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Les méthodes d’extraction et de purification des ARN


Annales de Biologie Clinique. Volume 60, Numéro 5, 513-23, Septembre - Octobre 2002, Revues générales


Résumé   Summary  

Auteur(s) : J.-P. Bastard, S. Chambert, F. Ceppa, M. Coude, E. Grapez, S. Loric, F. Muzeau, F. Spyratos, K. Poirier, V. Copois, C. Tse, T. Bienvenu, Service de biochimie et génétique moléculaire, Hôpital Cochin, 123, boulevard de Port-Royal, 75014 Paris.

Résumé : Les récentes avancées des projets de séquençage du génome humain, ainsi que celui de nombreux micro-organismes, et le développement de la PCR (polymerase chain reaction) en temps réel rendent possible l’analyse qualitative et quantitative d’un très grand nombre de produits d’expression des gènes, ouvrant de nouveaux champs d’applications en biologie clinique dans des domaines aussi variés que la génétique, la cancérologie, la virologie, la bactériologie ou l’hématologie. L’étape délicate et souvent limitante reste encore l’obtention d’ARNm purifiés et non dégradés à partir d’échantillons biologiques. Cette revue fait le point sur les méthodes d’extraction et de purification des ARNm totaux et poly(A), sur les conditions de conservation et de stockage des ARN extraits, ainsi que sur les méthodes de contrôle de la qualité et de la concentration des ARN.

Mots-clés : ARN totaux - ARNm poly(A) - Méthode d’extraction - Biologie moléculaire.

Illustrations

ARTICLE

Les progrès considérables réalisés au cours de ces cinq dernières années dans le séquençage du génome humain, ainsi que celui de nombreux virus et bactéries, associés à la mise au point de nouveaux outils (développement de la PCR en temps réel par exemple) amènent de plus en plus de laboratoires à travailler sur les produits d’expression des gènes. À l’échelle qualitative utilisée depuis de nombreuses années (présence ou non d’un transcrit spécifique) s’est récemment ajoutée une échelle quantitative, ouvrant de nouveaux champs d’applications en génétique, cancérologie, virologie, infectiologie et hématologie [1-10]. Il est possible de quantifier avec précision désormais une charge virale, marqueur de suivi de l’efficacité thérapeutique, et de caractériser des gènes exprimés dans des cellules uniques ou dans des tissus tumoraux. Par ailleurs, le rôle central de l’ARN messager (ARNm) dans la transmission de l’information génétique le rend de plus en plus utilisé dans l’industrie pharmaceutique pour des études de criblage à haut débit.   Si les méthodes d’extraction et de purification des ARN se sont considérablement simplifiées depuis la méthode décrite par Chirgwin en 1979 [11], isoler des ARN purifiés et non dégradés à partir d’échantillons biologiques reste une étape préanalytique délicate de laquelle dépend la réussite des applications réalisées en aval. Cet article de synthèse a pour objectif de faire le bilan des différentes méthodes de lyse et d’homogénéisation couramment utilisées, ainsi que des nombreuses méthodes d’extraction et de purification des ARN totaux et des ARN messagers disponibles sur le marché. Par ailleurs, nous insisterons sur les conditions de prélèvements des échantillons biologiques, sur les conditions de conservation et de stockage des ARN extraits, ainsi que sur les méthodes de contrôle de la qualité et de la concentration des ARN.

Conservation de l’échantillon biologique avant extraction des ARN

Dès le prélèvement de l’échantillon biologique, des modifications du profil d’expression des gènes peuvent intervenir par dégradation spécifique et non spécifique des ARN et par induction transcriptionnelle. Il est ainsi nécessaire de stocker immédiatement l’échantillon biologique dans l’azote liquide ou à - 80 oC avant l’extraction. Toutefois, pour éviter les dégradations irréversibles et des analyses inexactes de l’expression des gènes, des solutions de stabilisation ont été développées par différents industriels. Ces réactifs, en perméabilisant rapidement les cellules, stabilisent immédiatement les ARN (RNAlater® Ambion et Qiagen pour les tissus et les cellules ; système Preanalytix BD/Qiagen® pour le sang), ce qui permet d’obtenir un délai avant l’extraction. Les échantillons ainsi traités peuvent être conservés plusieurs jours à température ambiante (1 jour à 37 oC ; 7 jours à 18-25 oC) voire plusieurs semaines à - 20 oC ou - 80 oC (après 24 h à 4 oC) sans dommage pour l’ARN.

Méthodes de lyse et d’homogénéisation

Toute méthode d’extraction des acides nucléiques comprend une étape préalable de lyse cellulaire et d’inactivation des nucléases afin de préserver l’intégrité des ARN contenus dans chaque cellule. À l’exception des tissus qui subiront une étape préalable de pulvérisation avant toute lyse, lyse et homogénéisation seront menées en parallèle dans tous les autres cas. Il existe différentes méthodes de lyse cellulaire mécaniques ou enzymatiques selon les types cellulaires (tableau 1). Si les méthodes mécaniques sont plutôt dévolues aux cellules et aux tissus, les méthodes enzymatiques sont réservées aux bactéries, aux levures et aux virus afin de dissoudre des structures (capsides, membranes bactériennes...) inaccessibles à la rupture mécanique. La lyse mécanique peut être réalisée après une congélation-flash dans l’azote liquide à l’aide d’un mortier-pilon ou d’un broyeur type Hybaid® Ribolyser ou Mixer Mill MM300® (Qiagen). Ce dernier fait subir à l’échantillon à la fois agitation et torsion à forte vitesse permettant la rupture des cellules, sous l’action de billes de céramique et de détergents. On emploie parfois de la N-lauroyl sarcosine en vue de séparer l’ARN des ribonucléoprotéines. La lyse des parois des bactéries et des levures peut être réalisée à l’aide d’enzymes telles que le lysozyme ou la lyticase, la glucalase ou la zymolase, respectivement. Dans certains cas, une lyse des bactéries peut être obtenue par une simple sonication. Pour les cellules et tissus qui s’avèrent difficiles à isoler par les méthodes conventionnelles, il existe un instrument, le FastPrep FP120® (Qbiogene) possédant un moteur alternatif et mettant en œuvre une combinaison de matrices et d’agents chaotropiques pour homogénéiser simultanément les tissus, lyser les cellules et stabiliser l’ARN en quelques secondes. L’agitation rapide conduit à une lyse efficace d’une grande variété de matériaux. Chaque kit FastRNA® (Qbiogene) contient différents types de matrices : particules de silice (pour les bactéries), de céramique (pour les levures, champignons et algues), ou de zirconium (pour les tissus animaux et végétaux). Dans la plupart des cas, la lyse est réalisée dans des conditions dénaturantes pour casser les cellules. En outre, la plupart des agents dénaturants utilisés sont de puissants inhibiteurs des RNAses. Initialement, la méthode de référence décrite par Chirgwin et al. en 1979 homogénéisait les prélèvements dans une solution 4 M de thiocyanate de guanidinium, agent puissant de dénaturation des protéines, additionné de beta2-mercaptoéthanol qui permet de rompre les ponts disulfures protéiques [11]. Chomczynski et Sacchi ont ensuite amélioré cette méthode pour accélérer la procédure d’extraction en combinant lyse au thiocyanate de guanidinium à la phase d’extraction au phénol-chloroforme (voir ci-dessous) [12]. Cette modification s’est avérée particulièrement intéressante lors de la réalisation de grandes séries d’échantillons ou lorsque l’on ne dispose que de petites quantités cellulaires ou tissulaires. À l’heure actuelle, la plupart des coffrets disponibles sur le marché reposent sur ces deux principes avec des proportions de thiocyanate de guanidinium et phénol-chloroforme qui leur sont propres (tableau 1). L’utilisation de solvant organique peut entraîner la perte ou la fragmentation de l’ARN. De même, des résidus salins provenant du thyristor de guanidinium peuvent interférer sur les résultats en modifiant la vitesse et l’efficacité des réactions enzymatiques ultérieures. Ainsi, certains coffrets offrent une méthode alternative de lyse utilisant des détergents en lieu et place du thiocyanate de guanidinium.

Les méthodes d’extraction et de purification des ARN totaux

Une fois les cellules convenablement lysées, les ARN, protégés de l’action des RNAses, peuvent être extraits. L’extraction des ARN peut être réalisée selon deux grands principes : 1) les différences de propriétés physico- chimiques entre les différents acides nucléiques et les protéines ; 2) l’adsorption sélective des acides nucléiques sur un support solide.

Différences de propriétés physico-chimiques

Gradient de densité au chlorure de césium (CsCl)

Considérée comme la méthode de référence, elle sépare ARN, ADN et protéines en fonction de leurs densités relatives [11]. Cependant, cette séparation nécessite l’emploi d’un réactif coûteux, le CsCl, et la disponibilité d’une ultra-centrifugeuse, matériel peu courant dans la plupart des laboratoires de biologie médicale. Pour cette raison, elle est réservée à des unités de recherche qui disposent du matériel nécessaire. Solubilité dans les solvants organiques Les acides nucléiques et les protéines présentent des différences de solubilité dans les solvants polaires [12, 13]. Cette propriété a été mise à profit : l’utilisation du phénol saturé en eau permet de séparer spécifiquement les ARN qui restent en phase aqueuse des protéines qui précipitent à l’interface solvant eau. Les traces de phénol sont ensuite éliminées par des extractions chloroformiques itératives. Les ARN présents dans la phase aqueuse sont précipités par de l’isopropanol (1 volume pour 0,5 volume de phase aqueuse) puis lavés par différentes solutions éthanoliques plus ou moins concentrées. Le culot d’ARN est finalement dissous dans un tampon adapté ou de l’eau DEPC (diéthylpyrocarbonate), l’addition de RNasin® pouvant éviter la digestion ultérieure par les RNases. Des réactifs prêts à l’emploi ont vu le jour ces dernières années et permettent l’extraction des ARN totaux en une seule étape (tableau 2). Ces différentes techniques permettent l’extraction des ARN totaux aussi bien à partir de micro-prélèvements qu’à partir de grandes quantités de matériel de départ. Les techniques utilisant des solvants restent toutefois limitées par le risque d’une séparation de phase incomplète et par conséquent d’une perte partielle de matériel.

Différences d’adsorption sur support solide (résine, billes...)

Ces méthodes sont basées sur la propriété qu’ont les particules de silice d’adsorber les acides nucléiques en présence de sels chaotropiques (iodure de sodium ou NaI, thiocyanate de guanidine) [14]. Les sels chaotropiques en milieu acide et alcoolique attirent les molécules d’eau permettant une réaction d’adsorption des acides nucléiques sur la silice. Les particules de silice sont disposées en colonne, sur filtre ou recouvrent des billes aimantées. La séparation est opérée par centrifugation ou tri magnétique. Après lavage éliminant les inhibiteurs, les sels et les résidus d’éthanol, l’élution est réalisée à l’aide d’une solution aqueuse alcaline très peu saline. Toutes ces techniques sont présentées dans le tableau 2. L’inconvénient tient aux caractéristiques des coffrets commercialisés, à savoir l’adaptation d’un coffret à un milieu biologique donné (cellules, biopsie tissulaire, sang total), la limitation des volumes extraits et la perte relative des ARN de petite taille. Cependant, sur le marché apparaissent des coffrets permettant de travailler sur différents types d’échantillons sans restriction de quantité de départ et sur de faibles volumes.

Les méthodes d’extraction et de purification des ARN messagers

Dans certaines circonstances, il peut être préférable d’extraire les ARN messagers polyadénylés (poly(A+)) et non les ARN totaux (tableau 3). En effet, dans une cellule de mammifère, les ARN messagers codant pour des transcrits spécifiques d’un type cellulaire donné représentent moins de 10 % des ARN totaux produits. Les 90 % restants correspondent aux ARN impliqués dans les étapes transcriptionnelles ou traductionnelles (ARN ribosomaux (28S, 18S et 5S), ARN de transfert, ARN nucléaires et ARN mitochondrial). Cette approche permet ainsi d’augmenter la sensibilité de la méthode en éliminant les ARN ribosomaux et les ARN de transfert les plus abondants, notamment pour les transcrits faiblement exprimés. Elle est notamment utilisée pour : 1) la réalisation de northern blot lorsque les ARNm sont présents en faible quantité ; 2) la réalisation de la technique de RNA mapping à l’aide de la méthode d’extension d’amorce dans le but de déterminer la position du site d’initiation de la transcription ; 3) la construction de banque d’ADNc, pour l’étude de l’expression des gènes à l’aide de puces d’ADNc ; 4) la réalisation de la technique de mRNA differential display ; 5) la réalisation de traduction in vitro ; 6) la réalisation de la technique de Rnase protection assay consistant à utiliser une sonde ARN antisens partiellement complémentaire de l’ARN étudié protégeant l’ARN vis-à-vis des Rnases. Parce qu’il comporte une queue poly(A) d’environ 200 nucléotides pour les cellules de mammifères, l’ARN messager peut être purifié par chromatographie d’affinité [15]. Il se fixe sélectivement par complémentarité de séquence sur des colonnes d’oligo (dT). Deux approches peuvent être utilisées : soit les ARNm sont purifiés à partir des ARN totaux préalablement extraits, soit directement à partir du prélèvement source sans passage intermédiaire sous forme d’ARN total. Les différentes méthodes aujourd’hui disponibles sont résumées dans le tableau 2. Différents procédés sont utilisés : 1) par exemple, les Coffrets Sigma utilisent des oligo (dT)30 liés de façon covalente à des billes de polystyrène de un micromètre pour capter par hybridation des ARN polyadénylés. Les polystyrènes donnent moins de liaisons non spécifiques que la cellulose et restent en suspension lors de l’hybridation avec les ARNm en l’absence d’agitation [15] ; 2) les coffrets Clontech utilisent des billes de latex coatées par des oligo (dT). Dans des conditions très salines, les ARN poly(A) se lient aux particules de latex à 68 oC. Les billes latex-ARNm sont remises en suspension dans un tampon de lavage et transférées sur un filtre permettant de recueillir facilement les billes de latex. Après deux lavages, les ARNm sont élués dans un tampon peu salin ou de l’eau Rnase-free ; 3) les coffrets Roche Diagnostics et Promega (PolyA Tract System 1 000®) utilisent des sondes oligo (dT)20 marquées à la biotine et des billes magnétiques coatées à la streptavidine. La biotine et la streptavidine présentent l’une des affinités les plus fortes en biologie. Les hybrides sont ainsi capturés grâce aux billes magnétiques. Il est par ailleurs possible d’obtenir des ARN amplifiés marqués. La technique d’Eberwine consiste en une étape de transcription inverse des ARN poly(A) avec des oligo(dT) qui contiennent le promoteur T7 polymérase. Le premier brin d’ADN est alors utilisé pour synthétiser le second brin grâce à l’ADN polymérase, l’ADN ligase et la Rnase H. L’ADNc double brin peut ensuite servir de matrice pour la transcription in vitro (Megascript®, Ambion) et obtenir des ARN amplifiés marqués ou non à la biotine [16]. L’isolement d’ARN cytoplasmique (ARNc) peut être envisagé avec le coffret Mature Message cRNA isolation® (Ambion), si l’on souhaite étudier l’épissage des ARN, ou utiliser les techniques de microarray ou de differential display.

Contrôle de la qualité et de la quantité des ARN

Contrôle qualitatif

Afin de vérifier la qualité de l’ARN après extraction, la technique la plus commune est la migration de l’échantillon sur gel d’agarose 1,2 % suivie d’une visualisation sous lumière UV. Les deux bandes d’ARN ribosomaux (18S à 1,9 kb et 28S à 5 kb en gel dénaturant) doivent être présentes. Si les ARN migrent sous la forme d’une trainée (smear) et que les deux bandes ne sont pas visibles, l’échantillon d’ARN a sans doute subi une dégradation majeure (figure 1). Dans certains cas, une étape de digestion par la Dnase est incluse dans le but d’éliminer les traces d’ADN contaminant.

Contrôle quantitatif

La quantité d’ARN pouvant varier significativement d’une extraction à une autre, il est primordial de pouvoir doser l’ARN correctement. La coloration du gel au bromure d’éthidium ou autre agent intercalant (SYBR® Gold par exemple) couplée à l’analyse de l’image du gel par logiciel (analyse de l’intensité des bandes) peut constituer une méthode de quantification mais peu sensible et très consommatrice d’échantillon. En général, la quantité d’ARN est déterminée par mesure de l’absorbance à 260 nm (une DO260 nm de 0,1 correspond à 4 µg/mL d’ARN) avec l’inconvénient d’intégrer dans le dosage des interférences causées par d’éventuels contaminants (protéines, nucléotides libres...). Le rapport DO260 nm/DO280 nm qui doit avoisiner 2 en tampon Tris/HCl à pH 7,5, renseigne sur la pureté de l’échantillon. Une sensibilité accrue (jusqu’à 1 000 fois supérieure) peut être obtenue par dosage en fluorimétrie. Pour cela, une molécule marquée par un groupement cyanine (RiboGreen® RNA Quantitation reagent - http://www.probes. com) est ajoutée à un aliquot de l’échantillon d’ARN à doser. Seul le complexe ARN-RiboGreen® va émettre de la fluorescence (lambda excitation maxi 500 nm, lambda émission maxi 520 nm) ; ainsi, le dosage ne sera pas faussé par les protéines ou par les nucléotides libres provenant de l’ARN éventuellement dégradé. Le seuil de détection est de 1 ng/mL. Un nouveau système d’analyse (Agilent 2100 Bioanalyzer® et RNA 6000 LabChip® - http://www.agilent. com) fondé sur la migration de l’échantillon sur micropuce présente l’avantage de combiner visualisation qualitative et mesure quantitative rapide et automatisée. Il permet de doser avec une bonne précision la quantité d’ARN et d’identifier simultanément les échantillons dégradés ou contaminés. La figure 2 illustre les résultats obtenus à l’aide du logiciel biosizing sur le système d’analyse RNA 6000 Labchip®. Deux pics représentant les ARN ribosomaux 28S et 18S (pour les cellules eucaryotes) sont visualisés sur l’électrophorégramme (figure 2a). L’analyse donne également la valeur du rapport des intensités des pics 28S/18S. La zone de pics indéfinis contenue entre les deux pics d’ARN ribosomaux représente les ARN messagers. En fonction de l’origine des ARN, il est possible d’observer un pic supplémentaire correspondant à un précurseur nucléaire d’ARN et selon la méthode d’extraction utilisée (notamment avec la méthode Trizol™) un pic à environ 200 bases plus ou moins intense correspondant aux ARN 5S, ARN 5,8S et aux ARN de transfert (figure 2b). Un profil d’ARN dégradés est caractérisé par une diminution des intensités des pics d’ARN ribosomaux avec une modification du rapport 28S/18S et par une élévation de la ligne de base au niveau des petits poids moléculaires caractérisant la transformation des grands fragments en petit fragments (figure 2 c et d). Le principal inconvénient de ce système réside dans son prix élevé qui le réserve à quelques laboratoires.

Conservation des ARN

Actuellement, aucune recommandation consensuelle n’a été définie en ce qui concerne la conservation des ARN après extraction et purification. En effet, à notre connaissance, aucune étude n’a été réalisée pour déterminer les conditions optimales de conservation des ARN.

ARNpurifiés

Le temps de conservation des ARN dépend du choix du milieu et de la température de conservation [17, 18]. Ainsi, après extraction, les ARN purifiés peuvent être conservés de plusieurs façons. Pour un stockage à court terme, l’eau pure RNase free avec ou sans EDTA (0,1 mM) ou le tampon Tris-EDTA (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,0) sont couramment utilisés. L’utilisation récente d’une solution de citrate de sodium (1 mM, pH 6,4) comme solution de stockage des ARN devrait apporter une meilleure stabilisation des ARN. Dans ces conditions, l’ARN est généralement stable à - 80 oC pendant au moins un an sans dégradation. Il est impératif d’utiliser une solution d’EDTA RNase free et d’éviter toute pollution microbienne. À cette fin, il est souhaitable d’utiliser des petits conditionnements de solution prête à l’emploi. La solubilisation des ARN dans le formamide permet de les conserver à - 20 oC pendant une période d’au moins un an, le formamide étant un bon stabilisateur des ARN [17]. Pour un stockage à plus long terme, les ARN peuvent également être conservés à une température inférieure à - 20 oC dans l’éthanol ayant servi à leur précipitation. Cependant, cette méthode de conservation est un peu plus délicate car elle nécessite une étape supplémentaire de précipitation et de réhydratation avant l’utilisation des ARN. De plus, étant donné la difficulté d’obtenir une dispersion uniforme des ARN dans l’éthanol, il est nécessaire d’utiliser tout le précipité pour une analyse quantitative précise.

ARNnon purifiés

Dans certains cas, il est possible de conserver les ARN sous une forme non purifiée immédiatement après l’étape de lyse. Là encore, le choix du milieu, c’est-à-dire du tampon de lyse (isothiocyanate de guanidine ou autre) et de la température de conservation (- 20 oC ou - 80 oC voire température ambiante) est primordial. En utilisant l’isothiocyanate de guanidine comme tampon de conservation des ARN non purifiés, les ARN sont stables entre - 20 oC et - 80 oC pendant au moins 18 mois.  

CONCLUSION

Encore récemment, l’extraction des ARN était très consommatrice de temps et nécessitait de nombreuses manipulations. Bien que les procédés d’extraction se soient simplifiés et que de nombreux réactifs prêts àl’emploi soient disponibles, l’extraction fait encore souvent appel à des étapes de centrifugation ou de filtration.L’extraction est encore le plus souvent réalisée de manière unitaire, limitant la rapidité de traitement et surtout la gestion d’un grand nombre d’échantillons.Pour pallier ce problème, de nombreuses stations robotiques apparaissent actuellement (Biorobot 3000®, 800® et 96404® de Qiagen ; ABIPrism 6100® et 6700® deApplied Biosystems ; MagnaPure de Roche Diagnostics; Geno-M-48® de genovision ; AmpliPrep® de Roche Diagnostics ; Extractor® de Technika/Biomérieux).Certains coffrets s’adaptent dans un format 96 puits sur des robots comme le kit SV96 Total RNA isolationsystem® (Promega SA) sur le robot Biomek 2000® ou Biomek FX® de Beckman. La qualité et la cadence desextractions d’ARN ne cessent de s’améliorer, d’autant que l’on est déjà à l’ère du couplage de ces robots d’extraction avec des systèmes d’amplification et de détectionde mutations.

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