires les plus fréquents PI S et PI Z mais aussi de nombreux variants plus rares, comme décrit précédemment [24]. Dans ce système d’IEF, chaque variant protéique de l’A1AT se caractérise par cinq isoglycoformes représentées par deux bandes majeures (4 et 6) et trois bandes mineures (2, 7 et 8) (figure 5) se répartissant dans un gradient de pH compris entre 4,2 et 4,9. L’utilisation de sérums-témoins d’A1AT présents dans le kit commercialisé par Sebia facilite l’interprétation des résultats.

L’élution des échantillons de sang séché par le volume requis d’eau distillée, comme défini plus haut, donne lieu à l’obtention de profils phénotypiques non seulement décalés vers l’anode comparativement à ceux observés pour les sérums-témoins (figure 5A), mais aussi présentant des bandes supplémentaires traduisant divers degrés d’oxydation de la protéine gênant l’interprétation.

Le protocole a donc été modifié en tenant compte des données de la littérature [15]. Ainsi, dans un premier temps, un tampon glycine 1 M, pH 7,40, contenant 0,5 M de DTT comme agent réducteur a été utilisé pour l’élution, ce qui a permis d’obtenir des profils de migration comparables à ceux des sérums-témoins (figure 5B).

Cependant, en raison du manque de stabilité du DTT en solution, son ajout a été effectué après élution par le tampon glycine 1 M, pH 7,40, juste au moment du dépôt sur le gel d’agarose destiné à l’IEF. Des profils phénotypiques parfaitement superposables à ceux des sérums-témoins ont été obtenus dans ces conditions (figure 5C).

Les phénotypes testés ont été les suivants : PI M (n = 41) ; PI MZ (n = 11) ; PI Z (n = 9) ; PI MS (n = 18) ; PI S (n = 2) ; PI SZ (n = 3) ; variants rares (n = 6).

Tous ont été reconnus et il y a eu 100 % de concordance entre les interprétations. Une étude de la stabilité phénotypique a été effectuée par deux des trois laboratoires qui ont passé à l’identique 18 échantillons pour l’un et 15 pour l’autre, tous conservés à température ambiante et à l’abri de la lumière 4 mois après le premier passage : aucune différence n’a été perceptible (résultats non montrés).

Génotypage

L’analyse des séquences obtenues à partir de sang total et de sang séché a montré des profils parfaitement superposables. Sur les 6 échantillons analysés, deux d’entre eux sont présentés sur la figure 6. La figure 6A présente la mutation ponctuelle hétérozygote A>T au nucléotide 791 (double pic), caractérisant l’allèle S (c.791A>T ; p.Glu264Val). Le profil correspond à un génotype hétérozygote M1S. La figure 6B présente une délétion de 3 nucléotides sous forme hétérozygote (c.154_156del ; p.Phe52del), entrainant l’apparition d’une double population à partir de la première base mutée. Cette délétion est caractéristique du génotype Mmalton et le profil obtenu correspond à un génotype hétérozygote M1Mmalton.

Discussion

Le but de ce travail a été de jeter les bases techniques propices à un dépistage du déficit en A1AT à partir de prélèvements effectués sur papier-filtre. Il s’est donc agi pour trois laboratoires familiarisés de longue date avec la problématique du dépistage du déficit en A1AT sur sérum d’adapter et mettre en place, à partir des données de la littérature et de leur expérience propre, les techniques nécessaires au dépistage de ce déficit sur des prélèvements de sang complet déposés sur du papier-filtre.

Le dosage de l’A1AT circulante étant une étape fondamentale dans la recherche de son déficit, il était important de s’assurer non seulement d’une bonne corrélation entre les résultats obtenus au sein de chaque laboratoire sur les mêmes prélèvements avec des automates différents et des modalités d’élution différente, mais aussi de leur parfaite concordance : en effet, afin de concilier la sensibilité de la technique et le volume mort propre à chaque automate, chaque laboratoire a utilisé un volume d’élution différent, 266 μL à Lille, 200 μL à Paris et 150 μL à Lyon. Ces différences de volume sont à l’origine des valeurs différentes des facteurs utilisés pour passer de la concentration en A1AT du disque de papier-filtre de 4 mm de diamètre à celle du plasma correspondant : c’est ainsi que le facteur initial de transformation que nous avons utilisé faisait appel à un hématocrite théorique de 45 % pour les hommes et 40 % pour les femmes. Notre but initial étant d’atteindre une quasi-identité de résultats dans les mesures des concentrations d’A1AT d’un même échantillon, nous avons jugé préférable d’adopter un facteur prenant en compte l’ensemble des paramètres susceptibles d’intervenir dans la détermination de la concentration en A1AT contenue dans le disque de papier-filtre : variabilité au niveau des 30 μL de dépôt, variabilité dans la localisation du découpage du prélèvement et le découpage lui-même, variation dans le volume d’élution, variation de l’hématocrite et variation inhérente à la méthode de mesure. Nous avons pris comme facteur de conversion de l’A1AT mesurée dans le disque en son équivalent sérique le rapport entre la moyenne des concentrations plasmatiques observées dans les 90 échantillons analysés et la moyenne des concentrations brutes mesurées dans les disques de papier-filtre. Ce facteur évidemment variable selon les laboratoires puisque rassemblant toutes les variables interférant, nous a permis de gommer les différences inter-laboratoires et d’avoir une valeur seuil cible de 1 g/L correspondant à 1,02 g/L à Paris et 1,01 g/L à Lyon et 1 g/L à Lille, ce seuil permettant de détecter 100 % des PI Z, 97 % des PI SZ et 70 % des PI MZ [27].

Les plus grandes différences observées, que ce soit au sein d’un même laboratoire ou entre les laboratoires l’ont systématiquement été pour des concentrations ≥ 2,5 g/L et pour un nombre faible d’échantillons, ce qui n’a aucune incidence sur l’aptitude du test à déceler les concentrations ≤ 1 g/L, donc de détecter les sujets présentant un déficit sévère en A1AT.

Afin de pérenniser l’homogénéité des mesures entre les trois laboratoires, un contrôle externe de qualité devrait être mis en place. À partir d’une même poche de sang certifiée et anonymisée provenant d’un donneur de l’Établissement français du sang, deux niveaux de contrôles devraient être préparés (l’un proche de 1,00 g/L et l’autre de 0,50 g/L après dilution dans une solution de NaCl 0,154 M) suivant le protocole décrit dans le paragraphe Matériel et Méthodes. Les disques séchés seraient stockés dans chaque laboratoire à l’abri de l’air et de la lumière sur une durée de six mois, les tests de stabilité ayant été concluants pour des périodes allant de 1 à 8 mois. Un disque de chaque niveau pourrait ainsi être inclus dans chaque série de dosage.

Nous avons également confronté aux données de la littérature les résultats de chaque laboratoire, et notamment le niveau de corrélation entre la concentration brute d’A1AT de l’éluat et celle du plasma/sérum correspondant : comme ce que nous avons observé et quelles que soient les études concernées et les techniques utilisées, les coefficients de détermination (R2) sont tous voisins de 0,90 : 0,87 pour Costa et al.[20] qui utilisent l’immunonéphélométrie cinétique sur Immage*et 0,91 pour Gorrini et al.[21] pour des concentrations d’A1AT contenue dans le disque de papier-filtre transformées en équivalent sérum comprises entre 0,54 et 3,16 g/L, la technique utilisée ici étant encore l’immunonéphélométie cinétique mais sur APS© (Array protein system Beckman). Cependant, un travail récemment publié [28] visant à valider le dépistage du déficit en A1AT à partir de prélèvements de sang déposés sur papier-filtre et reposant sur l’immunonéphélométrie en temps fixé, annonce une corrélation étonnamment faible entre la concentration mesurée dans le papier-filtre et celle du sérum correspondant, r étant de 0,45. Ils font également état d’une faible reproductibilité dans la détermination de la concentration en A1AT de l’éluat (r = 0,52) qu’ils imputent à la turbidité des éluats, le niveau de corrélation s’améliorant (r = 0,84) après élimination des échantillons concernés.

La diffusion moindre du sérum au sein du papier-filtre comparativement au sang complet met en relief le rôle important joué par la viscosité dans cette diffusion : toute augmentation de viscosité par hémoconcentration, maladie de Vaquez, gammapathie monoclonale à forte concentration (IgM surtout) sera susceptible de diminuer la diffusion et par suite de majorer la concentration mesurée. Inversement, tout facteur minorant la viscosité (anémie, hémodilution) sera susceptible de minorer la concentration en A1AT mesurée dans le papier-filtre par augmentation de la diffusion. Il est possible que l’étude mentionnée précédemment faisant état d’un coefficient de corrélation de 0,45 entre la concentration d’A1AT dans le papier-filtre et celle du sérum soit imputable au moins partiellement à des phénomènes de cet ordre, aucune donnée relative au statut hydro-électrolytique et hématologique des patients inclus n’étant mentionnée. Ce seront des éléments à prendre en compte lors de l’interprétation de résultats discordants : concentration basse en A1AT associée à un phénotype usuel et à un génotype usuel et inversement concentration anormalement élevée (mais toujours inférieure au seuil de 1 g/L) associée à un phénotype déficitaire, SZ par exemple.

Sur le plan des techniques mises en œuvre pour le dosage de l’A1AT contenue dans un éluat, la plupart des travaux publiés au cours des 10 dernières années reposent sur l’immunonéphélométrie cinétique [20, 21] et en temps fixé [19]. Ce travail est donc le premier à s’être également appuyé sur l’immunoturbidimétrie avec des résultats hautement corrélés à l’immunonéphélométrie. Comme montré ici, il n’y a donc aucun obstacle technique opposable à la pratique d’un prélèvement de sang capillaire déposé sur papier-filtre pour le dépistage quantitatif d’un déficit en A1AT.

Concernant le phénotypage de l’A1AT à partir de sang complet déposé sur papier-filtre, ce travail est le premier à faire appel à une technique standardisée et semi-automatisée ne requérant qu’une expertise dans l’interprétation des résultats des phénotypes d’A1AT. Les principaux obstacles s’opposant à une mise en œuvre facile du phénotypage de l’A1AT sur des prélèvements de sang séché sur papier-filtre sont de deux ordres : le premier est dû à une modification de la mobilité et du nombre de bandes d’A1AT dans un plasma/sérum hémolysé par suite d’une oxydation plus ou moins importante de ces bandes sous l’influence de l’hémoglobine. La présence de cette dernière modifie le point isoélectrique des bandes d’A1AT dont la répartition ne sera plus conforme à la répartition initiale. L’introduction d’un réducteur extemporanément et concomitamment au dépôt de l’éluat sur le gel permet de restaurer un profil de répartition des bandes tel qu’il aurait été dans un prélèvement conventionnel. Le deuxième obstacle est lié à la faible concentration d’A1AT dans les éluats, faible concentration qui nécessite avec la méthode conventionnelle de recourir à des techniques plus complexes de coloration, coloration à l’argent notamment. L’augmentation de la sensibilité du procédé de coloration mis au point par le fabricant associée à la réduction extemporanée de l’A1AT oxydée contenue dans les éluats nous a permis de simplifier considérablement la technique de phénotypage de l’A1AT dans les prélèvements de sang séché sur papier-filtre, contrairement aux allégations de Greene et al.[29] qui concluent dans leur travail que l’utilisation de sang complet pour le phénotypage de l’A1AT reste d’un usage problématique. On peut d’ailleurs s’étonner que cette équipe n’ait pas pris en compte cette oxydation des bandes d’A1AT.

Comme on l’a vu, l’hémoglobine, obstacle initial au développement des techniques de dosage de l’A1AT contenue dans des prélèvements de sang séché sur papier-filtre, est restée un facteur limitant son phénotypage jusqu’à l’adoption d’une technique de réduction. Tous les obstacles entravant l’utilisation du papier-filtre pour son dosage et son phénotypage ont été levés. Concernant le génotypage, il en a été de même, les premiers essais ayant été confrontés à la faible pureté de l’ADN contenu dans le sang séché et à la présence des inhibiteurs naturels de la PCR que l’on peut y trouver [20].

C’est pourquoi, la technique d’extraction d’ADN à partir de sang recueilli sur papier-filtre, utilisée dans ce travail, a fait appel à un protocole d’extraction spécifique préconisé pour les tissus et les échantillons de sang séché (DNA Dried Tissue kit), comme décrit dans le paragraphe Matériel et méthodes. Ce protocole permet d’optimiser le rendement d’extraction de façon à obtenir des concentrations en ADN équivalentes à celles obtenues sur sang total et d’améliorer très significativement la pureté de l’ADN extrait. Les conditions de PCR utilisées selon les recommandations du fournisseur pour ce type d’échantillon ont permis de s’affranchir des risques d’interférence par des contaminants éventuels.

L’identification précise du génotype d’A1AT est permise par séquençage du gène SERPINA1, en général limitée aux quatre exons codants (II à V) et à leurs jonctions introniques flanquantes, comme décrit [25]. Notre travail montre une parfaite concordance entre les profils de séquence obtenus pour les échantillons de sang total et ceux obtenus pour les échantillons de sang séché, avec des valeurs de qualité du séquençage équivalentes. Dans la démarche biologique généralement préconisée, le génotypage de l’A1AT par PCR-séquence intervient en dernière intention. En effet, les variants courants d’A1AT PIM, les variants déficitaires les plus fréquents PIS et PIZ, de même que certains variants plus rares (PIF, PII, PIP) peuvent être caractérisés par phénotypage comme précédemment décrit [24]. Néanmoins, devant certains profils phénotypiques d’interprétation délicate voire parfois ininterprétables, le génotypage par PCR-séquence s’avère nécessaire. De la même manière, certaines circonstances particulières justifient le recours au génotypage. Ainsi, devant un profil phénotypique PIZ associé à une concentration circulante en A1AT très faible (≤ 0,15 g/L), l’association d’un allèle PINul à un allèle PIZ n’est pas à exclure et il est judicieux de compléter l’investigation phénotypique par un génotypage, comme recommandé dans la littérature [30]. De même, un profil phénotypique PIM associé à une concentration circulante en A1AT significativement diminuée laisse envisager la présence d’un allèle PIM déficitaire, notamment l’allèle PIMmalton, PIMduarte, PIMprocida, PIMheerlen, ou d’un allèle PINul associé à un allèle PIM courant, ceux-ci ne pouvant être identifiés que par séquençage du gène SERPINA1.

Le recours au génotypage se justifie donc pour la résolution de cas complexes, notamment, pour toute concentration inférieure à celle attendue pour un phénotype donné.

Conclusion

Tous les travaux portant sur le déficit en A1AT s’accordent sur la nécessité d’un dépistage précoce mais comme l’illustre une étude française récente [31], un simple dosage d’A1AT sérique n’est prescrit à titre systématique que dans 5 % des cas de BPCO et 30 % des cas d’emphysème. Il nous est donc apparu que la mise à disposition des pneumologues d’un coffret contenant tout le matériel nécessaire à un prélèvement sur papier-filtre permettrait la généralisation du dépistage à la population plus particulièrement concernée par cette entité génétique. À partir d’un même envoi, l’un des trois laboratoires récipiendaires pourra doser, phénotyper et génotyper, si nécessaire, l’A1AT d’un patient donné. De nombreuses campagnes de dépistage sont actuellement lancées dans le monde occidental. Grâce à l’existence de ce coffret et de la standardisation que nous avons réalisée au sein de chacun de nos trois laboratoires, des techniques applicables au dépistage du déficit en A1AT et de l’ordre séquentiel dans lequel elles seront mises en œuvre, une nouvelle page de l’histoire française du déficit en A1AT va pouvoir s’écrire.

Liens d’intérêts

M. Balduyck : LFB Biomédicaments (conférencier au congrès CPLF, Marseille, 2014 ; auditeur au congrès de l’ERS, Munich, 2014) ; C. Chapuis Cellier : LFB (congrès CPLF, Marseille, 2014) ; D. Roche (auditeur, congrès CPLF, Marseille, 2014) ; A. Vergne : employée Sebia ; G. Nouadje : employé Sebia, activités de conseil.

Remerciements

LFB, soutien financier : pour la mise au point de ce test diagnostique, les trois laboratoires engagés dans cette collaboration ont bénéficié d’un soutien financier par le LFB Biomédicaments (Les Ulis, Courtaboeuf, France) sous forme d’une Convention de parrainage.

Techniciens : nous remercions Mesdames Thérèse Duhem, Nadine Houriez, Catherine Lelorne et Evelyne Crème, techniciennes du Laboratoire de biochimie biologie moléculaire, du CHRU de Lille, pour leur investissement et leur aide technique dans la mise au point de ce test.

Nous remercions Mesdames Dominique Morel, Joëlle Roche et Nadège Serres du Centre de biologie Sud du CHU de Lyon pour leur participation à ce travail.

Nous remercions Madame Pamila Urban du Laboratoire de biochimie, Assistance Publique- Hôpitaux de Paris, Hôpital européen Georges Pompidou, Paris, pour sa participation à ce travail.