Néphrotoxicité, modifications de paramètres hématologiques et biochimiques induites chez des rats intoxiqués par l‘ochratoxine A

ARTICLE

Auteur(s) : Salwa Abid-Essefi, Wafa Hassen, Mohsen Kerkeni, Abdellatif Achour, Farielle Ellouz, Hassen Bacha

Laboratoire de recherche sur les substances biologiquement compatibles (LRSBC), Faculté de médecine dentaire, Rue Avicenne, 5019 Monastir, Tunisie <hassen.bacha@fmdm.rnu.tn>

L'OTA a été identifiée dans de nombreux produits végétaux (céréales, fruits secs...), dans des denrées alimentaires, ainsi que dans le sang et les tissus d'animaux ou de personnes ayant consommé des aliments contaminés. Cela a été observé notamment aux Balkans, en Scandinavie, en Allemagne, en Angleterre, en France et en Tunisie [3-7].

L'OTA (figure 1) possède une structure constituée d'une partie dihydroisocoumarinique chlorée liée par une liaison pseudo-peptidique à une molécule de L-phénylalanine. Elle est impliquée dans plusieurs processus toxiques : elle inhibe la synthèse des protéines en entrant en compétition avec la phénylalanine dans la réaction d'aminoacylation du tRNA spécifique de la phénylalanine [8] ; elle est néphrotoxique [9] et provoque in vivo une néphropathie tubulo-interstitielle [10, 11]. Elle est actuellement considérée comme un possible agent causal de la néphropathie endémique des Balkans (NEB) [12-14]. Elle a également été suspectée d'être impliquée dans une néphropathie interstitielle chronique d'étiologie indéterminée, de type similaire, découverte en Tunisie [7, 15-18].

Cette mycotoxine perturbe en outre la coagulation sanguine [19, 20], les métabolismes lipidique et glucidique [21, 22], et elle est immuno-suppressive [23-25], tératogène [26, 27], génotoxique [28-30] et cancérigène [31, 32]. La figure 2, résume l'ensemble des effets toxiques attribués à l'OTA. 

Dans ce travail, nous nous sommes attachés à reproduire l'exposition humaine sur un modèle animal, en vue de rechercher des effets similaires sur le rein. Nous nous sommes également intéressés à mettre en évidence d'autres effets toxiques impliquant cette toxine. Pour cela nous avons réalisé deux types d'études. 

Dans une première étude réalisée sur des rats intoxiqués par voie orale en conditions d'intoxication chronique, nous avons recherché l'effet de l'OTA sur le poids corporel des animaux, le poids relatif et la taille moyenne des reins, sa distribution au niveau des reins, du sang et de l'urine. Par ailleurs, nous avons recherché à différents temps d'intoxication (après 15 jours et après 3 mois), d'éventuelles lésions du tissu tubulaire rénal après analyses histologiques. 

Dans une seconde étude et dans le but de mettre en évidence d'autres effets toxiques de l'OTA, nous avons intoxiqué des rats par voie intra-péritonéale en conditions sub-aiguës. Dans ces conditions, nous avons recherché de possibles modifications de paramètres hématologiques et biologiques, et particulièrement de ceux impliqués dans la fonction rénale.

Matériel et méthode

Matériel

Produits chimiques

• L'ochratoxine A (OTA) standard provient de Sigma Chemicals (St Louis, Missouri, États-Unis). Elle est dissoute dans le bicarbonate de sodium 0,1 M ; pH = 7,4. La concentration de l'OTA dans ce solvant est déterminée spectrophotométriquement (λ d'excitation = 378, coefficient d'extinction molaire ε  = 14 700).

• Kits de dosage enzymatique et kit de dosage de la créatinine : Biomaghreb (Tunisie).

• Kits de dosage immuno-enzymatique de la β₂-microglobuline : Immunotech 1131 (France).

• Les autres produits et solvants utilisés proviennent de Merck (Darmstadt, Allemagne) et de Sigma-Aldrich, Prolabo (France).

Matériel pour HPLC

Le système est constitué de pompes analytiques (Bishoff Model 2250), d'un injecteur automatique, d'un spectrofluomètre (VARION, Prostar) programmable avec un logiciel d'acquisition et de traitement de données « Normasoft » développé par ICS (France), d'une pré-colonne Lichrosorb C18, d'une colonne semi-préparative Spherisorb (ODSII C18) de porosité 5 µm et de dimensions 250 × 4 mm.

Méthode

Traitements des animaux

Toutes nos expérimentations ont porté sur des rats mâles de souche Wistar (100 ± 10 g), âgés de 2 mois environ.

Première étude

Les animaux utilisés dans la première étude sont répartis en 3 lots de 15 rats chacun, traités par voie orale par l'OTA dans un volume de 200 µL de solvant, tous les 48 heures pendant 15 jours, 1 mois ou 3 mois. Les doses d'OTA utilisées sont définies par rapport à la DL₅₀¹ (4 mg/kg de poids corporel). Nous avons choisi de travailler à 10 % et à 20 % de la DL₅₀. Ces doses sont choisies relativement basses en raison de la longue période de traitement et en raison de l'accumulation possible de l'OTA par les reins. Les lots sont les suivants :

– un lot témoin recevant un volume égal de solvant (bicarbonate de sodium 0,1 M ; pH : 7,4) ; 

– un lot recevant une concentration d'OTA de 10 % de la DL₅₀, soit 0,4 mg/kg de poids corporel ;

– un lot recevant une concentration d'OTA de 20 % de la DL₅₀, soit 0,8 mg/kg de poids corporel.

Seconde étude

Dans la seconde étude, les animaux sont répartis en 5 lots de 5 rats. La dose d'OTA utilisée pour ces lots est également définie par rapport à la DL₅₀. Nous avons préféré administrer l'OTA par voie intrapéritonéale (IP) et nous avons travaillé à des doses plus importantes que dans la première étude, cela en raison, d'une part, du court temps du traitement et, d'autre part, pour obtenir des effets immédiatement observables. L'administration de l'OTA est réalisée dans un volume de 200 µL de solvant, en une dose unique, pendant 48 heures. Les différents lots sont les suivants :

– un lot témoin recevant un volume égal de solvant (bicarbonate de sodium 0,1 M ; pH : 7,4) ;

– un lot recevant une concentration d'OTA de 15 % de la DL₅₀, soit 0,6 mg/kg de poids corporel ;

– un lot recevant une concentration d'OTA de 30 % de la DL₅₀, soit 1,2 mg/kg de poids corporel ;

– un lot recevant une concentration d'OTA de 50 % de la DL₅₀, soit 2 mg/kg de poids corporel.

¹ DL₅₀ = dose létale 50 %.

Prélèvement des échantillons biologiques 

Prélèvement des urines

Les animaux sont placés individuellement dans des cages métaboliques. Les urines collectées sont centrifugées, aliquotées et conservées à - 20 °C jusqu'au moment des dosages.

Prélèvement des échantillons de sang

Après 48 heures de traitement à l'OTA, les animaux sont sacrifiés et le sang est recueilli dans des tubes héparinés pour l'étude des paramètres hématologiques et dans des tubes secs pour l'étude des paramètres biologiques. Le sang prélevé sur tubes secs est centrifugé. Le sérum est aliquoté et conservé à - 20 °C jusqu'au moment des analyses.

Prélèvement des reins

Après sacrifice, les animaux sont disséqués et les reins sont prélevés, pesés, leurs tailles déterminées. Un rein est conservé dans du liquide de Bouin (75 mL éthanol ; 0,5 g acide picrique ; 30 mL formol ; 7,5 mL acide acétique 1N) et servira pour les analyses histologiques tandis que l'autre rein est broyé dans 1,5 mL de tampons SET (NaCl : 0,1 M ; EDTA : 20 mM ; Tris-HCl : 50 mM, pH : 8). Le broyat est centrifugé, le surnageant récupéré est réparti en 2 fractions, l'une servira au dosage de l'OTA tandis que l'autre est conservée à - 20 °C et servira au dosage des protéines rénales totales.

Extraction et dosage de l'OTA par HPLC

La méthode d'extraction de l'OTA est fondée sur le coefficient de partage de l'OTA selon le pH, entre les phases organiques et aqueuses [16].

La détection de l'OTA est fonction de ses propriétés de fluorescence (longueur d'onde d'excitation de 340 nm et longueur d'onde d'émission de 465 nm).

Après injection des échantillons (ou des standards d'OTA) sur la colonne (volume d'injection de 50 µL), l'élution se fait avec le solvant suivant : méthanol, acétonitrile, acétate de sodium 5 mM, acide acétique glacial (300 : 300 : 400 : 14 ; v/v/v/v), préalablement filtré et dégazé, avec un débit d'élution de 1 mL/min. Les paramètres chromatographiques sont tels que le temps de rétention de l'OTA est d'environ 6 minutes.

La quantification se fait par rapport à des solutions standard d'OTA de concentration connue (50, 100 et 150 ng/mL). Dans nos conditions, la limite de détection est de 0,1 ng/mL.

Analyses des échantillons 

Dosage des protéines

Les protéines totales rénales sont dosées selon la méthode de Bradford [33], en utilisant le réactif BioRad et une solution étalon de sérum albumine bovine (BSA, Sigma Chemical Company).

Paramètres biologiques

La créatinine sérique et urinaire est dosée selon la méthode colorimétrique décrite par Henry [34]. La lactate déshydrogénase (LDH), la phosphatase alcaline (PAL) et la gamma glutamyl transférase (γGT) sont dosées au moyen de coffrets Chronolab AG (Suisse) et selon les indications données par le fournisseur.

Le dosage de la β₂-microglobuline urinaire a été réalisé au moyen d'un coffret Immunotech 1131 ; il s'agit d'un dosage immunoenzymatique de type compétition selon les indications données par le fournisseur.

Paramètres hématologiques

Les comptages de cellules sanguines (globules blancs, globules rouges et plaquettes) ainsi que les analyses hématologiques de routine sont effectués grâce à un compteur automatique (Technicon H 6000).

Analyses histologiques

Après prélèvement, les reins sont fixés, déshydratés puis inclus dans la paraffine. De fines coupes de 5 µm d'épaisseur sont effectuées puis colorées par du trichrome de Masson. Les observations sont réalisées grâce à un microscope photonique à 2 grossissements × 200 et × 400).

Analyses statistiques

Tous les paramètres mesurés des différents groupes sont comparés entre eux en utilisant un test statistique non paramétrique (Wilcoxon Rank-Sum test) [35]. Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne plus ou moins les écarts types.

Résultats et discussion

Première étude : lésions rénales induites par l'OTA

La néphropathie interstitielle chronique d'étiologie indéterminée (NIC) découverte en Tunisie présente des caractéristiques cliniques, biologiques et histologiques très semblables à la néphropathie endémique des Balkans (NEB) [6, 7, 16-18]. Notre première étude tente de reproduire ce type de néphropathie chronique humaine observée aux Balkans ou en Tunisie, sur un modèle animal, et nous observons en effet chez le rat l'ensemble des signes et lésions trouvés aussi bien dans la NIC tunisienne que dans la NEB.

Modifications morphologiques induites par l'OTA

Le traitement pendant 3 mois à l'OTA provoque une diminution de prise de poids corporel chez des rats traités par rapport aux rats témoins (tableau 1). En effet, l'augmentation relative du poids dans le groupe traité à l'OTA à 0,4 mg/kg de poids corporel est réduite de 30 % (p < 0,005), cette diminution étant de 39 % chez les rats traités à 0,8 mg/kg de poids corporel (p < 0,005). L'étude macroscopique des reins des rats traités à l'OTA par rapport à ceux des témoins montre une atrophie rénale ; en effet, nous observons une diminution de la taille des reins de 17 à 22 % respectivement chez les rats traités à la faible dose et à la forte dose par rapport aux témoins (p < 0,005), ainsi qu'une diminution de poids rénal relatif d'environ 16 % pour la faible dose et d'environ 25 % pour la forte dose par rapport aux témoins (p < 0,01) (tableau 1). Ces résultats sont similaires à ceux observés par Munro et al. [36] qui avaient noté que ces effets étaient réversibles pour des doses d'OTA de 0,015 et 0,075 mg/kg de poids corporel et irréversibles à la dose de 0,37 mg/kg de poids corporel.

Tableau 1. Taille moyenne des reins, poids rénal relatif et augmentation relative du poids corporel des rats traités toutes les 48 heures pendant 3 mois avec 0,4 ou 0,8 mg d'OTA/kg de poids corporel, comparés aux témoins.

Ces diminutions du poids relatif des reins et de leur taille indiquent une dégénérescence de ces organes induite par l'OTA. Cette dégénérescence évolue vers une atrophie rénale visible surtout après un traitement prolongé à l'OTA. Ce processus de dégénérescence progressive des reins induit par l'OTA a été également observé chez des patients atteints d'une néphropathie interstitielle chronique et présentant des taux d'OTA élevés dans le sang [17].

Distribution de l'OTA

Le tableau 2 montre les taux moyens résiduels d'OTA dans le sang, dans l'urine et dans les reins de rats traités 3 mois à l'OTA (toutes les 48 heures à 0,4 ou à 0,8 mg/kg de poids corporel) comparés aux témoins. Nous constatons chez les rats traités des taux moyens d'OTA élevés au niveau du sang (916,5 ± 170 ng/mL et 1920 ± 140,5 ng/mL) respectivement pour les doses administrées à 0,4 et 0,8 mg/kg de poids corporel. Au niveau des reins, ces taux sont de 29,85 ± 6,9 ng/g pour la faible dose et de 170,05 ± 88 ng/g pour la forte dose. Nous constatons que ces taux, aussi bien dans le sang que dans les reins, sont « dose-dépendants ». Les taux moyens d'OTA au niveau de l'urine sont relativement bas (310,5 ± 4,9 ng/mL et 290 ± 143,5 ng/mL) compte tenu des quantités administrées à 0,4 et 0,8 mg/kg de poids corporel. Ces taux ne semblent pas croître avec l'augmentation des doses d'OTA administrées.

Tableau 2. Taux moyens d'OTA dans le sang, urine et rein de rats traités à l'OTA pendant 3 mois toutes les 48 heures (0,4 ou 0,8 mg/kg de poids corporel) comparés aux témoins.

Les niveaux d'OTA élevés dans le sang et dans les reins et les niveaux faibles dans l'urine indiquent qu'il y a une rétention de la toxine par les reins ; cette rétention et cette mauvaise élimination de la toxine montrent un dysfonctionnement rénal.

Modifications histologiques induites par l'OTA

L'observation de coupes histologiques de reins de rats traités à l'OTA toutes les 48 heures pendant 3 mois montre des cellules tubulaires anormales présentant une mégacytose et une caryomégalie. Il s'agit de cellules tubulaires avec de gros noyaux dont la taille peut atteindre dix fois la taille d'un noyau normal (figure 3a). Ce processus est lié à l'OTA puisque qu'il est totalement absent chez les animaux témoins non traités ; il est d'autant plus important chez les animaux traités que les doses d'OTA administrées sont élevées (figure 3 a et 3 b).

La caryomégalie est un processus précoce de dégénérescence rénale. En effet, après des traitements de 15 jours et d'1 mois à l'OTA, le tissu tubulaire montre de manière inhabituelle des mitoses en plus des gros noyaux. L'existence de ces mitoses anormales laisse supposer que, pour les traitements de courte durée, une régénération du tissu tubulaire rénal est encore possible (figure 4). Si le traitement se prolonge (3 mois), les mitoses ne sont plus observées, les cellules caryomégaliques deviennent de plus en plus nombreuses et une dégénérescence des cellules tubulaires se confirme par l'apparition de cellules nécrosées et d'autres apoptotiques.

Ce processus caryomégalique avec l'apoptose est également observé dans le tissu tubulaire rénal chez des patients atteints d'une néphropathie interstitielle chronique, type balkanique, présentant un niveau élevé d'OTA dans le sang et sur lesquels des biopsies ont été réalisées (figure 5). Ces résultats confirment également ceux de Munro et al. [36]. La reproduction identique sur l'animal de ce processus, préalablement observé chez des néphropathes [37-39], confirme bien le rôle de l'OTA comme agent étiologique de ce type de néphrotoxicité, même s'il ne permet pas d'en élucider le mécanisme.

Seconde étude : modifications de paramètres biologiques et hématologiques induites par l'OTA

Dans le but d'apporter des arguments supplémentaires confirmant à l'échelle moléculaire le rôle de l'OTA dans la néphrotoxicité, nous avons recherché au cours de cette étude d'éventuelles modifications de paramètres biologiques et hématologiques, particulièrement ceux impliqués dans la fonction rénale. Nous avons par ailleurs cherché à savoir si les modifications de ces paramètres induites par l'OTA pouvaient donner des explications mécanistiques à certains dérèglements métaboliques accompagnant la néphrotoxicité.

Paramètres biologiques 

Dosage de la créatinine sérique et urinaire

La créatinine est un produit du métabolisme musculaire ; elle est éliminée dans les urines après filtration glomérulaire, et elle est considérée comme un paramètre fiable pour apprécier le dysfonctionnement glomérulaire. Une élévation de la créatinine sérique et une diminution de la créatinine urinaire indiquent une atteinte glomérulaire.

Le tableau 3 montre les résultats que nous avons obtenus après 48 heures de traitement de rats par l'OTA. Les valeurs de la créatinine sérique et urinaire semblent stables pour tous les lots d'animaux traités, quelle que soit la dose d'OTA (0,6 ; 1,2 et 2 mg/kg de poids corporel) et restent comparables à celles des témoins ; cela prouve que l'OTA n'affecte pas la fonction glomérulaire.

Tableau 3. Effets de l'ochratoxine A sur les paramètres biologiques impliqués dans la fonction rénale de rats mâles, 48 h après injection IP de 0,6 ; 1,2 et 2 mg/kg de poids corporel.

Dosage des enzymes tubulaires et de la β₂ microglobuline urinaire

Le dosage des enzymes urinaires (LDH, PAL et γGT) montre une augmentation significative chez les animaux traités à l'OTA à la forte dose (2 mg/kg de poids corporel) par rapport aux témoins et aux animaux traités à des doses de toxine plus faibles (0,6 et 1,2 mg/kg de poids corporel) (tableau 3).

L'augmentation de ces activités enzymatiques tubulaires (LDH, PAL et γGT) dans les urines indique la présence de lésions tubulaires proximales qui traduisent une dégénérescence du tissu tubulaire déjà observée au cours de la première étude et mise en évidence par l'apparition de cellules caryomégaliques évoluant vers l'apoptose.

Le dosage de la β₂-microglobuline urinaire (tableau 3) montre une augmentation significative chez les animaux traités à l'OTA déjà à la faible dose (0,6 mg/kg de poids corporel) et reste stable pour les autres doses (1,2 et 2 mg/kg de poids corporel). Tout se passe comme si l'induction était déjà maximale à 0,6 mg/kg de poids corporel. Notons que la β₂-microglobuline urinaire est une protéine globulaire ; elle constitue la chaîne légère des molécules HLA I, elle est éliminée par la filtration rénale glomérulaire, réabsorbée et catabolisée par les cellules tubulaires proximales. La β₂-microglobuline urinaire est un paramètre spécifique qui permet de détecter un dysfonctionnement tubulaire. L'augmentation de cette protéine dans l'urine indique une dégénérescence de cellules tubulaires proximales. Corrélée à des taux résiduels élevés d'OTA sériques, elle pourrait constituer un marqueur précoce de néphrotoxicité.

Dosage des protéines rénales totales

Le tableau 3 montre une diminution significative de la quantité de protéines rénales totales chez les animaux traités à l'OTA à la forte dose (2 mg/kg de poids corporel) par rapport au témoin (p < 0,001). Les animaux traités à l'OTA (0,6 et 1,2 mg/kg de poids corporel) ne montrent pas de modifications significatives ni par rapport aux témoins ni entre eux. La diminution de la quantité de protéines rénales totales correspond probablement à une cytotoxicité déjà observée par d'autres auteurs qui décrivent une inhibition de la synthèse des macromolécules cellulaires y compris les protéines [40, 41]. Une telle cytotoxicité constitue un élément supplémentaire appuyant la dégénérescence du tissu rénal.

Paramètres hématologiques 

Globules blancs

Les animaux traités à l'OTA (0,6 ; 1,2 et 2 mg/kg de poids corporel) ont un nombre de globules blancs significativement plus élevé que celui des témoins (p < 0,025) (tableau 4). Cette augmentation est « dose-dépendante » et témoigne d'un état inflammatoire qui pourrait s'expliquer par la présence d'un processus de dégénérescence au niveau des cellules tubulaires. Ces résultats sont similaires à ceux obtenus par Galtier et al. [19] qui affirment que lors d'une ochratoxicose, l'organisme intoxiqué réagit par l'augmentation du nombre de globules blancs.

Tableau 4. Effets de l'ochratoxine A sur les paramètres hématologiques de rats mâles, 48 heures après injection IP de 0,6 ; 1,2 et 2 mg/kg de poids corporel.

Hématocrite, globules rouges, volume globulaire moyen

Le tableau 4 montre que les valeurs de l'hématocrite sont significativement élevées chez les animaux traités à l'OTA par rapport aux témoins (p < 0,025). Cette augmentation est « dose-dépendante ». Le nombre de globules rouges (GR) demeure constant chez les différents groupes traités à l'OTA par rapport aux témoins quelle que soit la dose, alors que le volume globulaire moyen (VGM) augmente de manière significative par rapport aux témoins (p < 0,025). Ces trois paramètres montrent qu'il y a augmentation de la taille des globules rouges sans hémolyse : il s'agit d'une macrocytose.

Hémoglobine, concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine

Le tableau 4 montre une diminution significative du taux d'hémoglobine chez les animaux traités à l'OTA (0,6 ; 1,2 et 2 mg/kg de poids corporel) entre eux (p < 0,025) et par rapport aux témoins (p < 0,005). Cette diminution est « dose-dépendante ». La concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine (CCMH) ne montre pas de variation significative chez les animaux traités à l'OTA à différentes doses par rapport aux témoins.

D'après ces deux paramètres, on peut dire que l'OTA induirait une anémie normochrome dans la mesure où la concentration corpusculaire est stable et où cette anémie est macrocytaire, en raison de la présence de globules rouges plus volumineux. Cette situation est également observée chez des patients atteints de néphropathie endémique des Balkans (NEB) et présentant l'OTA dans le sang qui développent également ce type d'anémie [42, 43].

Plaquettes sanguines

Le tableau 4 montre une diminution significative du nombre de plaquettes chez les animaux traités à l'OTA aux doses (1,2, 2 mg/kg de poids corporel) par rapport aux témoins. La diminution du nombre de plaquettes indiquerait des perturbations possibles du processus de coagulation d'autant que le temps de saignement (environ 2 ± 0,2 min) chez les témoins a été trouvé plus long (environ 6 ± 0,5 min) chez les animaux traités à l'OTA. Des résultats similaires ont été rapportés également par Galtier et al. et par Gupta et al. [19, 20].

Conclusion

Nos résultats apportent des arguments supplémentaires permettant de suspecter le rôle de l'OTA dans les néphropathies interstitielles de cause indéterminée. En effet, la néphropathie interstitielle observée en Tunisie, très ressemblante à la néphropathie endémique des Balkans a été reproduite expérimentalement sur un modèle animal sur lequel nous avons retrouvé les mêmes caractéristiques cliniques, morphologiques, biologiques et histologiques déjà observées chez des patients atteints de ce type de néphropathie et présentant l'OTA dans le sang.

Les résultats obtenus sur le modèle animal ont renforcé l'implication de l'OTA dans cette néphrotoxicité, puisque nous avons mis en évidence des modifications significatives aussi bien des paramètres biologiques qu'hématologiques impliqués dans la fonction rénale.

En plus du rôle prédominant qu'elle joue dans la néphrotoxicité, l'OTA est également impliquée dans divers autres effets toxiques tels que l'induction d'un état inflammatoire, d'une anémie du type macrocytaire et la perturbation du processus de la coagulation.

Références

1. Van Der Merwe KJ, Steyn PS, Fournie L, Scott DB, Theron JJ. Ochratoxin A, a toxic metabolite produced by Aspergillus ochraceus Wilh. Nature 1965 ; 205 : 1112-3.

2. Steyn PS. Ochratoxins and related dihydroisocoumarins. In : Betina V, eds. Mycotoxins-Production, Isolation, Separation and Purification. Amsterdam : Elsevier, 1984 : 183-216.

3. Krogh P. Ochratoxins in food. In : Krogh P, eds. Mycotoxins in food. New York : Academic Press, 1987 : 97-121.

4. Petkova-Bocharova T, Chernozemsky IN, Castegnaro M. Ochratoxin A in human blood in relation to Balkan endemic nephropathy and urinary system tumours in Bulgaria. Food Addit Contam 1988 ; 5 : 299-301.

5. Breitholtz A, Olsen M, Dahlback A, Hult K. Plasma ochratoxin A levels in three Swedish populations surveyed using an ion-pair HPLC technique. Food Addit Contam 1991 ; 8/2 : 183-92.

6. Bacha H, Hadidane R, Creppy EE, Regnoult CR, Ellouz F, Dirheimer G. Monitoring and identification of fungal toxins in food products animal feed and cereals in Tunisia. J Stored Prod Res 1988 ; 24 : 199-206.

7. Bacha H, Maaroufi K, Achour A, Hammami M, Ellouz F, Creppy EE. Ochratoxines et ochratoxicoses humaines en Tunisie. In : Creppy EE, Castegnaro M, Dirheimer G, eds. Human ochratoxicosis and its pathologies. Collection Colloque, vol. 231. Paris : INSERM ; John Libbey Eurotext, 1993 : 111-21.

8. Creppy EE, Kern D, Steyn PS, Vlegaar R, Röchenthaler R, Dirheimer G. Comparative study of the effect of ochratoxin analogues on yeast aminoacyl-t _RNA synthetases and on the growth and protein synthesis of heptoma cells. Toxicol Lett 1983 ; 19 : 217-24.

9. Krogh P. Role of ochratoxin indisease caution. Food Chem Toxic 1992 ; 313 : 213-24.

10. Krogh P, Axelen NH, Elling F, et al. Experimental porcine nephropathy changes of renal function and structure induced by ochratoxin A contaminated feed. Acta Pathol Microbiol Scand Sect A 1974 ; Suppl. 246 : 1-21.

11. Kane A, Creppy EE, Röschenthaler R, Dirheimer G. Changes in urinary and renal tubular enzymes caused by subchronic administration of ochratoxin A in rats. Toxicology 1986 ; 42 : 95-8.

12. Krogh P, Hald B, Plestina R, Ceovic S. Balkan (endemic) nephropathy and foodborn ochratoxin A. Preliminary results of survey of foodstuffs. Acta Pathol Microbiol Scand Sect A 1977 ; 246 : 1-21.

13. Petkova-Bocharova T, Castegnaro M. Ochratoxin A in human blood in relation to Balkan endemic nephropathy and urinary tract tumours in Bulgaria. In : Castegnaro M, Plestina R, Dhireimer G, Chernozemsky IN, Bartsch H, eds. Mycotoxins, endemic nephropathy and urinary tract tumors. Lyon : International Agency for Research on Cancer, 1991 ; 115 : 135-7.

14. Pfohl-Leszkowicz A, Petkova-Bocharova T, Chernozemsky IN, Castegnaro M. Balkan endemic nephropathy and associated urinary tract tumors: A review on aetiological causes and the potential role of mycotoxins. Food Addit Contam 2002 ; 19 : 282-302.

15. Achour A, El-May M, Bacha H, Hammami M, Maaroufi K, Creppy EE. Néphropathies interstitielles chroniques. Approches cliniques et étiologiques : ochratoxine A. In : Creppy EE, Castegnaro M, Dirheimer G, eds. Human ochratoxicosis and its pathologies. Collection Colloque, vol. 231. Paris : INSERM ; John Libbey Eurotext, 1993 ; 231 : 227-34.

16. Maaroufi K, A chour A, Hammami M, et al. Ochratoxins in human blood and nephropathy in Tunisia. Hum Exp Toxicol 1995, 14 : 609-15.

17. Maaroufi K, Achour A, Zakhama A, et al. Human nephropathy related to ochratoxin A in Tunisia. J Toxicol Toxin Rev 1996 ; 15 : 223-37.

18. Abid S, Hassen W, Achour A, et al. Ochratoxin A and human chronic nephropathy in Tunisia: Is the situation endemic ? Hum Exp Toxicol 2003 ; 22 : 1-8.

19. Galtier P, Boner B, Charpenteau JL, Bodin G, Alvinerie M, More J. Physiopathology of hemorrhagic syndrome related to ochratoxin A intoxication in rats. Food Cosmet Toxicol 1979 ; 17 : 49-53.

20. Gupta M, Bandyopdhyay S, Paul B, Majumder SK. Haematological changes produced in mice by ochratoxin A. Toxicology 1979 ; 14 : 95-8.

21. Omar RF, Rahimtula AD, Bartsch H. Role of cytochrome P-450 in ochratoxin A-stimulated lipid peroxidation. J Biochem Toxicol 1991 ; 6 : 203-9.

22. Pitout MJ. The effect of ochratoxin A on glycogen storage in the liver. Toxicol Appl Pharmacol 1968 ; 13 : 288-306.

23. Haubeck HD, Lorkowski G, Kolsche E, Röschenthaler R. Immunosuppression by ochratoxin A and its prevention by phenylalanine. Appl Environ Microbiol 1981 ; 41 : 1040-2.

24. Creppy EE, Lorkowski G, Röschenthaler R, Dirheimer G. Kinetic of immunosuppression action of ochratoxin A in mice. In : Proceedings, V International IUPAC Symposium Mycotoxins and phycotoxins. Chem Soc (Vienna) 1982 : 189-92.

25. Dwivedi P, Burns RB. Immunosuppression effects of ochratoxin A in young Turkey. Arian Pathol 1985 ; 14 : 213-25.

26. Mayura K, Parker R, Berndt WO, Phillips TD. Ochratoxin A, induced tetragenesis in rats: Partial protection by phenylalanine. Appl Environ Microbiol 1984 ; 48 : 1186-8.

27. Wei X, Sulik KK. Mechanisms of cell death associated with ochratoxine A induced malformations. Teratology 1995 ; 51 : 201.

28. Pfohl-Leszkowicz A, Grosse Y, Kane A, Creppy EE, Dirheimer G. Differential DNA adduct formation and disappearence in three mice tissues after treatment by the mycotoxin ochratoxin A. Mutat Res 1993 ; 289 : 265-73.

29. Maaroufi K, Pfohl-Leszkowics A, Achour A, et al. Génotoxicité de l'ochratoxine A, relation avec la tumeur rénale. Arch Inst Pasteur Tunis 1994 ; 71 : 26-36.

30. Obrecht-Pflumio S, Chassat S, Dirheimer G, Marzin D. Genotoxicity of ochratoxin A by Salmonella mutagenicity test after bioactivation by mouse kidney microsomes. Mutat Res 1999 ; 446 : 95-102.

31. Bendele AM, Carlton WW, Krogh P, Lillehoj EB. Ochratoxin A Carcinogenesis in the (C57BL/6J x C3H) F1 mouse. J Natl Cancer Inst 1985 ; 75 : 733-42.

32. Boorman G. NTP Technical Report on the toxicology and carcinogenesis studies of ochratoxin A. (CAS n^o 307-47-9) in F344 rats (Gavage Studies). NIH publications 89, 2813. Research Triangle Park (NC) : National Institutes of Health, 1989.

33. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantification of micrograms quantities of protein utilizing the principal of protein-dye binding. Anal Biochem 1976 ; 72 : 15275-9.

34. Henry JB. Clinical diagnosis and management. 17^th edition. Philadelphia : Saunders Publisher, 1984.

35. Gads SC, Neil CS. Statistic for toxicologists. In : Wallace Hayes A, eds. Principles and methods of toxicology. New York : Plenum Press, 1982 : 273-9.

36. Munro IC, Moodie CA, Kuiper-Goodman T, Scott PM, Grice HC. Toxicologic changes in rats fed graded dietary levels of ochratoxin A. Toxicol Appl Pharmacol 1974 ; 28 : 180-8.

37. Sclare G. A case of unexplained karyomegaly. Beitr Pathol 1976 ; 157 : 301-6.

38. Mihatsch MJ, Gudat F, Zollinger HU, Heierli CH, Thölen H, Reutter FW. Systemic karyomegaly associated with chronic interstitial nephritis. A new disease entity ? Clin Nephrol 1979 ; 12 : 54-62.

39. Spoendlin M, Moch H, Brunner F, et al. Karyomegalic Interstitial Nephretis: Further support for a distinct entity and evidence for a genetic defect. Am J Kidney Dis 1995 ; 25 : 242-52.

40. Creppy EE, Kane A, Giessen-Crouse E, Roth A, Röschenthler R, Dirheimer G. Effect of ochratoxin A on enzyme activities and macromolecules synthesis in MDCK cells. Arch Toxicol 1986 ; Suppl. 9 : 310-4.

41. Hong JT, Par KL, Han SY, Park KS, Lee RD, Jang SJ. Effects of ochratoxin A on cytotoxicity and cell differentiation in cultured rat embryonic cells. J Toxicol Environ Health 2000 ; 61 : 609-21.

42. Radovanovic Z. Epidemiological characteristics of Balkan endemic nephropathy in Eastern regions of Yugoslavia. In : Castegnaro M, Plestina R, Dirheimer G, Chernozemsky IN, Bartsh H, eds. Mycotoxins, endemic nephropathy and urinary tract tumors. Lyon : IARC Scientific Publication, 1991 ; 115 : 11-20.

43. Tanchev Y, Dorossiev D. The first clinical description of Balkan endemic nephropathy (1956) and its validity 35 years later. In : Castegnaro M, Plestina R, Dirheimer G, Chernozemsky IN, Bartsh H, eds. Mycotoxins, endemic nephropathy and urinary tract tumours. Lyon : IARC Scientific Publication, 1991 ; 115 : 21-8.