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Évaluation de l’analyseur d’hématologie Beckman Coulter ® LH 750 TM : performances analytique


Annales de Biologie Clinique. Volume 61, Number 5, 576-84, Septembre 2003, Pratique quotidienne


Résumé   Summary  

Author(s) : I. Amouroux, M. Balay, A. Marfaing-Koka , Service d’hématologie biologique, Hôpital Antoine Béclère, 157, rue de la Porte-de-Trivaux, 92140 Clamart .

Summary : We evaluated the new analyzer Beckman Coulter, an instrument dedicated to the cell blood count (CBC) and to the white blood cell (WBC) differential (including nucleated red blood cells (NRBCs)) over a global one month period, with three purposes: 1) evaluation of the analytical performance (precision, reproducibility, contamination, linearity); 2) accuracy of numerical results, by comparison to the laboratory instrument (CBC and WBC diff) or to the blood smear (NRBCs, low platelets); 3) evaluation, in terms of sensitivity and specificity, a set of abnormality messages built from the suspect flags and a few quantitative abnormalities. The analytical performances were found satisfactory. The WBC and platelet ranges of linearity were wider than in the GEN.S, as stated in the system specifications. However, the lack of adequate biological material made impossible the study of the whole mentionned linearity range. The accuracy of the CBC and differential parameters, as well as of reticulocytes, was studied with the Coulter GEN.S as reference instrument. The coefficients of correlation and the regression lines showed that the LH 750 results were similar to the GEN.S results. Furthermore, samples with thrombocytopenia and circulating NRBCs were evaluated and compared to the result obtained with microscopic lecture. The results showed a good relationship between platelets results given by the GEN.S and manual count leading to appropriate decision of transfusion. The correlation between GEN.S and manual count of NRBC was estimated as satisfactory. We used the LH 750 software to create conditional rules on the basis of qualitative and quantitative criteria, in order to define and enter a message system for detection of abnormalities. Our study showed that such a system flagged 95.7% of morphological abnormalities with a rate of unnecessary slide review (absence of any morphological abnormality on the blood smear) estimated at 8.3%. Furthermore, in 86% of the abnormalities studied, the relevant message was triggered. The Beckman Coulter LH 750 thus appeared as suitable in terms of validation efficiency.

Keywords : Coulter LH 750, evaluation, blood cell count, white blood cell differential count

ARTICLE

Auteur(s) : I. Amouroux, M. Balay, A. Marfaing-Koka

Service d’hématologie biologique, Hôpital Antoine Béclère, 157, rue de la Porte-de-Trivaux, 92140 Clamart

Article reçu le 26 novembre 2002, accepté le 12 février 2003

Nous avons évalué le nouvel automate Coulter LH 750TM dans notre laboratoire pendant une durée totale d’un mois. Cette évaluation a porté sur les performances analytiques de l’instrument (répétabilité intra-série, stabilité, contamination, linéarité) pour les paramètres mesurés, la corrélation des résultats numériques, par comparaison avec l’instrument du laboratoire (Coulter GEN.S) ou avec les résultats obtenus par examen au microscope (érythroblastes, thrombopénie) et l’évaluation, en termes de sensibilité et de spécificité, d’un panel de messages d’anomalies construit à partir des alarmes système de l’instrument et de certaines anomalies quantitatives.
Nous avons porté une attention particulière aux points qui marquent une différence par rapport aux instruments de génération précédente : linéarité étendue et fréquence réduite des alarmes d’interférence pour les paramètres leucocytes et plaquettes, pourcentage et numération des érythroblastes.

Matériel et méthodes

Description de l’instrument

Le Coulter LH 750 est un automate d’hématologie réalisant la numération globulaire complète, la formule sanguine et la numération des réticulocytes (pourcentage et valeur absolue). La numération et l’analyse volumétrique des leucocytes, des hématies et des plaquettes reposent sur la mesure de variation d’impédance. La formule leucocytaire est basée sur l’analyse tridimensionnelle des leucocytes, grâce à un module de cytométrie en flux associant : diffraction d’un faisceau de lumière laser (en corrélation avec la granularité du cytoplasme), volume de la cellule (mesuré par impédance) et opacité cellulaire (balayage de la cellule par radiofréquence émise par une sonde électromagnétique, donnant des informations sur la structure du noyau et le rapport nucléocytoplasmique). La reconnaissance des cinq populations cellulaires repose donc sur trois critères complémentaires. La numération des réticulocytes est réalisée par le même module formule après précipitation de l’ARN ribosomal par un dérivé du bleu de méthylène et sphérisation des cellules grâce à un réactif rendant l’hémoglobine optiquement neutre. Outre le pourcentage et la valeur absolue des réticulocytes, des indices de maturation et des indices volumétriques réticulocytaires sont délivrés. Ces indices, déjà présents sur le GEN.S, ont fait l’objet de publications [1, 2] évaluant leur intérêt clinique.
Le LH 750 présente plusieurs caractéristiques nouvelles qui améliorent les performances de l’automate :
– le logiciel d’analyse Accucount introduit une nouvelle analyse séquentielle du passage des éléments dans l’orifice de comptage (vitesse de passage, intervalle de temps entre deux cellules). Ces données permettent d’améliorer le comptage des cellules, en particulier pour les passages en coïncidence, et ceci se traduit par une augmentation de la plage de linéarité (leucocytes jusqu’à 400 × 109/L ; érythrocytes jusqu’à 8 × 1012/L ; plaquettes jusqu’à 3 000 × 109/L) ;
– la numération leucocytaire a été également rendue plus performante : la présence d’agrégats plaquettaires, de macroplaquettes et d’érythroblastes déclenche un processus d’analyse qui élimine les interférences et permet la délivrance d’un résultat corrigé directement exploitable. Il en résulte une diminution de l’incidence des alarmes d’interférence sur les leucocytes par rapport au Coulter GEN.S ;
– la numération plaquettaire, déterminée par variation d’impédance entre 2 et 20 fl avec extrapolation de la courbe de distribution jusqu’à 70 fl [3] est complétée par une analyse croisée des autres canaux d’analyse (distribution des hématies et histogramme des leucocytes). Cette innovation permet, par une modification des critères de déclenchement, de minimiser la fréquence du code R sur les plaquettes (résultat rendu sous réserve en raison de l’impossibilité par l’appareil de tracer une courbe extrapolée à partir de la distribution des histogrammes plaquettaires) ;
– le déclenchement des alarmes liées à la formule leucocytaire est amélioré : mise en place d’une nouvelle sonde électromagnétique, optimisation du logiciel d’analyse des trois critères de la formule ;
– la numération des érythroblastes est réalisée sur chaque bilan : elle repose sur une double analyse de la courbe de distribution des leucocytes et de l’histogramme biparamétrique généré par le canal formule. L’emploi d’un nouveau diluant lors de la numération des leucocytes permet de mieux individualiser la population des érythroblastes.

Échantillons

Les prélèvements provenaient à la fois des patients hospitalisés ou consultants de l’hôpital Antoine Béclère, et de deux centres d’hématologie-oncologique proches (Institut Gustave Roussy et hôpital Cochin) ce qui a permis d’accroître le nombre de cas pathologiques à étudier pour l’incidence et la sensibilité des alarmes. Parmi ces échantillons les pathologies suivantes ont été identifiées : 10 cas de syndromes lymphoprolifératifs (6 leucémies lymphoïdes chroniques et 4 lymphomes folliculaires en phase leucémique), 21 cas de leucémies aiguës myéloïdes (LAM) (2 LAM0/M1, 8 LAM1/M2, 2 LAM4 3 LAM5b, 4 LA biphénotypiques et 2 leucémies myélomonocytaires chroniques (LMMC) acutisées), 2 cas de leucémies aiguës lymphoïdes (LAL), 11 cas de sortie d’aplasie avec une myélémie de régénération, 2 cas de syndromes myéloprolifératifs non traités (leucémie myéloïde chronique (LMC)), un cas de LMMC stade 1, un cas de drépanocytose S homozygote et un cas d’elliptosphérocytose. On notait aussi 24 échantillons provenant de bébés de moins de 15 jours (23) et de moins d’un an (1). Le sang a été prélevé sur des tubes avec anticoagulant (K3-EDTA) avec un délai entre le prélèvement et le passage du tube n’excédant pas 5 heures. Les contrôles 5 C ES (Beckman Coulter) ont également été utilisés pour l’évaluation.

Répétabilité intra-série

Des échantillons de sang frais, à différents niveaux pour chaque paramètre, ont été passés cinq à douze fois sur l’instrument. Le calcul des moyennes et des coefficients de variation a été effectué pour chaque paramètre. Comme les volumes d’échantillons de sang frais ne permettaient pas un grand nombre de passages, nous avons complété l’étude en passant à 32 reprises sur l’automate des contrôles 5C ES normaux, hauts et bas. La moyenne et les coefficients de variation ont été également calculés à partir de ces mesures.

Reproductibilité

La stabilité sur une période de 24 heures a été étudiée sur dix échantillons en conservant les sangs à température ambiante ou à 5 °C. Les mêmes tubes de sang ont été passés à 0, 2 heures, 4 heures, 6 heures, 8 heures, 12 heures et 24 heures.

Contamination

La contamination a été étudiée pour les leucocytes, les hématies, l’hémoglobine, et les plaquettes en effectuant deux passages d’échantillons de valeurs hautes suivis immédiatement de trois passages de diluant. Le pourcentage de contamination a été calculé pour chaque paramètre au moyen d’un programme spécifique à l’appareil. La formule de calcul tient compte des valeurs du deuxième passage de sang (S2) ainsi que des valeurs du premier (D1) et troisième (D3) passage de diluant (contamination = [(D1-D3)/S2] × 100).

Linéarité

Des échantillons de patients ayant une valeur déjà haute pour le paramètre à étudier ont subi d’une part, une concentration (par extraction de plasma) et, d’autre part, des dilutions successives du 3/4, 1/2, 1/3, 1/4, 1/8 jusqu’au 1/32e. D’autres échantillons ont été utilisés pour élargir l’étude de linéarité dans les zones de valeurs basses de leucocytes et de plaquettes. La comparaison entre les valeurs obtenues et les valeurs attendues après dilution est appréciée par la corrélation entre ces valeurs et la pente de la droite de régression correspondante.

Corrélations avec le GEN.S

Cent cinquante échantillons ont été analysés de façon séquentielle sur le LH 750 puis sur le GEN.S. Pour l’étude des corrélations sur la formule, les échantillons choisis ne déclenchaient pas d’alarmes de suspicion leucocytaire (blastes, lymphocytes atypiques, granulocytes immatures) sur les deux instruments. L’analyse de régression a porté sur l’hémoglobine, les paramètres de la numération mesurés en impédance (leucocytes, hématies, VGM, IDC et plaquettes) ainsi que sur les paramètres mesurés en diffraction (pourcentages de neutrophiles, éosinophiles, lymphocytes, monocytes, et réticulocytes). Le pourcentage de basophiles n’a pas été étudié en raison de la faible étendue des valeurs rendant l’analyse de régression non significative. Quatorze échantillons présentant un chiffre de plaquettes inférieur à 65 × 109/L ont été testés comparativement sur le LH 750 et en cellule de Malassez. De même, les résultats de pourcentages d’érythroblastes donnés par le LH 750 ont été comparés aux pourcentages d’érythroblastes comptés au microscope. Les coefficients de corrélation ont été calculés par analyse de régression et la droite de régression selon la méthode des moindres carrés.

Fréquence des codes R sur plaquettes et des alarmes d’interférence sur leucocytes

Les fréquences des codes R sur les plaquettes ont été évaluées respectivement sur le Coulter LH 750 et le Coulter GEN.S du laboratoire, sur l’ensemble des échantillons passés sur les deux instruments. Dans le même groupe, nous avons évalué la fréquence des alarmes leucocytaires liées à une interférence sur le comptage. Pour les deux analyses, nous avons utilisé un test de χ2, dans le but d’évaluer si les différences de fréquence entre le GEN.S et le LH 750 sont statistiquement significatives.

Performances du panel de messages d’anomalies

Nous avons déterminé, grâce aux possibilités du logiciel de l’instrument, un tableau de messages d’anomalies à partir de règles de décision, dont le déclenchement repose sur la présence d’une ou plusieurs alarmes de suspicion ou critères quantitatifs que nous avons fixés. C’est ce tableau de messages (tableau I), dont nous avons évalué les performances. Cette évaluation a été réalisée sur un total de 442 échantillons (418 adultes, 24 bébés). Tous les échantillons ont fait l’objet d’un frottis, lu par un cytologiste. Les résultats ont été positifs sur le frottis en présence d’au moins une des anomalies listées dans le tableau II.

Tableau I. Critères de déclenchement des messages

Critères de déclenchement

Message

[Suspect ly blasts] ou [Suspect mo blasts] ou [Suspect ne blasts]

[Blastes]

[Suspect variant ly]

[Lymphocytes atypiques]

[Suspect imm NE2]

[Myélémie]

[Ne < 6,0] et [Suspect immNE1]

[Discrète myélémie]

[Suspect dimorphic red] ou [Suspect red cell agglutination] ou RDW > 20

[Morphologie GR]

[NRBC > 0,1]

[Érythroblastes]

[Suspect cellular interference] ou [Suspect High Plt interference] ou [Plt clumps] ou [NRBC > 0,1]

[Amas Plt] [Érythroblastes] 

Tableau II. Critères de positivité sur lame

Anomalie

Valeur

Blastes

≥ 1 %

Lymphocytes atypiques

≥ 2 %

Myélocytes/métamyélocytes

 > 2 %

Érythroblastes

 > 2 %

Morphologie globules rouges

Toutes anomalies

Agrégats plaquettaires

Présence

Sur la base de ces données, les échantillons ont été classés en quatre catégories, pour chacun des types d’anomalies morphologiques listées dans le tableau II : nous appelons faux négatif tout patient présentant sur lame une anomalie donnée pour laquelle le LH 750 n’a pas déclenché le message correspondant, même s’il en a déclenché un autre. Les faux positifs sont les patients pour lesquels le LH 750 a déclenché un message donné sans que l’anomalie correspondante ait été retrouvée sur le frottis et ceci quelles que soient les autres anomalies rencontrées. Les vrais négatifs et vrais positifs pour chaque type d’anomalies étaient définis respectivement par l’absence ou la présence simultanée de l’anomalie sur lame et du message correspondant pour le LH 750.
À partir du nombre de cas dans chacune des catégories, nous avons utilisé les formules suivantes pour calculer la sensibilité et la spécificité, pour chacun des messages d’anomalie : sensibilité (%) = 100 VP/(VP + FN), spécificité (%) = 100 VN/(VN + FP).

Résultats

Répétabilité intra-série

Pour l’ensemble des paramètres de la numération, les coefficients de variation apparaissent conformes aux spécifications fixées par le constructeur (tableau III). Pour la numération des leucocytes, des hématies, et des plaquettes, ces coefficients restaient pour plusieurs niveaux de valeurs testés, inférieurs respectivement à 3,44 % (leucopénie profonde), 0,37 %, et 2,0 % et, inférieurs à 0,5 % pour les autres paramètres érythrocytaires, sauf pour l’index de distribution cellulaire (IDC) à 1,35 %. Les coefficients de variation des réticulocytes variaient en fonction du niveau de valeurs étudié, de 2,8 % pour les valeurs hautes à 8,5 % pour les valeurs basses de réticulocytes. Les coefficients de variation associés à la formule leucocytaire étaient inférieurs à 1,8 % sauf pour les valeurs les plus basses de lymphocytes (CV de 2,06 % pour un pourcentage de 25 %), pour les monocytes et les éosinophiles. Ces coefficients de variation étaient confirmés par l’étude de répétabilité sur les trois niveaux de contrôles 5C ES (résultats non montrés).

Tableau III. Répétabilité intra-série

 

Moyenne

Valeur minimale

Valeur maximale

CV (%)

Leucocytes (109/L)

90,5

90,2

90,7

0,17

 

8,9

8,6

9,1

1,63

 

0,46

0,44

0,48

3,44

Hématies (1012/L)

4,66

4,64

4,69

0,32

 

2,76

2,75

2,77

0,37

Hémoglobine (g/dL)

11,22

11,15

11,27

0,37

 

7,85

7,81

7,90

0,43

Volume moyen cellulaire (fl)

113,9

113,2

114,9

0,36

 

87,1

86,5

87,6

0,40

 

75

74,9

75,1

0,11

Indice de distribution cellulaire (%)

16,0

15,6

16,3

1,35

Plaquettes (109/L)

1 067

1 055

1 085

1,0

 

168

164

175

1,35

 

77

75

78

2,0

Réticulocytes (%)

4,0

3,88

4,19

2,83

 

0,78

0,69

0,90

8,52

Indice de maturation

0,66

0,64

0,68

1,93

 

0,25

0,22

0,28

8,71

Volume moyen réticulocytaire (fl)

158,8

157,1

160,4

0,82

Neutrophiles (%) [109/L]

75,2 [8,9]

74,1 [8,6]

75,9 [9,0]

0,71

 

51,7 [6,2]

50,7 [6,2]

52,7 [6,1]

1,77

Lymphocytes (%) [109/L]

91,4 [15,6]

89,6 [15,5]

92,7 [15,6]

0,97

 

25,8 [6,6]

24,7 [6,7]

26,9 [6,6]

2,06

Monocytes (%) [109/L]

14,1 [8,2]

13,2 [8,1]

14,9 [8,4]

3,81

 

3,68 [10,8]

3,2 [10,8]

4,1 [10,9]

7,18

Éosinophiles (%) [109/L]

17,5 [4,2]

16,5 [4,3]

18,6 [4,2]

2,26

 

2,64 [6,6]

2,28 [6,7]

3,1 [6,6]

2,3

L’étude de répétabilité intra-série a été pratiquée à partir de sang de patients en calculant les moyennes et les coefficients de variation après cinq à douze passages de la numération formule. Pour la formule, les coefficients de variation sont calculés à partir de la mesure des pourcentages.

Reproductibilité

La reproductibilité a été étudiée sur 24 heures à partir d’échantillons de sang frais conservés à température ambiante ou à 5 °C. À température ambiante, les variations des leucocytes et des pourcentages de la formule étaient inférieures à 5 % des valeurs initiales, les variations des plaquettes étaient faibles (2 %), les paramètres érythrocytaires variaient peu (1 à 2 % pour les érythrocytes, l’hémoglobine et le VGM et 10 % pour l’IDC). L’étude après conservation des sangs à 5 °C a montré que la conservation à froid est satisfaisante en ce qui concerne les paramètres érythrocytaires (variation < 1 % pour les érythrocytes, l’hémoglobine et le VGM, 2 % pour l’IDC). Pour les leucocytes et les plaquettes, la stabilité était bonne jusqu’à 12 heures. Au-delà, la baisse sensible sur les deux paramètres (26 % et 12 % respectivement) incite à préférer le mode de conservation à température ambiante.

Contamination

Pour les globules rouges et l’hémoglobine, les coefficients de contamination étaient respectivement de 0,5 % et de 0,3 %. La contamination des leucocytes et des plaquettes était de 0,1 %.

Linéarité

La linéarité a été étudiée à partir de dilutions successives d’échantillons. Les valeurs les plus basses obtenues par dilution ont été, pour les globules blancs, les globules rouges, l’hémoglobine et les plaquettes de 0,07 × 109/L, 0,12 × 1012/L, 0,34 g/dL, 3,5 × 109/L respectivement. Ces valeurs exceptionnellement observables en pratique, ont été explorées dans le but de fixer les droites de régression proches de zéro. Dans les zones étudiées entre 0,07 et 204 × 109/L pour les globules blancs, de 0,12 à 7,7 × 1012/L pour les hématies, de 0,34 à 23,7 g/dL pour l’hémoglobine et de 3,5 à 2 642 × 109/L pour les plaquettes, les coefficients de corrélation étaient tous supérieurs à 0,99 et les droites de régression proches de y = x (tableau IV).

Tableau IV. Étude de linéarité

 

Intervalle

r

Droite de
regression

Taux de dilution

1/1

3/4

1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

Hématies (1012/L)

0,12-7,71

0,9997

y = x – 0,03

7,71

 –

3,80 (3,85)

1,86 (1,92)

0,94 (0,95)

0,47 (0,48)

– 

Leucocytes hauts (109/L)

0,07-204

0,9995

y = 1,01 x + 0,26

204

158 (152)

108 (102)

55 (51)

27 (26)

14 (13)

7,5 (6,5)

Leucocytes bas (109/L)

4,4

2,02 (2,2)

0,96 (1,1)

0,44 (0,55)

0,23 (0,27)

0,13 (0,14)

0,07 (0,07)

Hémoglobine (g/dL)

0,34-23,7

0,9970

y = x – 0,1

23,7

 –

11,7 (11,8)

5,7 (5,9)

2,9 (3)

1,5 (1,5)

 –

Plaquettes hautes (109/L)

3,5-2 642

0,9996

y = 0,992 x – 4,61

2 642

1 981
(2 014)

1 319
(1 321)

640
(660)

320
(330)

163
(165)

82
(82)

Plaquettes basses (109/L)

57

 –

27,4 (28,4)

13,4 (14,2)

6,2 (7,4)

3,5 (3,7)

 –

Les résultats sont obtenus après dilution ; les valeurs attendues sont données entre parenthèses, à côté des valeurs effectivement trouvées. La droite de régression (y = valeurs trouvées ; x = valeurs attendues) et les coefficients de corrélation sont calculés à partir de ces valeurs. Sur la partie droite du tableau, une partie des valeurs trouvées est reportée, ainsi que les valeurs attendues entre parenthèses.

Corrélations avec le GEN.S

Les coefficients de corrélation obtenus à partir de 150 échantillons passés successivement sur le LH750 et le GEN.S sont supérieurs à 0,99 pour tous les paramètres de la numération, pour tous les paramètres de la formule sauf pour les lymphocytes et les monocytes (r = 0,98) (tableau V). Pour les paramètres associés à la mesure du pourcentage de réticulocytes, les coefficients variaient entre 0,90 (indice de maturation réticulocytaire) et 0,98 (pourcentage de réticulocytes) (tableau V).

Tableau V. Numération, formule, réticulocytes : comparaison entre le LH 750 et le Coulter GEN.S

Paramètre

Intervalle

Coefficient de corrélation

Droite de régression

Leucocytes (109/L)

2,1-66,1

0,999

y = 0,99 x + 1,2

Hématies (1012/L)

2,10-5,72

0,998

y = x

Hémoglobine (g/dL)

2,8-19,6

0,999

y = 0,99 x

Volume moyen cellulaire (fl)

70,1-126,2

0,995

y = 0,99 x + 1,6

Indice de distribution cellulaire (%)

11,9-30,8

0,992

y = x

Plaquettes (109/L)

2-1 450

0,994

y = 1,06 x – 12

Neutrophiles (%)

10,0-93,0

0,999

y = 0,99 x – 1,2

Éosinophiles (%)

0-11,1

0,991

y = 1,02 x

Lymphocytes (%)

2,1-76,4

0,982

y = 0,99 x + 0,2

Monocytes (%)

0,6-23,5

0,977

y = 0,98 x

Réticulocytes (%)

0,7-11,2

0,983

y = 1,07 x – 0,05

Indice de maturation

0,16-0,61

0,903

y = 0,86 x + 0,07

Volume moyen réticulocytaire (fl)

96-142

0,947

y = 0,97 x + 4,0

Volume moyen des hématies sphérisées (fl)

77,2-135,1

0,958

y = x –  2,9

La comparaison pour chacun des paramètres a été faite par analyse de corrélation avec calcul de la droite de régression par la méthode des moindres carrés, sur 150 échantillons. Pour la formule, seuls des échantillons sans alarme de suspicion leucocytaire ont été retenus.

Pour les thrombopénies assorties d’un code R sur le GEN.S, la valeur donnée par le LH750 a été comparée à la méthode de contrôle utilisée dans le laboratoire (compte en cellule de Malassez). Malgré le faible nombre de cas étudiés (n = 14), le coefficient de corrélation est de 0,97 (tableau VI). Les valeurs du LH 750 en érythroblastes étaient corrélées au compte manuel avec un coefficient de corrélation de 0,90 (tableau VI).

Tableau VI. Érythroblastes et thrombopénie : comparaison entre le LH 750 et le microscope

Paramètre

Nombre

Intervalle

Coefficient de
corrélation

Droite de
régression

Érythroblastes (%)

42

0-42

0,901

y = 0,85 x – 0,34

Thrombopénie (< 70 × 109/L)

14

6-65

0,972

y = x – 0,4

La comparaison a été faite par analyse de corrélation avec calcul de la droite de régression par la méthode des moindres carrés.

Incidence des alarmes R et * sur le LH 750

Sur 529 prélèvements analysés, l’alarme R sur les plaquettes a été observée dans 10 cas sur le LH (amas plaquettaires (3), thrombopénie profonde 3 × 109/L (1), macroplaquettes (1), interférences liées à > 3 % de schizocytes (2) et érythroblastémie (1), autres cas de thrombopénie (2)) et dans 74 cas sur le GEN.S. Cette différence était significative par le test de χ2 (tableau VII). Sur les mêmes prélèvements, l’alarme d’interférence sur les leucocytes était significativement moins souvent déclenchée sur le LH 750 que sur le GEN.S (tableau VIII).

Tableau VII. Fréquence respective des codes R sur les plaquettes (LH 750 et GEN.S)

 

R sur GEN.S

Pas de R
sur GEN.S

Test de χ2

R sur LH

9

1

χ2 = 32,9

Pas de R sur LH

65

354

p < 0,0001

Tableau VIII. Fréquence respective des interférences sur les leucocytes (LH 750 et GEN.S)

 

Interférence
GEN.S

Pas d’interférence
GEN.S

Test de χ2

Interférence LH

17

0

χ2 = 165

Pas d’interférence LH

19

357

p < 0,0001

Performance du système de messages d’anomalies

Quatre cent quarante-deux prélèvements (418 adultes et 24 bébés) ont été étudiés pour évaluer la sensibilité des messages. Deux cent trente-trois prélèvements avaient une ou plusieurs anomalies sur lame : une blastémie, une myélémie > 2 %, des lymphocytes atypiques, des érythroblastes > 2 %, une anomalie significative des globules rouges ou des amas plaquettaires. Le système a été en défaut d’alarme pour 8 cas. Parmi ces cas, étaient notés 3 cas d’anomalies significatives des globules rouges, 3 cas de lymphocytes atypiques (dans des contextes de viroses) et 2 cas de discrète myélémie. Dans 95,7 % des cas, la présence d’un message sur l’automate a permis la détection d’une anomalie. Vingt-quatre messages ne conduisaient à la découverte d’aucune anomalie significative sur le frottis (8,3 % de revues de lames inutiles). Les messages affichés étaient : myélémie dans 11 cas, lymphocytes atypiques dans 6 cas, blastes dans 2 cas, amas plaquettaire dans 2 cas et érythroblastes dans 3 cas.
La sensibilité et la spécificité de chaque message ont ensuite été étudiées (tableau IX). Parmi les 39 cas présentant des blastes sur le frottis (21 LAM ayant 0,9 à 47 × 109/L leucocytes et 7 à 66 % de blastes ; 2 LAL avec 7 à 17 × 109/L leucocytes et 30 % de blastes ; 2 cas de LMC avec des leucocytes à 45 et 86 × 109/L et 1 à 2 % de blastes ; 11 cas de myélémie de régénération ayant une leucocytose de 2,4 à 40 giga/L avec 1 à 9 % de blastes ; 2 autres cas de myélémie (sang de nouveau-né et LMMC), 1 syndrome mononucléosique avec plus de 3 % d’immunoblastes), le message spécifique blastes était présent dans 37 cas et dans 2 cas de faux négatifs (myélémie de régénération avec 1 à 2 % de blastes) il y avait l’alarme myélémie soit une sensibilité du message de 94,8 %. Donc, sur la totalité des échantillons avec des blastes, la présence d’une alarme conduisait à une revue du frottis.

Tableau IX. Détection des anomalies morphologiques par le système de messages mis en place sur l’instrument. La sensibilité et la spécificité de chaque message est donnée, ainsi que le pourcentage des anomalies marquées par un autre message

Autre message

Total des messages

Sensibilité

Spécificité

Blastes (39)

94,8 %

93,5 %

5,2 %

100 %

Myélémie (82)

86,6 %

90,7 %

11,0 %

97,6 %

Lymphocytes atypiques (31)

80,6 %

92,2 %

9,7 %

90,3 %

Érythroblastes (32)

93,8 %

96,3 %

6,2 %

100 %

Morphologie hématies (45)

75,5 %

99,7 %

16,1 %

91,6 %

Amas plaquettaires (13)

84,6 %

94,4 %

0 %

84,6 %

Total (242)

86 %

94,6 %

9,7 %

95,7 %

La spécificité du message de 93,5 % est liée aux 26 cas de faux positifs pour lesquels le message blastes accompagnait d’autres messages : myélémie dans un contexte de régénération, lymphocytes atypiques dans des pathologies lymphoïdes où l’on notait la présence de prolymphocytes. Dans 5 cas, il était inexpliqué et concernait des échantillons avec des interférences signalées par d’autres alarmes dont amas plaquettaires.
Sur 82 prélèvements présentant une myélémie significative (> 2 %), 71 étaient marqués par le message myélémie (sensibilité : 86,6 %) ; dans 2 cas seulement, le système ne déclenchait aucun message. Dans 3 cas, l’alarme blaste, ou chez 5 bébés, l’alarme érythroblaste, était déclenchée préférentiellement. La spécificité du message était de 90,7 %. Les messages faussement positifs correspondaient en général à des hyperleucocytoses > 20 × 109/L et > 90 % de polynucléaires ou à des myélémies ≤ 2 %.
Les 31 prélèvements présentant des lymphocytes atypiques concernaient 10 cas de syndromes lymphoprolifératifs, 21 autres cas de pathologies réactionnelles, dans un contexte viral, avec des lymphocytoses de 2,4 × 109/L à 10 × 109/L dont 3 échantillons de bébés qui outre la morphologie particulière des lymphocytes de bébés présentaient des signes d’activation virale, ou dans un contexte infectieux (myélémie associée à la circulation de plasmocytes et de cellules hyperbasophiles). Vingt-cinq cas ont été signalés par le message lymphocytes atypiques (sensibilité : 80,6 %), 3 cas par le message myélémie et 3 cas de virose n’ont pas été signalés du tout. La détection des lymphocytes atypiques par tout type de message était donc de 90,3 %. Le message lymphocytes atypiques s’est déclenché de façon faussement positive (spécificité du message : 92,2 %) lors de blastoses significatives (10 cas) et surtout sur les sangs de bébés (14 cas) avec d’autres messages d’accompagnement. Dans 6 cas, ce message n’était pas expliqué.
Les érythroblastes ont été détectés par le message spécifique dans 30 cas sur 32 et dans les 2 autres cas par l’alarme myélémie ce qui donne une sensibilité du message de 93,8 % et un taux de détection par tout message de 100 %. La spécificité du message était de 96,3 %, les faux positifs correspondant à des agrégats plaquettaires ou à des érythroblastémies ≤ 2 %.
Pour étudier le message morphologie GR, les anomalies morphologiques érythrocytaires significatives suivantes, isolées ou associées ont été retenues : macrocytose + +, anisocytose + +, poïkylocytose + +, schizocytes + +. Il n’a pas été pris en compte les anomalies peu significatives, la polychromasie, et les hématies en rouleaux. Il y a un seul cas de faux positifs (spécificité : 99,7 %), mais il y a onze faux négatifs dont trois cas correspondent à des anomalies significatives sans aucun autre message (présence de dacryocytes et d’ovalocytes + +, présence de 3 % de schizocytes, anisocytose importante) et huit cas avaient déclenché d’autres messages de revue de lames (sensibilité du message 75,5 %).
Le message amas plaquettaire accompagnait 11 cas sur 13 d’amas plaquettaires, les deux autres cas étaient des contextes particuliers (leucémie) assortis d’autres messages (sensibilité de 84,6 %). Les faux positifs correspondaient à d’autres anomalies plaquettaires (macroplaquettes, ou très forte anisocytose plaquettaire) ou en présence d’érythroblastes. Seuls 2 cas étaient inexpliqués.

Discussion

Les automates d’hématologie Coulter possèdent un module de mesure de variation d’impédance dédié à la numération et un module de cytométrie en flux. Ce dernier, d’abord dédié à la formule [4-7], a été appliqué à la détermination des réticulocytes d’abord en méthode semi-automatique [8, 9], puis entièrement automatisée [1, 10]. Le LH 750 s’intègre dans cette gamme d’analyseurs. Quelques modifications apportées par le constructeur dans la composition d’un diluant et dans le logiciel d’analyse rendent cet automate plus performant et plus spécifique dans le déclenchement des alarmes leucocytaires et plaquettaires et apte à la mesure des érythroblastes.
La première partie de notre évaluation a été consacrée aux performances générales du Coulter LH 750. La répétabilité intra-série de l’instrument a été trouvée très bonne sur tous les paramètres (numération, formule, réticulocytes) quel que soit le niveau de valeur étudié, avec une stabilité des résultats sur 24 heures totalement satisfaisante à température ambiante. La linéarité est jugée satisfaisante pour les quatre paramètres de la numération étudiés ; pour les leucocytes et les plaquettes, nous constatons une plage de linéarité élargie par rapport aux spécifications du GEN.S de notre laboratoire, mais il n’a cependant pas été possible, faute de matériel biologique adéquat, d’étudier l’ensemble de la plage de linéarité annoncée. La contamination inter-échantillons est minime.
La seconde partie de l’étude a été dédiée à l’analyse comparative des résultats du LH 750 soit avec le GEN.S du laboratoire (numération, formule, réticulocytes) pour les paramètres présents sur les deux instruments (tableau V), soit avec la méthode optique pour les érythroblastes et les valeurs basses de plaquettes affectées d’un code R sur le GEN.S, empêchant l’usage de cet appareil comme référent. Les deux instruments étaient en très bonne corrélation pour l’ensemble des paramètres de la numération et de la formule, avec un coefficient de corrélation (r) supérieur à 0,99, à l’exception des lymphocytes (0,98) et des monocytes (0,977). Pour les paramètres réticulocytaires, les coefficients de corrélations variaient entre 0,903 (indice de maturation) et 0,983 (pourcentage de réticulocytes).
Pour les comparaisons faites entre le LH 750 et les données du microscope, nous avons trouvé une corrélation globale satisfaisante (r = 0,901) pour le pourcentage d’érythroblastes. En cas de thrombopénie inférieure à 65 × 109/L (résultat rendu avec un code R sur le GEN.S), la bonne corrélation du LH 750 avec le compte manuel a confirmé les conclusions établies ailleurs grâce à la cytométrie en flux [11-13]. La faible incidence de ce code comparée à celle du GEN.S (tableau VII) aboutit à la prise en compte pour la décision transfusionnelle, des valeurs de plaquettes délivrées par le LH 750.
Le système de messages de détection que nous avons mis en place repose sur une possibilité commune au Coulter GEN.S et au Coulter LH 750 : celle de créer des règles conditionnelles associant un critère ou une combinaison de critères quantitatifs et qualitatifs donnés par l’automate à la génération de messages d’anomalie définis par l’utilisateur. Le tableau I montre la définition des critères de déclenchement des messages. Il faut remarquer que, sur le LH 750, l’alarme cellular interference a été prise en compte parmi les critères de déclenchement de certains de ces messages, en raison de la diminution nette du nombre de cas de faux positifs pour cette alarme, qui va de pair avec la diminution de son incidence, comme l’a montré notre étude.
Le système de messages d’anomalies ainsi défini a été testé en termes de sensibilité et de spécificité (tableau IX). La sensibilité de chaque message pour l’anomalie en cause variait de 75,5 % (morphologie des globules rouges) à 94,8 % (blastes). Les alarmes étaient également très spécifiques puisque, quel que soit le type d’anomalie rencontrée, la spécificité n’était jamais inférieure à 90 %. Il est donc possible d’affirmer à partir de notre étude que notre système de messages génère peu de revues inutiles (8,3 %), ce qui se traduit également par une efficacité globale de détection des anomalies par tout message de 95,7 %. L’ensemble de ces données montre que notre système de messages, basé sur un choix d’alarmes donné par l’instrument, a été très sensible aux anomalies avec, dans la très grande majorité des cas, le déclenchement du message approprié.
Le LH 750 est donc un automate performant sur lequel la mise en place d’un système simple d’exploitation des alarmes délivrant des messages d’anomalies assez spécifiquement identifiés, en fait un appareil adapté pour le laboratoire en termes d’efficacité de la validation. De plus, les possibilités liées au random access (communication par l’ordinateur central du type d’analyse à faire pour chaque patient et changement automatique de configuration de l’instrument pour effectuer le profil demandé) optimisent l’efficacité globale du travail du laboratoire en éliminant les tris préalables par analyse.

Remerciements. Nous tenons à remercier le docteur Pierre Sassier de la société Beckman Coulter pour son aide précieuse, Mesdames les docteurs Chantal Bayle de l’Institut Gustave Roussy et Françoise Picard de l’hôpital Cochin pour nous avoir permis de travailler sur leurs échantillons.

Références

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11. Steele BW, Wu NC, Whitcomb C. White blood cell and platelet counting performance by hematology analyzers: a critical evaluation. Lab Hematol 2001 ; 7 : 255-66.

12. Kaplan SS, Johnson K, Wolfe N. Validation of low platelet counts from Coulter LH 750 and Coulter GEN.S analyzers. Lab Hematol 2001 ; 7 : 198-203.

13. Keeney M, Brown W, Yee IC. Platelet counts and flagging rates from the LH 750 hematology analyzer compared with the ICSH/ISLH platelet reference method and the GEN.S hematology analyzer. Lab Hematol 2001 ; 7 : 204-10.

Anomalie (nombre)

Message spécifique


 

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