Illustrations
Figure 1
Échelles de grandeurs observables par diverses techniques de microscopies optiques classiques ou de super-résolution. A. Représentation schématique d’une cellule eucaryote infectée, et des tailles relatives d’objets biologiques observables par les techniques de microscopies associées. B. Principe de fonctionnement des microscopes STED, PALM/STORM et confocaux. 1. La microscopie à déplétion par émission stimulée (STED) consiste à ramener les fluorophores excités dans leur état fondamental (non-fluorescent) par un processus non-destructif : le faisceau laser d’excitation place les fluorophores ciblés dans leur état excité et lorsqu’un laser décalé vers le rouge (appelé laser STED) est ajouté, il agit sur les fluorophores déjà excités provoquant leur retour à l’état non-fluorescent. En modulant la distribution d’intensité focale du laser STED de telle manière qu’il présente au moins un minimum d’intensité (par exemple une distribution d’intensité en forme de beignet), la fluorescence est appauvrie partout sauf au minimum local (PSF effective pouvant atteindre 20-30 nm de diamètre). 2. Les microscopies SMLM permettent la détection de molécules uniques marquées à l’aide de fluorophores photo-convertibles. Ces techniques sont basées sur la construction d’une image à partir d’un ensemble de 100 à 10 000 acquisitions individuelles où seuls de petits sous-ensembles de fluorophores isolés sont activés de manière stochastique. Les coordonnées spatiales du centre des tâches de diffraction produites par ces fluorophores, sont déterminées avec précision sur toutes les images, qui sont ensuite utilisées pour reconstruire l’image finale. En fonction des techniques, la commutation marche/arrêt stochastique des marqueurs fluorescents est réalisée par différents moyens : la microscopie PALM contrôle la fluorescence de molécules photo-convertibles (ex : PA-GFP, PA-mCherry, mEOS, mMAPLE, etc.) par stimulations courtes. En réponse, les molécules émettent de la lumière à tour de rôle (« clignotent »), et il est alors possible de séparer les photons venant de chaque molécule émettrice. La microscopie STORM est une technique basée sur les mêmes principes, mais utilise à l’origine des marqueurs organiques comme les cyanines appariées. Ces deux types de microscopies sont applicables aux systèmes biologiques vivants. 3. La microscopie confocale, également basée sur l’excitation de marqueurs fluorescents, emploie un microscope photonique capable de bloquer la fluorescence hors focus et donc de capter uniquement la fluorescence du plan focal. Des images de très faible profondeur de champ (environ 400 nm) appelées « sections optiques » sont ainsi réalisées.
SNOM : microscopie optique en champ proche ; SIM : microscopie d’illumination structurée. PSF : fonction d’étalement du point (point spread function en anglais)
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Figure 2
Comparaison de différentes techniques de microscopies appliquées à l’observation de virus humains : de la microscopie optique classique à la microscopie de super-résolution. A. Comparaison d’images obtenues par microscopie confocale et microscopie à déplétion par émission stimulée STED. Panneaux de gauche : cellule VeroE6 infectées par le coronavirus SARS-CoV-2 (en vert). Panneaux de droite : zoom sur la membrane d’une cellule VeroE6 infectée par le coronavirus SARS-CoV-2 (en magenta) et marquées pour l’actine cellulaire (en vert). Taille des virus = environ 100 nm de diamètre. La microscopie STED permet d’obtenir une image mieux résolue et de distinguer des particules virales uniques. Elle permet en effet de dépasser la limite de diffraction imposée par la nature ondulatoire de la lumière et d’atteindre une résolution latérale inférieure à 50 nm (là où la microscopie confocale ne permet pas de descendre en dessous de 200-250 nm). B. Panneaux de gauche : cellules HEK 293T transfectées avec la protéine virale du VIH-1 Gag fusionnée à la protéine mEOS2 (verte) photoconvertible (en rouge). Comparaison d’images obtenues par microscopie de fluorescence à champ large, microscopie TIRF et microscopie de localisation de molécules uniques PALM (couplée à la microscopie TIRF). Contrairement à la microscopie en épifluorescence qui illumine la totalité de l’échantillon (y compris en dehors du plan focal), la microscopie de fluorescence par réflexion totale interne (TIRF) permet une excitation sélective de l’échantillon. En effet, l’orientation du rayon incident est telle qu’elle permet la production d’une onde évanescente (en bleu) illuminant seulement une fine section optique de la surface de l’échantillon (inférieure à 200 nm). Ceci permet d’améliorer la résolution axiale, d’éliminer le bruit de la fluorescence hors focus, et de ce fait d’obtenir un meilleur rapport signal sur bruit. Le couplage de la microscopie TIRF avec la microscopie de super-résolution PALM (permettant d’activer aléatoirement certains fluorophores, de capturer leurs images puis de les « éteindre ») permet enfin d’acquérir une image en deçà de la limite de diffraction, reconstruite après avoir déterminé avec précision la position de toutes les molécules individuelles. Panneaux de droite : Cellules HeLa marquées pour l’actine cellulaire (en bleu). Comparaison d’images obtenues soit par TIRF (gauche), soit par un couplage TIRF-STORM. La microscopie STORM, qui repose sur le même principe que le PALM (la différence résidant essentiellement dans le type de fluorophores utilisés), permet ici d’atteindre une résolution de 16 nm (contre environ 250 nm pour le TIRF).
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Figure 3
Microscopies de dynamique des molécules et particules individuelles par FRAP, FCS et SPT. A. FRAP : retour de fluorescence après photoblanchiment (de l’anglais fluorescence recovery after photobleaching ). Technique qui éteint localement de façon irréversible des chromophores photo-destructibles à l’aide d’un faisceau lumineux très intense et très bref. Le retour de fluorescence dans la zone éteinte, dû à la mobilité des molécules, est alors analysé à l’aide de modèles cinétiques. Ceci permet d’obtenir des informations quantitatives et qualitatives sur la nature du mouvement des molécules dans la zone photo-détruite. FCS : spectroscopie de corrélation de fluorescence (de l’anglais fluorescence correlation spectroscopy ). Cette technique repose sur l’analyse des fluctuations temporelles de fluorescence dans une zone donnée de l’échantillon. Dans cette approche, on enregistre la fluorescence émise dans le volume confocal ou STED ne contenant qu’un petit nombre de particules. La fluctuation de l’intensité de fluorescence révèle la variation du nombre de molécules présentes dans le volume observé (concentration). L’auto-corrélation temporelle de ces fluctuations permet d’obtenir un temps moyen de résidence des molécules dans la zone observée, qui renseigne sur la grandeur et la nature du mouvement des molécules. L’analyse permet ici d’obtenir le nombre moyen de particules (concentration) mais aussi le temps caractéristique du mouvement. SPT : suivi de particules uniques (de l’anglais single-particle tracking ). Cette méthode se base sur l’analyse du mouvement de particules individuelles dans un milieu. La série chronologique de coordonnées spatiales, en 2D (x, y) ou en 3D (x, y, z), est appelée trajectoire. La trajectoire est généralement analysée à l’aide de méthodes statistiques pour extraire des informations sur la dynamique sous-jacente des particules uniques en traçant le MSD (mean square displacement) en fonction du temps. Ces dynamiques peuvent notamment révéler des informations directes sur le milieu dans lequel la particule se déplace. Dans le cas d’un mouvement aléatoire, l’analyse de trajectoire peut être utilisée pour mesurer le coefficient de diffusion. B. Exemple d’application du SPT couplé à la microscopie PALM. Cellules HEK 293T transfectées avec la protéine Gag du VIH-1 fusionnée à l’étiquette fluorescente mEOS2. De gauche à droite : forme native de mEOS2 (verte) imagée ; forme rouge de mEOS2 après photo-conversion (l’activation stochastique de ces fluorochromes permet de définir et de suivre avec précision leur localisation) ; localisations cumulées des molécules uniques mEOS2 activées stochastiquement ; reconstruction de trajectoires des molécules uniques sur 100 images (temps entre chaque image = 22 ms). Barres d’échelle = 5 μm.
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Tableaux
Auteurs
1 IRIM, Université de Montpellier, UMR 9004 CNRS, 1919, route de Mende, 34293 Montpellier
2 Cemipai, Université de Montpellier, UAR 3725 CNRS, 1919, route de Mende, 34293 Montpellier
La révolution très récente de la microscopie optique, associée à l’optimisation de la résolution spatiale et de la vitesse d’observation, a ouvert l’accès à la visualisation d’objets nanométriques. Ainsi, l’utilisation d’une nouvelle génération de microscopes de super-résolution combinée à l’amélioration des marqueurs fluorescents pour les protéines ou les lipides, permet désormais d’étudier le cycle réplicatif des virus à l’échelle de la molécule unique dans des modèles cellulaires fixés, mais aussi vivants, avec une précision nanométrique. Après une brève description chronologique et technique de ces nouvelles approches, nous détaillerons dans cette revue quelques exemples de microscopies de super-résolution ayant permis de revisiter notre compréhension du cycle de réplication de certains virus affectant l’humain, dans l’étude des relations hôte-pathogènes à l’échelle du virus et de la molécule unique.