ARTICLE
L'analyseur Vitros ECi®, commercialisé par les
laboratoires Ortho Clinical Diagnostics, est un automate multiparamétrique
d'immuno-analyse à accès aléatoire récemment
introduit sur le marché français. Les réactions immunologiques
utilisées se déroulent en phase hétérogène
par méthode immunométrique, compétition ou immunocapture.
La peroxydase du conjugué catalyse l'oxydation d'un dérivé
du luminol, la réaction est amplifiée par un agent de transfert
d'électrons. L'intensité du signal lumineux est mesurée
par un luminomètre. Cet automate de chimiluminescence présente
un menu d'analyses étendu : hormones thyroïdiennes et de la
fertilité, marqueurs tumoraux, bilan d'anémie, exploration
osseuse et cardiaque, marqueurs sériques maternels de la trisomie
21. Dans le cadre du bilan d'anémie, il nous a été
demandé d'évaluer les performances du réactif pour
le dosage de la ferritine.
Principe du dosage
Le dosage de la ferritine par le Vitros ECi® repose sur
une technique immunométrique en deux étapes. Les cinétiques
réactionnelles sont accélérées par incubation
des puits à 37 °C, sous agitation. Dans la première
étape, la ferritine de l'échantillon réagit avec
un anticorps polyclonal biotinylé (mouton) antiferritine humaine,
le complexe antigène-anticorps formé se lie à la
streptavidine tapissant le puits réactionnel. Après lavage
par un liquide thermostaté à 37 °C, un deuxième
anticorps monoclonal marqué à la peroxydase est ajouté.
La peroxydase fixée catalyse l'oxydation d'un dérivé
du luminol, générant ainsi un signal lumineux dont l'intensité
est augmentée et prolongée par un agent de transfert d'électrons
(3 chloro-4 hydroxy-acétanilide). Le puits réactionnel est
acheminé vers le luminomètre.
Chaque cartouche de réactifs contient 100 puits revêtus
de streptavidine, le réactif anticorps biotinylé et le conjugué
marqué à la peroxydase. Le réactif signal, le réactif
de lavage, les calibrateurs et contrôles font l'objet de conditionnements
séparés.
Conditions de l'évaluation
Les essais se sont déroulés durant deux mois pleins en
février et mars 1998 selon un protocole approuvé par les
deux parties et inspiré du protocole Validation de techniques de
la Société française de biologie clinique [1, 2].
Un seul lot de réactif ferritine (Réf. : 835 6636, lot
21), de réactifs signal (Réf. : 107 2693, lot 233) et de
calibrateur (Réf. : 115 8864, lot 004) a été utilisé
durant tout l'essai. Les sérums de contrôles Amerlite®
(Réf. : 840 6092, lot 80) et Vitros® (Réf.
: 680 0338, lot 90) ont été successivement employés.
Période de familiarisation
Vingt dosages des sérums de contrôle Amerlite®
à trois niveaux (seuls disponibles à cette période)
ont été réalisés sur trois jours consécutifs.
Les coefficients de variation (CV) observés chaque jour étaient
compris entre 1,6 et 3,1 % pour une concentration moyenne de 11,7 mg/l,
entre 2,1 et 3 % pour une concentration moyenne de 171 mg/l et entre 2,7
et 5,3 % pour une concentration moyenne de 512 mg/l. Ces CV étaient
un peu supérieurs à ceux indiqués par la notice du
fabricant (respectivement 1,6, 1,8 et 2 % pour les 3 niveaux). Ils ont
été néanmoins jugés acceptables pour la poursuite
des essais.
Période d'évaluation
Reproductibilité intersérie
Elle a été évaluée avec les sérums
de contrôles Vitros® mieux adaptés que les
contrôles Amerlite®, avec deux calibrations différentes.
Par ailleurs, 5 sérums de contrôle Probioqual (Villeurbanne)
pour évaluation externe de la qualité ont été
analysés dans 9 séries de dosages avec la même calibration.
Pour les contrôles Vitros®, l'imprécision
est faible et indépendante de la concentration et de l'étalonnage
(tableau 1). Globalement,
on peut estimer le niveau d'imprécision à 6 %, les performances
obtenues rejoignent les indications du fabricant. Pour les sérums
Probioqual, l'imprécision augmente avec la concentration : CV à
3,3 % pour une ferritine égale à 17,3 mg/l, CV à
5,6 % pour une ferritine égale à 293 mg/l (tableau
2).
Caractéristiques opérationnelles
Limite de détection. L'appareil permet un accès
facile à la mesure des signaux luminométriques. Le calibrateur
zéro a été analysé 30 fois dans une même
série. La limite de détection a été calculée
selon la formule : LD = K.Sb/p (K = 3,3) [3], elle est de 0,145 mg/l.
Seuil de quantification. Le test a été réalisé
en diluant un sérum de concentration égale à 14 mg/l
dans le diluant approprié, chaque dilution a été
analysée 3 fois [1]. L'équation de la droite de régression
est : valeur mesurée (Vitros®) = 0,93* valeur théorique
+ 1,13. La précision des triplets est excellente, même pour
une concentration théorique de 0,9 mg/l. On peut estimer que le
seuil inférieur de quantification est voisin de 1 mg/l.
Linéarité. Trois sérums ont été
dilués dans le diluant fourni et chaque dilution a fait l'objet
de 3 mesures. Pour le premier sérum (188 mg/l), les écarts
à la valeur théorique sont compris entre 1,2 et +
10,6 % (écart moyen : + 4,2 %). Pour le second (798 mg/l), les
écarts sont compris entre 6,6 et + 2,8 % (écart moyen
: 2,9 %). Pour le troisième (1 020 mg/l), les écarts
sont compris entre 2,8 % et + 1 % (écart moyen :
1,3 %). La linéarité est vérifiée de 20 à
1 000 mg/l.
Appréciation de
l'inexactitude
Sérums de contrôle. Pour les contrôles
Vitros®, la comparaison de la valeur moyenne à la
valeur cible (tableau 1)
montre que l'exactitude est bien vérifiée sur les niveaux
1 et 2. Sur le niveau 3, la moyenne observée est supérieure
de 5 à 6 % à la valeur cible annoncée. Pour les sérums
Probioqual (tableau 2),
l'exactitude est bonne sur les niveaux moyens (valeurs cibles : 28,1 et
53,5 mg/l) ; l'inexactitude est importante pour les niveaux bas (12,6
mg/l) et élevés (139,7 et 368,5 mg/l). Il est vraisemblable
qu'un effet « matrice » altère la qualité des
résultats. Ce problème, déjà mentionné
avec les réactifs Amerlite®, est connu des laboratoires
Ortho pour le réactif Vitros®.
Épreuve de surcharge. Un pool de sérums
humains a été surchargé avec le deuxième standard
international de ferritine de rate humaine (NIBSC Réf. : 80/578)
[4] et avec le troisième standard international de ferritine recombinante
(NIBSC Réf. : 94/572) [5]. Tous les essais ont été
effectués en triple exemplaire sur le Vitros ECi®
et sur l'IMx® (Abbott) utilisé en routine dans le
laboratoire. Le tableau 3
fait apparaître un défaut de recouvrement important pour
la ferritine de rate humaine dont nous avons cherché à identifier
l'origine. L'antigène utilisé pour la préparation
des immunsérums est d'origine splénique. Par ailleurs, les
calibrateurs Vitros® sont ajustés sur les standards
Amerlite® eux-mêmes préparés à
partir de ferritine de rate humaine. On peut supposer un défaut
de reconnaissance immunologique lié à la nature de l'anticorps
monoclonal conjugué qui reconnaît mieux la ferritine hépatique
[6]. Cela pourrait expliquer la sous-estimation de certains sérums
de contrôle surchargés en ferritine de rate. La récupération
est meilleure avec la ferritine recombinante constituée exclusivement
de sous-unités L. Le fait que la ferritine sérique est exclusivement
constituée de sous-unités L [7] explique peut-être
cette meilleure récupération.
Effet crochet. Huit sérums de concentration comprise
entre 17 400 et 67 500 mg/l sur IMx® ont été
analysés purs, dilués au 1/10e et au 1/100e.
Les résultats sont inférieurs de 9 à 33 % à
ceux de l'IMx® mais aucun effet crochet n'existe jusqu'à
61 300 mg/l (ce point n'est pas signalé dans la notice du réactif).
Interactions non immunologiques. L'effet des interférences
d'origine endogène a été apprécié par
surcharge d'un pool de sérums selon le protocole Valtec [1]. La
limite d'acceptabilité a été fixée à
5 %. Nos conclusions sont les suivantes : pas d'influence de l'hémoglobine
jusqu'à
200 mmol/l (la notice indique 290 mmol/l), pas d'interférence de
la bilirubine jusqu'à 250 mmol/l (la notice indique 340 mmol/l),
pas d'interférence de la turbidité jusqu'à une concentration
en triglycérides de 7 mmol/l (la notice indique 34 mmol/l de trioléine).
Par ailleurs, à la demande d'Ortho Clinical Diagnostics, nous avons
tenté d'évaluer l'influence de la biotine. Les sérums
de 3 patients traités au Cernevit® ont été
analysés comparativement à l'IMx®, la biotine
a été dosée par méthode radio-immunologique
(Docteur B. Claustrat, Service de radio-pharmacie et de radio-analyses,
Hôpital cardiologique, Bron). Aucune interférence de la biotine
n'a été observée jusqu'à 44 nmol/l (11 mg/l),
ce qui confirme les données du fabricant.
Étude de corrélation. Centre quatre-vingt-onze
sérums conservés à 20 °C depuis 4 mois
ont été analysés en 11 séries réparties
sur 5 semaines. Les sérums ont été analysés
purs et éventuellement dilués au 1/10e si la
concentration excédait 1 000 mg/l. Les résultats ont été
corrélés à ceux de l'IMx®. La corrélation
entre les deux automates est excellente sur tout le domaine de mesure,
de 4 à
1 000 mg/l (tableau 4, figure
1). La concordance des résultats est remarquable dans la
zone des faibles concentrations. Une dispersion plus grande est observée
pour les concentrations de ferritine supérieures à 1 000
mg/l, ayant nécessité une dilution sur les deux systèmes.
Cette cohérence des résultats peut surprendre si on se réfère
au comportement différent des réactifs Abbott et Ortho au
regard de la récupération des ajouts de standards internationaux
(tableau 3). Face à
cette difficulté, les calibrateurs Vitros® ne sont
pas titrés sur le standard international de rate mais « réajustés
» par rapport aux standards IMx®.
Valeurs de référence
La notice du fabricant indique que l'intervalle de référence
est de 17,9 à 464 mg/l chez l'homme, de 6,3 à
132 mg/l chez la femme de moins de 50 ans et de 10,2 à 265 mg/l
chez la femme de plus de 50 ans. Les sujets étudiés étaient
des patients en « apparente bonne santé », il ne s'agissait
donc pas d'individus de référence [8]. Ceci explique vraisemblablement
que les intervalles soient larges et très différents de
ceux de l'IMx®.
Modalités de l'étude
En conséquence, nous avons déterminé les valeurs
de référence en procédant à une sélection
rigoureuse des individus afin d'éliminer les sujets à risque
de carence et les pathologies induisant une fausse hyperferritinémie
telle que syndrome inflammatoire ou légère atteinte hépatique
[9]. Les sujets inclus étaient en bonne santé apparente
; les valeurs d'hémoglobine, vitesse de sédimentation et/ou
CRP, transaminases et gammaglutamyltranspeptidase étaient dans
les limites de référence [8]. Trois groupes ont été
constitués : 47 hommes de 20 à 30 ans, 82 hommes de 31 à
60 ans, 100 femmes de 50 à 60 ans.
Les aliquotes de sérum ont été conservées
à 25 °C jusqu'au jour de l'analyse. La précision
a été vérifiée sur les contrôles Vitros®
à 3 niveaux : les coefficients de variation étaient respectivement
de 2,3 2,7 et 3,7 %. Les écarts relatifs par rapport à
la valeur-cible ont été trouvés à + 1,2
0,9 et + 0,94 % pour les niveaux 1 à 3.
Étude statistique
Les histogrammes des 3 catégories de sujets (figure
2) illustrent l'asymétrie des distributions, observation
classique en matière de ferritine [9]. Nous avons donc procédé
à une estimation non paramétrique des quantiles [10] (tableau
5) ; il est certain que le faible effectif des hommes de 20 à
30 ans entraîne une incertitude réelle sur le calcul des
quantiles.
Intervalles de référence
Les intervalles de référence calculés incluent
90 % des échantillons de référence, les limites sont
définies par les quantiles 0,05 et 0,95. Pour les hommes de 20
à 30 ans, l'intervalle est de 24 à 273 mg/l. Pour les hommes
de 31 à 60 ans, l'intervalle est de 41 à 421 mg/l. Pour
les femmes, l'intervalle est de 14 à 197 mg/l.
L'intervalle de référence déterminé chez
les femmes de 50 à 60 ans, période à laquelle le
statut en fer est enfin équilibré, est valable pour l'ensemble
des femmes qu'elles soient en âge de procréer ou non [11].
Les intervalles calculés sont très voisins de ceux que
nous avions déterminés sur IMx® en utilisant
des critères de sélection identiques. Ceci est logique compte
tenu de l'excellente corrélation observée entre les deux
systèmes d'analyse.
CONCLUSION
Le réactif « Ferritine » proposé sur le Vitros
ECi® est bien adapté à l'exploration du métabolisme
du fer : imprécision faible pour les valeurs basses, très
bonne linéarité, absence d'effet crochet vérifiée
jusqu'à 60 000 mg/l, interférence limitée des analytes
endogènes. L'excellente corrélation avec les résultats
de l'analyseur IMx Abbott s'explique par le mode particulier de calibration
visant à pallier la récupération partielle des standards
internationaux. Des intervalles de référence déterminés
sur des sujets sélectionnés selon des critères adaptés
à la ferritine sont proposés.
Au cours de cette évaluation, nous avons pu apprécier
les qualités de l'analyseur Vitros® : très
faible volume mort sur godet (16 ml), prélèvement par cônes
à usage unique évitant toute possibilité de contamination,
stockage des réactifs à bord de l'automate à + 4
°C assuré pendant 2 mois, stabilité de la calibration
durant 28 jours, convivialité du logiciel.
Remerciements. Au cours de cette évaluation,
nous avons particulièrement apprécié l'aide technique
de Madame Marie-Claire Magnard.
Article reçu le 3 décembre 1998, accepté le 15 janvier
1999.
REFERENCES
1. Vassault A, Azzedine MC, Bailly M, et al. (commission
Validation de techniques SFBC). Protocole de validation de techniques.
Ann Biol Clin 1986 ; 44 : 686-745.
2. Capolaghi B, Vassault A, Grafmeyer D, Yvert JP (groupe de
travail : Adaptation du protocole validation de techniques). Ann Biol
Clin 1997 ; 55 : 167-8.
3. Baud M, Cohen R, Dumont G, Mercier M, Naudin, Vassault A (commission
Validation de techniques SFBC). Évaluation de la limite de détection.
Information Scientifique du Biologiste 1989 ; 15 : 157-63.
4. International Committee for standardization in haematology
(Expert Panel on iron). Preparation, characterization and storage of human
ferritin for use as a standard for the assay of serum ferritin. Clin
Lab Haemat 1984 ; 6 : 177-91.
5. Thorpe SJ, Walker D, Arosio P, Heath A, Cook JD, Worwood M.
International collaborative study to evaluate a recombinant L ferritin
preparation as an international standard. Clin Chem 1997 ; 43 :
1582-7.
6. Lynn S, Snyder B. Vitros ferritin correlation with Abbott
IMX/Axsym : discrepancy between CAP survey samples/commercial controls
and patient samples. Ortho Clinical Diagnostics, rapport interne (disponible
sur demande).
7. Ponka P, Beaumont C, Richardson DR. Function and regulation
of transferrin and ferritin. Sem Hematol 1998 ; 35 : 35-54.
8. Siest G, Henny J (commission Valeurs de référence
SFBC). Production de valeurs de référence de sujets
sains. Ann Biol Clin 1981 ; 39 : 235-44.
9. Vernet M, Revenant MC, Charlier C, et al. Valeurs de
référence de la ferritine sérique chez l'adulte.
Ann Biol Clin 1994 ; 52 : 493-8.
10. Albert A, Gueguen R, Sachs C (commission Valeurs de référence
SFBC). Traitement des valeurs de référence et détermination
de l'intervalle de référence. Ann Biol Clin 1983
; 41 : 63-79.
11. Rymer JC. Groupes à risque élevé de
carence martiale : le problème particulier des femmes en âge
de procréer et des femmes enceintes. In : Les ferritines sériques
et érythrocytaires en pratique médicale. Monographie
Abbott, 1991 : 29-33.
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