Mécanisme de la toxicité de l‘éthylène glycol méthyl éther (EGME) et des isomères du propylène glycol méthyl éther (PGME) sur la reproduction et le développement

ARTICLE

Auteur(s) : Emmanuel Lemazurier, Luc Multigner*, Anthony Lecomte, Franck Robidel, Frédéric-Yves Bois,

Laboratoire de toxicologie expérimentale, Institut national de l'environnement industriel et des risques, Ineris DRC Toxi, Parc technologique ALATA, BP 2, 60550 Verneuil-en-Halatte. 
* GERM-Inserm U435, Université de Rennes I, Campus de Beaulieu, Avenue du général Leclerc, 35092 Rennes Cedex <emmanuel.lemazurier@ineris.fr>

Les éthers de glycol sont des solvants oxygénés dont l'usage s'est largement développé ces trente dernières années. Ils constituent une famille variée de plus de 30 substances différentes réparties entre les dérivés de l'éthylène glycol et les dérivés du propylène glycol. Leur caractère amphiphile leur confère une grande miscibilité dans l'eau et dans de nombreux solvants organiques. De plus, leur faible toxicité aiguë, comparée à celle de la plupart des solvants organiques, a favorisé leur présence dans de nombreuses préparations à usage industriel ou domestique tels que les peintures, encres, vernis, teintures, produits de nettoyage, savons liquides, cosmétiques ou certaines formulations pharmaceutiques. 

Depuis la première publication de Nagano et al. en 1979 [1], de nombreuses études réalisées chez l'animal de laboratoire ont montré que des éthers de glycol dérivés de l'éthylène glycol (principalement l'éther méthylique ou EGME) présentaient des effets adverses sur la reproduction et le développement [2]. Cependant, tous les éthers de glycol ne présentent pas le même niveau de toxicité, celle-ci étant liée au métabolisme, lui-même variable selon l'éther de glycol considéré. 

Les éthers de glycol sont modérément volatils mais possèdent un excellent pouvoir de pénétration cutanée. La publication, dans les années 1980, de travaux expérimentaux montrant la toxicité de deux éthers de glycol dérivés de l'éthylène glycol (l'éther méthylique ou EGME et l'éther éthylique ou EGEE) a conduit le Conseil des Communautés européennes à arrêter une directive imposant des restrictions d'usage et de marché pour ces deux éthers de glycol et leurs acétates. En France, trois arrêtés et deux décisions de 1997, 1998, et 1999 ont interdit leur utilisation dans les produits à usage domestique, dans les cosmétiques et les médicaments. D'autres éthers de glycol ont récemment été classés comme toxiques pour la fertilité et le développement. C'est le cas de l'éthylène glycol diméthyl éther (EGDME, catégorie 2 : substances devant être assimilées à des substances altérant la fertilité dans l'espèce humaine, substances devant être assimilées à des substances causant des effets toxiques sur le développement dans l'espèce humaine), du diéthylène glycol monométhyl éther (DEGME, catégorie 3 : substances préoccupantes pour la fertilité dans l'espèce humaine, substances préoccupantes pour l'homme en raison d'effets toxiques sur le développement), du diéthylène glycol diméthyl éther (DEGDME, catégorie 2), du triéthylène glycol diméthyl éther (TEGDME, catégorie 2) et également de l'isomère β du PGME (catégorie 2). Ces dernières substances sont d'ailleurs classées à risque pour la fertilité et la grossesse (R60, R61, R62 et R63). 

Nous présentons ici un point sur les connaissances de la toxicité de l'EGME (CAS 109-86-4, synonymes glycol éther EM, méthoxy-2-éthanol, méthyl glycol) et du PGME (CAS isomère α 107-98-2 synonymes glycol éther PM, 1-méthoxy 2-propanol et CAS isomère β 1589-47-5 synonyme 2-méthoxy 1-propanol) vis-à-vis de la reproduction et du développement. Le premier, parce qu'il est aujourd'hui interdit dans les produits à usage domestique, dans les cosmétiques et les médicaments mais qu'il reste, avec l'EGEE, une référence comme toxique de la reproduction et du développement [3, 4]. Le second parce qu'en se substituant à l'EGME, il est devenu le produit phare de la deuxième génération des éthers de glycol et de la série propylénique, mais aussi parce que des doutes subsistent quant à son réel potentiel de toxicité sur la reproduction et le développement des mammifères [5] quoique plus faible que celui de l'EGME et de l'EGEE. Cela s'explique par une différence structurale qui est la clé de la toxicité des éthers de glycol sur la reproduction et le développement : la longueur de la chaîne carbonée (inversement liée à la toxicité) et, surtout dans le cas qui nous intéresse ici, la présence d'une fonction alcool primaire (figure 1). Les éthers de glycol qui possèdent un résidu alcool primaire, sont métabolisés par des alcools déshydrogénases en leur alkoxy acide correspondant (l'EGME donne l'acide méthoxyacétique, ou MAA, l'EGEE donne l'acide éthoxyacétique, ou EAA), alors que ceux possédant un résidu alcool secondaire (l'isomère α du PGME), substrats peu affins pour les alcools déshydrogénases, forment des quantités faibles de métabolites sous forme d'alkoxy acide (acide méthoxypropionique ou MPA) [6] (figure 1). Une étude récente [7] a montré in vivo et in vitro chez le lapin que l'isomère β du PGME est rapidement et totalement converti en MPA. Ce métabolite possède un NOEL¹ dix fois plus élevé (26 mg/kg/j) que le MAA (2,5 mg/kg/j). L'étude pharmacocinétique a également montré que la demi-vie du MPA était longue (33 à 44 heures). Cependant, le pic de concentrations sanguines (1,3 mM) et l'aire sous la courbe (52,9 mM-h/l) du MPA, associés à un LOEL² de 78 mg/kg/j, montrent un seuil de toxicité relativement élevé du MPA [7]. Les métabolites de l'EGME et de l'EGEE sont, quant à eux, les vrais toxiques du développement et de la reproduction issus des éthylènes glycols éthers de faible poids moléculaire [3, 4]. Cependant, bien que les systèmes enzymatiques des différentes espèces étudiées et de l'homme soient qualitativement proches, il existe des différences quantitatives des activités enzymatiques tissulaires d'une espèce à l'autre [8].À la différence des testicules de rat, les testicules humains ne présentent qu'une faible activité alcool déshydrogénase et ne produisent ni aldéhyde, ni acide à partir des éthers de glycol.

¹ NOEL : No Observed Effect Level. 
² LOEL : Lowest Observed Effect Level. 

EGME : effets sur la reproduction et le développement

La toxicité sur la fonction de reproduction est la survenue d'effets adverses sur le système de reproduction de l'un ou l'autre sexe résultant d'une exposition à des agents extérieurs. Cette toxicité peut s'exprimer au niveau des organes reproducteurs (au premier chef, les gonades), du système endocrinien associé (l'axe hypothalamo-hypophyso-gonadique) ou des événements qui font suite à la fécondation. Les manifestations d'une telle toxicité peuvent inclure des effets délétères sur la production et le transport des gamètes à l'âge adulte, le comportement sexuel, la gestation, la maturation sexuelle, et sur toute autre fonction dépendante de l'intégrité du système reproducteur.

Effets de l'EGME sur la fertilité chez le mâle

L'EGME fait partie des toxiques testiculaires unanimement reconnus. Une littérature riche lui est consacrée, aussi bien sur la description de ses effets testiculaires que sur son mécanisme d'action (revue dans l'expertise collective de l'INSERM). La haute spécificité de son effet testiculaire fait qu'il peut être utilisé dans des modèles expérimentaux in vivo et in vitro pour obtenir une déplétion de la lignée germinale et étudier ainsi les interactions paracrines (actions dues à une hormone synthétisée par une cellule et agissant localement sur les cellules voisines) entre les différentes composantes cellulaires du testicule.

Études in vivo

L'ensemble des études toxicologiques réalisées in vivo chez l'animal de laboratoire montre, de manière cohérente, les conséquences délétères de l'EGME (et de son acétate) sur la fonction testiculaire, pouvant entraîner une diminution significative de la fertilité.

Dès 1979, Nagano et al. [1] puis Miller et al. [10] ont montré que l'exposition de rats ou de souris à l'EGME par inhalation conduit à une atrophie testiculaire accompagnée d'une atteinte préférentielle des tubules séminifères (figure 2) chez ces deux modèles animaux. Le poids du testicule et de l'épididyme de rats Sprague Dawley notamment est diminué significativement, qu'ils soient traités pendant 2 semaines avec 200 mg/kg/j ou pendant 4 semaines avec 100 mg/kg/j d'EGME [3]. Dans le premier groupe, une atrophie du tubule séminifère et la présence de cellules géantes multinucléées au niveau du testicule ont été observées. Par la suite, d'autres travaux ont montré, chez le rat adulte ou prépubère, l'atteinte spécifique de la lignée germinale à l'intérieur des tubules séminifères. Ces lésions impliquent une altération de la spermatogenèse (figure 3, page 93), entraînant une diminution de la production de spermatozoïdes [11, 12].

Dans la lignée germinale, la cible initiale et préférentielle concerne les spermatocytes au stade pachytène [13-16]. En fonction de l'intensité de l'exposition, les spermatocytes leptotènes et zygotènes ainsi que les spermatides jeunes (à noyaux ronds), stades suivant et finaux de la méïose, vont, par un effet cascade, être atteints à leur tour. Tant que les cellules souches de la spermatogenèse (spermatogonies) ne sont pas atteintes, un arrêt de l'exposition au stade pachytène conduit à une réversibilité des lésions [17]. Cependant, à des niveaux d'exposition plus élevés, lorsque les spermatogonies ainsi que les spermatides plus vieilles (à noyaux allongés) sont touchées [11, 18], la réversibilité des lésions est compromise en raison d'une réduction du nombre des cellules souches tandis que l'atteinte des spermatides à noyaux allongés se traduit par une réduction de la mobilité des spermatozoïdes. Au niveau ultrastructural, les spermatocytes et les cellules de Sertoli présentent une atteinte des mitochondries, une dissolution de la membrane cellulaire, une fragmentation du réseau microtubulaire ou une condensation périphérique de la chromatine nucléaire, signes clairs de cytotoxicité. La dégénérescence des spermatides semble, quant à elle, consécutive à l'altération de l'association entre les cellules germinales et les cellules de Sertoli [18]. Cette cytotoxicité apparaît fortement dépendante du métabolisme de l'EGME puisque le pré-traitement par un inhibiteur de l'alcool déshydrogénase de rats exposés à l'EGME prévient les effets testiculaires [19], suggérant un rôle des alkoxyacides dans la genèse des lésions testiculaires. Le methoxy acetic acid (MAA), principal métabolite de l'EGME, reproduit d'ailleurs, chez le rat, les effets de la substance mère (atrophie des tubules séminifères, atteinte spécifique et préférentielle des spermatocytes pachytènes).

Études in vitro

Les études in vitro apportent des éclaircissements quant au métabolite impliqué dans cette cytotoxicité. Elles ont montré que le MAA, et non l'EGME lui-même, induit une cytotoxicité vis-à-vis des spermatocytes pachytènes identique à celle qui est observée chez l'animal entier [20]. Li et al. [21] ont confirmé sur des cultures primaires humaines la spécificité et la sensibilité des spermatocytes pachytènes au MAA. Le MALD (méthoxyaldéhyde, aldéhyde dérivé de l'EGME, figure 1) génère les mêmes effets mais semble plus efficace que le MAA [22].

Effets de l'EGME sur la fertilité chez la femelle

La toxicité des éthers de glycol sur la fonction de reproduction chez la femelle non gravide a été très peu étudiée. Chez l'animal, le seul indicateur recherché a été celui de la fertilité (femelles exposées et accouplées à des mâles non exposés). Au cours de ces dernières années, des travaux se sont intéressés aux effets des éthers de glycol sur le cycle ovarien [23].

Études in vivo

Davis et al. [23] ont montré que l'administration quotidienne de 300 mg/kg d'EGME par voie orale chez des rates adultes supprime, au terme de 3 à 8 jours d'exposition, le rythme du cycle ovarien sans induire d'autre effet systémique. Cet effet est accompagné d'une augmentation des taux circulants de progestérone alors que ceux de l'hormone stimulante de la folliculogenèse (FSH), de l'hormone lutéinisante (LH) et de la prolactine restent inchangés. Au niveau histologique, une hypertrophie du corps jaune a été observée. L'ensemble de ces données suggère que les cellules lutéales ovariennes sont la cible primaire de l'EGME.

Études in vitro

In vitro, des cellules lutéales de la granulosa en culture isolées d'ovaires après injection de gonadotropine chorionique humaine (hCG) ont été exposées au MAA après stimulation à la LH. Ce métabolite de l'EGME maintient la sécrétion de progestérone pendant 24 et 48 h par rapport au témoin dont la production de progestérone diminue [23]. Il est connu que la production de progestérone est stimulée par la LH via la voie adénosine monophosphate cyclique (AMPc) [24]. Or, dans cette étude, le MAA stimule la production de progestérone en absence de LH (après 24 ou 48 h) et la concentration d'AMPc ne varie pas lors du traitement. Ces travaux montrent que l'EGME (via le MAA) exerce un effet toxique sur la cellule lutéale et que la production de progestérone qui en découle est indépendante de la stimulation de l'AMPc par la LH [23]. Bolon et al. [25] ont observé chez la souris que l'EGME et le MAA réduisent de manière significative le nombre de follicules ovariens et Berger et al. [26] ont montré une diminution des ovocytes ovulés avec le même traitement chez le rat.

Effets de l'EGME sur le développement

La toxicologie du développement de l'EGME a été étudiée selon deux types de protocoles :

• Administration journalière pendant la durée de l'organogenèse (ou du moins dans sa plus grande partie). Dans ces travaux, les doses élevées entraînent invariablement une mort fœtale totale : 1 000 mg/kg/j chez la souris selon Nagano et al. [27], 264 mg/kg/j pour le rat selon Nelson et al. [28], 35,8 mg/kg/j chez le singe selon Scott et al. [29]. Cette embryolétalité est variable selon les doses et les espèces utilisées ; elle peut se manifester, selon la dose, par une perte post-implantatoire totale ou partielle.

• Administration de doses uniques ou pendant un temps très court de l'embryogenèse. Cette approche a pour but d'étudier les phases sensibles du développement. L'exencéphalie est induite par une administration précoce d'EGME entre le jour de gestation 7 (G7) et G10 chez la souris [30]. Au contraire, les anomalies des extrémités sont générées par des administrations plus tardives avec un maximum d'efficacité à G11 [31]. Ce fait témoigne de données classiques concernant la chronologie de la formation du système nerveux et des membres.

Les malformations observées dans la plupart des études, selon des protocoles standardisés (coupe de Wilson), sont des anomalies des doigts des pattes antérieures plus que postérieures et une exencéphalie, surtout à partir de la dose de 250 mg/kg/j chez la souris [28].

Dans ce type de protocole, le groupe de Nelson [28] a exposé des rates Sprague Dawley gestantes à de l'EGME par inhalation (25 ppm, 7 h/j de G7 à G13 ou de G14 à G20). Les ratons naissent et sont testés sur leur habilité neuromusculaire et leurs caractères comportementaux le 10^e et le 90^e jour après la naissance. Lorsque les femelles ont été soumises à une atmosphère polluée de G7 à G13, on note chez le raton un échec au conditionnement d'évitement. C'est le seul test comportemental qui soit perturbé, montrant qu'un traitement chez la femelle gestante peut générer des troubles comportementaux persistants chez le rat nouveau-né. Aucune perturbation n'est notée chez le raton si les femelles sont traitées entre G14 et G20. Cependant, cette étude reste non reproduite.

PGME : effets sur la reproduction et le développement

Tous les éthers de glycol n'ont cependant pas été autant étudiés que l'EGME quant à leur toxicité pour la reproduction et le développement. C'est le cas du propylène glycol méthyl éther (PGME) dont le produit commercial contient aujourd'hui au moins 97 % de 1-méthoxy-2-propanol (isomère α, 2PG1ME), mais également une faible proportion de l'isomère β, le 2-méthoxy-1-propanol (1PG2ME). Dans certains produits commerciaux de PGME, la proportion de ce dernier pouvait atteindre 2 à 5 %. Cependant, le récent rapport d'avancement au directeur général de la Santé du groupe d'expert du Conseil supérieur d'hygiène publique de France, section des milieux de vie [32], souligne qu'aucune précision n'est apportée sur la proportion de 1PG2ME dans les produits commerciaux contenant du PGME et son acétate.

Effets du PGME sur la fertilité

Un certain nombre de publications concluent à une absence d'effets testiculaires du 2PG1ME, que ce soit chez le rat, la souris ou le lapin [33, 34], après inhalation du produit. Une étude de Carney et al. [35] a consisté à exposer par inhalation des rats mâles et femelles pendant les phases d'accouplement, de gestation et de lactation. Un effet important a été rapporté pour les parents à 3 000 ppm de PGME caractérisé par une diminution du poids, un allongement du cycle œstral, une diminution de fertilité et du poids des ovaires ainsi que des altérations histologiques de ces organes. Cette toxicité parentale est importante pour expliquer la diminution observée du poids et de la taille des portées, et cette toxicité reste inférieure aux doses toxiques pour le développement. En effet, les auteurs proposent un NOEL de 1 000 ppm pour les effets sur la reproduction et les effets néonataux, et de 300 ppm pour la toxicité parentale.

Les données chez la femelle sont encore plus rares. Bolon et al. [25] n'ont pas montré d'effets délétères du PGME sur le système reproducteur de la souris femelle.

Le manque certain de données animales sur le PGME incite à la prudence quant aux conclusions à en tirer. Des études complémentaires sont encore nécessaires, notamment dans l'étude des effets du 1PG2ME qui possède une fonction alcool primaire, et donc potentiellement une toxicité élevée.

Effets du PGME sur le développement

Les études de tératologie conduites avec le 2PG1ME purs sont souvent associées à une forte toxicité maternelle provoquant la mort de la mère ou des signes neurologiques importants. Cette toxicité maternelle est souvent associée à une auto-restriction alimentaire et/ou une diminution du poids de la mère pendant la gestation qui pourrait être mis secondairement en relation avec les retards d'ossification observés dans les portées. Ces retards peuvent donc ne pas être directement associés au produit et présentent souvent des différences en fonction de l'espèce testée.

Merkle et al. [36] ont observé des effets tératogéniques chez le lapin et le rat après inhalation d'acétate de 1PG2ME. Une sensibilité plus importante chez le lapin a d'ailleurs été observée. Récemment, Carney et al. [7] ont montré que cette toxicité était due à la bioconversion du 1PG2ME en MPA dont le seuil de toxicité était plus élevé que celui du MAA. Hellwig et al. [37] ont également montré que le 1PG2ME provoque chez le lapin des morts fœtales par résorption totale ou partielle à des doses faibles (545 ppm). En comparaison, des expositions de rats ou de lapins au 2PG1ME (jusqu'à 3000 ppm) n'ont montré que des retards d'ossification chez le rat [38]. Ces auteurs ont également observé des malformations des doigts, des côtes et du sternum avec le 1PG2ME et ont défini un NOAEL³ de 145 ppm et un LOAEL⁴ de 225 ppm.

³ NOAEL : No Observed Adverse Effect Level.
⁴ LOAEL : Lowest Observed Adverse Effect Level.

Données épidémiologiques

Les études disponibles sont de qualité diverse et les effets sont souvent difficiles à attribuer aux seuls éthers de glycol en raison des co-expositions à d'autres solvants. Cependant, un ensemble de résultats [39] concordants est en faveur de l'existence d'un lien entre l'infertilité masculine (s'entendant par la diminution de la concentration du sperme, l'oligospermie, la difficulté à concevoir un enfant) et l'exposition professionnelle à l'EGEE, l'EGME et peut-être à l'un des autres éthers de glycol présents dans l'industrie des semi-conducteurs (DEGDME, 2PG1MEA) où les niveaux d'exposition restent somme toute faibles. Chez les femmes travaillant dans les secteurs les plus exposés aux éthers de glycol, des études ont rapporté des anomalies de la durée ou de la régularité des cycles menstruels ainsi qu'une diminution de la fertilité (s'entendant par un taux de fécondabilité abaissé ou des difficultés à concevoir un enfant) [40]. Les composantes historiques et prospectives des deux études américaines menées dans l'industrie des semi-conducteurs sont concordantes pour montrer un effet de l'exposition aux éthers de glycol présents dans l'industrie sur le risque d'avortements spontanés [41]. Le risque augmente avec le niveau d'exposition aux dérivés éthyléniques.

Les études sur les malformations (anomalies multiples, anomalies du tube neural, fentes orales) sont encore peu nombreuses et contradictoires [41]. Une récente publication [42] tend à montrer des malformations spécifiques chez l'homme suite à une exposition forte in utero à des éthers de glycol. Ces malformations sont de plus en corrélation avec des anomalies du cycle cellulaire.

Enfin, les quelques études épidémiologiques conduites sur la relation entre l'exposition aux éthers de glycol et différents types de cancer chez l'homme (leucémies aiguës myéloïdes, cancer de l'estomac, cancer du testicule) n'apportent pas de résultats convaincants sur un effet cancérigène potentiel de ces solvants, même si certains travaux menés chez l'animal vont dans le sens de cette relation [43, 44].

Conclusion

La publication, dans les années 1980, de travaux expérimentaux montrant la toxicité de deux éthers de glycol dérivés de l'éthylène glycol (l'éther méthylique ou EGME et l'éther éthylique ou EGEE) a conduit le Conseil des Communautés européennes à arrêter une directive imposant des restrictions d'usage et de marché pour ces deux éthers de glycol et leurs acétates. En France, trois arrêtés et deux décisions de 1998, 1999 et 2002 [45-49] ont interdit leur utilisation dans les produits à usage domestique, dans les cosmétiques et les médicaments.

Dans cette revue non exhaustive, il apparaît que, si le retrait de l'EGME du marché est pleinement justifié, son remplacement par le PGME reste discutable. En effet, le PGME sous sa forme commerciale impure (présence du 1PG2ME) ne semble pas dénué d'effets sur la reproduction et surtout sur le développement. Un certain nombre d'études complémentaires, notamment en ce qui concerne l'implication du 1PG2ME dans la toxicité, sont nécessaires. n

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45. Arrêté du 22 janvier 1998 suspendant la mise ou le maintien sur le marché de produits cosmétiques et de produits d'hygiène corporelle contenant certains éthers de glycol. Journal Officiel de la République française, 30 janvier 1998 : 1476.

46. Arrêté du 27 janvier 1998 portant suspension de la fabrication, de l'importation, de l'exportation, de la mise sur le marché à titre gratuit ou onéreux de certains produits destinés à l'homme ou à l'animal et contenant des éthers de glycol. Journal Officiel de la République française, 30 janvier 1998 : 1494-5.

47. Décision du 24 août 1999 interdisant la fabrication, l'importation, l'exportation, la mise sur le marché à titre gratuit ou onéreux, la détention en vue de la vente ou de la distribution à titre gratuit, l'utilisation, la prescription, la délivrance et l'administration de certains produits destinés à l'homme et contenant certains éthers de glycol. Journal Officiel de la République française, 1^er septembre 1999 : 1353-4.

48. Décision du 24 août 1999 interdisant la fabrication, le conditionnement, l'importation, l'exportation, la distribution en gros, la mise sur le marché à titre gratuit ou onéreux, la détention en vue de la vente ou de la distribution à titre gratuit et l'utilisation de certains produits cosmétiques contenant certains éthers de glycol. Journal Officiel de la République française, 1^er septembre 1999 : 1354.

49. Arrêté du 7 mars 2002 portant interdiction de la fabrication, l'exécution, la prescription, la délivrance et l'administration à des animaux de préparations extemporanées vétérinaires et des autovaccins à usage vétérinaire contenant certains éthers de glycol. Journal Officiel de la République française, 24 mars 2002 : 5246.