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Evaluation of analytical performances of ferritin assay with Vitros ECi®


Annales de Biologie Clinique. Volume 57, Number 3, 351-5, Mai - Juin 1999, Pratique quotidienne


Résumé  

Author(s) : M. Vernet, C. Valadoux, S. Doffoel, Laboratoire de biochimie, Hôpital de la Croix-Rousse, 103, Grande-Rue de la Croix-Rousse, 69317 Lyon cedex 4.

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ARTICLE

L'analyseur Vitros ECi®, commercialisé par les laboratoires Ortho Clinical Diagnostics, est un automate multiparamétrique d'immuno-analyse à accès aléatoire récemment introduit sur le marché français. Les réactions immunologiques utilisées se déroulent en phase hétérogène par méthode immunométrique, compétition ou immunocapture. La peroxydase du conjugué catalyse l'oxydation d'un dérivé du luminol, la réaction est amplifiée par un agent de transfert d'électrons. L'intensité du signal lumineux est mesurée par un luminomètre. Cet automate de chimiluminescence présente un menu d'analyses étendu : hormones thyroïdiennes et de la fertilité, marqueurs tumoraux, bilan d'anémie, exploration osseuse et cardiaque, marqueurs sériques maternels de la trisomie 21. Dans le cadre du bilan d'anémie, il nous a été demandé d'évaluer les performances du réactif pour le dosage de la ferritine.

Principe du dosage

Le dosage de la ferritine par le Vitros ECi® repose sur une technique immunométrique en deux étapes. Les cinétiques réactionnelles sont accélérées par incubation des puits à 37 °C, sous agitation. Dans la première étape, la ferritine de l'échantillon réagit avec un anticorps polyclonal biotinylé (mouton) antiferritine humaine, le complexe antigène-anticorps formé se lie à la streptavidine tapissant le puits réactionnel. Après lavage par un liquide thermostaté à 37 °C, un deuxième anticorps monoclonal marqué à la peroxydase est ajouté. La peroxydase fixée catalyse l'oxydation d'un dérivé du luminol, générant ainsi un signal lumineux dont l'intensité est augmentée et prolongée par un agent de transfert d'électrons (3 chloro-4 hydroxy-acétanilide). Le puits réactionnel est acheminé vers le luminomètre.

Chaque cartouche de réactifs contient 100 puits revêtus de streptavidine, le réactif anticorps biotinylé et le conjugué marqué à la peroxydase. Le réactif signal, le réactif de lavage, les calibrateurs et contrôles font l'objet de conditionnements séparés.

Conditions de l'évaluation

Les essais se sont déroulés durant deux mois pleins en février et mars 1998 selon un protocole approuvé par les deux parties et inspiré du protocole Validation de techniques de la Société française de biologie clinique [1, 2].

Un seul lot de réactif ferritine (Réf. : 835 6636, lot 21), de réactifs signal (Réf. : 107 2693, lot 233) et de calibrateur (Réf. : 115 8864, lot 004) a été utilisé durant tout l'essai. Les sérums de contrôles Amerlite® (Réf. : 840 6092, lot 80) et Vitros® (Réf. : 680 0338, lot 90) ont été successivement employés.

Période de familiarisation

Vingt dosages des sérums de contrôle Amerlite® à trois niveaux (seuls disponibles à cette période) ont été réalisés sur trois jours consécutifs. Les coefficients de variation (CV) observés chaque jour étaient compris entre 1,6 et 3,1 % pour une concentration moyenne de 11,7 mg/l, entre 2,1 et 3 % pour une concentration moyenne de 171 mg/l et entre 2,7 et 5,3 % pour une concentration moyenne de 512 mg/l. Ces CV étaient un peu supérieurs à ceux indiqués par la notice du fabricant (respectivement 1,6, 1,8 et 2 % pour les 3 niveaux). Ils ont été néanmoins jugés acceptables pour la poursuite des essais.

Période d'évaluation

Reproductibilité intersérie

Elle a été évaluée avec les sérums de contrôles Vitros® mieux adaptés que les contrôles Amerlite®, avec deux calibrations différentes. Par ailleurs, 5 sérums de contrôle Probioqual (Villeurbanne) pour évaluation externe de la qualité ont été analysés dans 9 séries de dosages avec la même calibration.

Pour les contrôles Vitros®, l'imprécision est faible et indépendante de la concentration et de l'étalonnage (tableau 1). Globalement, on peut estimer le niveau d'imprécision à 6 %, les performances obtenues rejoignent les indications du fabricant. Pour les sérums Probioqual, l'imprécision augmente avec la concentration : CV à 3,3 % pour une ferritine égale à 17,3 mg/l, CV à 5,6 % pour une ferritine égale à 293 mg/l (tableau 2).

Caractéristiques opérationnelles

­ Limite de détection. L'appareil permet un accès facile à la mesure des signaux luminométriques. Le calibrateur zéro a été analysé 30 fois dans une même série. La limite de détection a été calculée selon la formule : LD = K.Sb/p (K = 3,3) [3], elle est de 0,145 mg/l.

­ Seuil de quantification. Le test a été réalisé en diluant un sérum de concentration égale à 14 mg/l dans le diluant approprié, chaque dilution a été analysée 3 fois [1]. L'équation de la droite de régression est : valeur mesurée (Vitros®) = 0,93* valeur théorique + 1,13. La précision des triplets est excellente, même pour une concentration théorique de 0,9 mg/l. On peut estimer que le seuil inférieur de quantification est voisin de 1 mg/l.

­ Linéarité. Trois sérums ont été dilués dans le diluant fourni et chaque dilution a fait l'objet de 3 mesures. Pour le premier sérum (188 mg/l), les écarts à la valeur théorique sont compris entre ­ 1,2 et + 10,6 % (écart moyen : + 4,2 %). Pour le second (798 mg/l), les écarts sont compris entre ­ 6,6 et + 2,8 % (écart moyen : ­ 2,9 %). Pour le troisième (1 020 mg/l), les écarts sont compris entre ­ 2,8 % et + 1 % (écart moyen : ­ 1,3 %). La linéarité est vérifiée de 20 à 1 000 mg/l.

Appréciation de l'inexactitude

­ Sérums de contrôle. Pour les contrôles Vitros®, la comparaison de la valeur moyenne à la valeur cible (tableau 1) montre que l'exactitude est bien vérifiée sur les niveaux 1 et 2. Sur le niveau 3, la moyenne observée est supérieure de 5 à 6 % à la valeur cible annoncée. Pour les sérums Probioqual (tableau 2), l'exactitude est bonne sur les niveaux moyens (valeurs cibles : 28,1 et 53,5 mg/l) ; l'inexactitude est importante pour les niveaux bas (12,6 mg/l) et élevés (139,7 et 368,5 mg/l). Il est vraisemblable qu'un effet « matrice » altère la qualité des résultats. Ce problème, déjà mentionné avec les réactifs Amerlite®, est connu des laboratoires Ortho pour le réactif Vitros®.

­ Épreuve de surcharge. Un pool de sérums humains a été surchargé avec le deuxième standard international de ferritine de rate humaine (NIBSC Réf. : 80/578) [4] et avec le troisième standard international de ferritine recombinante (NIBSC Réf. : 94/572) [5]. Tous les essais ont été effectués en triple exemplaire sur le Vitros ECi® et sur l'IMx® (Abbott) utilisé en routine dans le laboratoire. Le tableau 3 fait apparaître un défaut de recouvrement important pour la ferritine de rate humaine dont nous avons cherché à identifier l'origine. L'antigène utilisé pour la préparation des immunsérums est d'origine splénique. Par ailleurs, les calibrateurs Vitros® sont ajustés sur les standards Amerlite® eux-mêmes préparés à partir de ferritine de rate humaine. On peut supposer un défaut de reconnaissance immunologique lié à la nature de l'anticorps monoclonal conjugué qui reconnaît mieux la ferritine hépatique [6]. Cela pourrait expliquer la sous-estimation de certains sérums de contrôle surchargés en ferritine de rate. La récupération est meilleure avec la ferritine recombinante constituée exclusivement de sous-unités L. Le fait que la ferritine sérique est exclusivement constituée de sous-unités L [7] explique peut-être cette meilleure récupération.

­ Effet crochet. Huit sérums de concentration comprise entre 17 400 et 67 500 mg/l sur IMx® ont été analysés purs, dilués au 1/10e et au 1/100e. Les résultats sont inférieurs de 9 à 33 % à ceux de l'IMx® mais aucun effet crochet n'existe jusqu'à 61 300 mg/l (ce point n'est pas signalé dans la notice du réactif).

­ Interactions non immunologiques. L'effet des interférences d'origine endogène a été apprécié par surcharge d'un pool de sérums selon le protocole Valtec [1]. La limite d'acceptabilité a été fixée à 5 %. Nos conclusions sont les suivantes : pas d'influence de l'hémoglobine jusqu'à
200 mmol/l (la notice indique 290 mmol/l), pas d'interférence de la bilirubine jusqu'à 250 mmol/l (la notice indique 340 mmol/l), pas d'interférence de la turbidité jusqu'à une concentration en triglycérides de 7 mmol/l (la notice indique 34 mmol/l de trioléine). Par ailleurs, à la demande d'Ortho Clinical Diagnostics, nous avons tenté d'évaluer l'influence de la biotine. Les sérums de 3 patients traités au Cernevit® ont été analysés comparativement à l'IMx®, la biotine a été dosée par méthode radio-immunologique (Docteur B. Claustrat, Service de radio-pharmacie et de radio-analyses, Hôpital cardiologique, Bron). Aucune interférence de la biotine n'a été observée jusqu'à 44 nmol/l (11 mg/l), ce qui confirme les données du fabricant.

­ Étude de corrélation. Centre quatre-vingt-onze sérums conservés à ­ 20 °C depuis 4 mois ont été analysés en 11 séries réparties sur 5 semaines. Les sérums ont été analysés purs et éventuellement dilués au 1/10e si la concentration excédait 1 000 mg/l. Les résultats ont été corrélés à ceux de l'IMx®. La corrélation entre les deux automates est excellente sur tout le domaine de mesure, de 4 à
1 000 mg/l (tableau 4, figure 1). La concordance des résultats est remarquable dans la zone des faibles concentrations. Une dispersion plus grande est observée pour les concentrations de ferritine supérieures à 1 000 mg/l, ayant nécessité une dilution sur les deux systèmes. Cette cohérence des résultats peut surprendre si on se réfère au comportement différent des réactifs Abbott et Ortho au regard de la récupération des ajouts de standards internationaux (tableau 3). Face à cette difficulté, les calibrateurs Vitros® ne sont pas titrés sur le standard international de rate mais « réajustés » par rapport aux standards IMx®.

Valeurs de référence

La notice du fabricant indique que l'intervalle de référence est de 17,9 à 464 mg/l chez l'homme, de 6,3 à
132 mg/l chez la femme de moins de 50 ans et de 10,2 à 265 mg/l chez la femme de plus de 50 ans. Les sujets étudiés étaient des patients en « apparente bonne santé », il ne s'agissait donc pas d'individus de référence [8]. Ceci explique vraisemblablement que les intervalles soient larges et très différents de ceux de l'IMx®.

Modalités de l'étude

En conséquence, nous avons déterminé les valeurs de référence en procédant à une sélection rigoureuse des individus afin d'éliminer les sujets à risque de carence et les pathologies induisant une fausse hyperferritinémie telle que syndrome inflammatoire ou légère atteinte hépatique [9]. Les sujets inclus étaient en bonne santé apparente ; les valeurs d'hémoglobine, vitesse de sédimentation et/ou CRP, transaminases et gammaglutamyltranspeptidase étaient dans les limites de référence [8]. Trois groupes ont été constitués : 47 hommes de 20 à 30 ans, 82 hommes de 31 à 60 ans, 100 femmes de 50 à 60 ans.

Les aliquotes de sérum ont été conservées à ­ 25 °C jusqu'au jour de l'analyse. La précision a été vérifiée sur les contrôles Vitros® à 3 niveaux : les coefficients de variation étaient respectivement de 2,3 ­ 2,7 et 3,7 %. Les écarts relatifs par rapport à la valeur-cible ont été trouvés à + 1,2 ­ 0,9 et + 0,94 % pour les niveaux 1 à 3.

Étude statistique

Les histogrammes des 3 catégories de sujets (figure 2) illustrent l'asymétrie des distributions, observation classique en matière de ferritine [9]. Nous avons donc procédé à une estimation non paramétrique des quantiles [10] (tableau 5) ; il est certain que le faible effectif des hommes de 20 à 30 ans entraîne une incertitude réelle sur le calcul des quantiles.

Intervalles de référence

Les intervalles de référence calculés incluent 90 % des échantillons de référence, les limites sont définies par les quantiles 0,05 et 0,95. Pour les hommes de 20 à 30 ans, l'intervalle est de 24 à 273 mg/l. Pour les hommes de 31 à 60 ans, l'intervalle est de 41 à 421 mg/l. Pour les femmes, l'intervalle est de 14 à 197 mg/l.

L'intervalle de référence déterminé chez les femmes de 50 à 60 ans, période à laquelle le statut en fer est enfin équilibré, est valable pour l'ensemble des femmes qu'elles soient en âge de procréer ou non [11].

Les intervalles calculés sont très voisins de ceux que nous avions déterminés sur IMx® en utilisant des critères de sélection identiques. Ceci est logique compte tenu de l'excellente corrélation observée entre les deux systèmes d'analyse.

CONCLUSION

Le réactif « Ferritine » proposé sur le Vitros ECi® est bien adapté à l'exploration du métabolisme du fer : imprécision faible pour les valeurs basses, très bonne linéarité, absence d'effet crochet vérifiée jusqu'à 60 000 mg/l, interférence limitée des analytes endogènes. L'excellente corrélation avec les résultats de l'analyseur IMx Abbott s'explique par le mode particulier de calibration visant à pallier la récupération partielle des standards internationaux. Des intervalles de référence déterminés sur des sujets sélectionnés selon des critères adaptés à la ferritine sont proposés.

Au cours de cette évaluation, nous avons pu apprécier les qualités de l'analyseur Vitros® : très faible volume mort sur godet (16 ml), prélèvement par cônes à usage unique évitant toute possibilité de contamination, stockage des réactifs à bord de l'automate à + 4 °C assuré pendant 2 mois, stabilité de la calibration durant 28 jours, convivialité du logiciel.

Remerciements. Au cours de cette évaluation, nous avons particulièrement apprécié l'aide technique de Madame Marie-Claire Magnard.

Article reçu le 3 décembre 1998, accepté le 15 janvier 1999.

REFERENCES

1. Vassault A, Azzedine MC, Bailly M, et al. (commission Validation de techniques SFBC). Protocole de validation de techniques. Ann Biol Clin 1986 ; 44 : 686-745.

2. Capolaghi B, Vassault A, Grafmeyer D, Yvert JP (groupe de travail : Adaptation du protocole validation de techniques). Ann Biol Clin 1997 ; 55 : 167-8.

3. Baud M, Cohen R, Dumont G, Mercier M, Naudin, Vassault A (commission Validation de techniques SFBC). Évaluation de la limite de détection. Information Scientifique du Biologiste 1989 ; 15 : 157-63.

4. International Committee for standardization in haematology (Expert Panel on iron). Preparation, characterization and storage of human ferritin for use as a standard for the assay of serum ferritin. Clin Lab Haemat 1984 ; 6 : 177-91.

5. Thorpe SJ, Walker D, Arosio P, Heath A, Cook JD, Worwood M. International collaborative study to evaluate a recombinant L ferritin preparation as an international standard. Clin Chem 1997 ; 43 : 1582-7.

6. Lynn S, Snyder B. Vitros ferritin correlation with Abbott IMX/Axsym : discrepancy between CAP survey samples/commercial controls and patient samples. Ortho Clinical Diagnostics, rapport interne (disponible sur demande).

7. Ponka P, Beaumont C, Richardson DR. Function and regulation of transferrin and ferritin. Sem Hematol 1998 ; 35 : 35-54.

8. Siest G, Henny J (commission Valeurs de référence ­ SFBC). Production de valeurs de référence de sujets sains. Ann Biol Clin 1981 ; 39 : 235-44.

9. Vernet M, Revenant MC, Charlier C, et al. Valeurs de référence de la ferritine sérique chez l'adulte. Ann Biol Clin 1994 ; 52 : 493-8.

10. Albert A, Gueguen R, Sachs C (commission Valeurs de référence ­ SFBC). Traitement des valeurs de référence et détermination de l'intervalle de référence. Ann Biol Clin 1983 ; 41 : 63-79.

11. Rymer JC. Groupes à risque élevé de carence martiale : le problème particulier des femmes en âge de procréer et des femmes enceintes. In : Les ferritines sériques et érythrocytaires en pratique médicale. Monographie Abbott, 1991 : 29-33.


 

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