ARTICLE
Auteur(s) : Samir Hamamah, Tal Anahory,
Frank Pellestor, Vanessa Loup, Lionel Reyftman, Hervé Dechaud,
Bernard Hedon
Centre d’AMP/DPI, Département de Médecine et Biologie de la
Reproduction, Inserm U847, Hôpital Arnaud de Villeneuve, 34295
Montpellier
Le diagnostic génétique préimplantatoire (DPI) consiste à
étudier le contenu génétique d’embryons humains. Il est le résultat
de la pratique de la fécondation in vitro avec micro-injection et
du développement des techniques de cytogénétique moléculaire et de
biologie moléculaire. Il permet une analyse génétique sur une ou
deux cellules prélevées sur un embryon et de ne transférer in utero
que du ou des embryons sains pour la maladie recherchée ou porteurs
sains. Cette approche concerne les couples ayant un risque connu de
transmettre une maladie grave et incurable.
Les couples concernés par le DPI ont une histoire difficile avec
de nombreuses interruptions médicales de grossesse suite à
l’analyse de trophoblaste ou amniocentèse dans le cadre du
diagnostic anténatal et/ou un ou plusieurs enfants gravement
atteints ou décédés. D’où l’intérêt de DPI qui permet non seulement
d’éviter une interruption médicale de grossesse, mais également
d’avoir un enfant indemne de l’affection.
La prise en charge d’un couple en vue d’un DPI se plie aux
règles habituelles des couples infertiles mais elle est soumise à
quelques contraintes et limites d’ordre technique.
La performance de la fécondation in vitro par injection
intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI) est primordiale à
double titre : elle permettra la naissance d’un enfant sain
dans une famille le plus souvent déjà blessée par une parentalité
douloureuse et elle s’adresse à des couples fertiles qui ont déjà
obtenu des grossesses spontanément. Ces couples sont transposés
dans un univers qui leur est inconnu et qu’ils n’imaginaient pas
aussi complexe et incertain. Le screening des patients doit être
sérié afin d’éviter de les entraîner dans des procédures
compliquées qui n’aboutiraient pas de façon prévisible.
Le choix des techniques de laboratoire et les stratégies de
transfert sont importants pour la qualité du DPI et l’amélioration
des chances de grossesse tout en diminuant les contraintes du
biologiste responsable du diagnostic définitif.
Principe et législation du DPI
Le DPI implique une fécondation in vitro dans le but d’obtenir
plusieurs embryons pour analyse génique ou chromosomique. Il est
destiné aux couples fertiles, infertiles ou porteurs de maladies
orphelines :
- – couples fertiles, c’est-à-dire refusant ou ne
supportant plus les interruptions médicales de grossesse en cas de
fœtus atteint (myopathie de Duchêne, mucoviscidose, maladie de
Steinert, etc.) ;
- – couples infertiles, par exemple en cas d’agénésie
vésiculo-déférentielle bilatérale ou ayant une maladie
chromosomique ou génique d’une particulière gravité (mucoviscidose,
translocation robertsonienne, etc.) ;
- – maladies orphelines : chorée de Hunttington,
thalassémie A, etc.
Lorsque les embryons ont atteint le stade de 6 à 8 cellules
(J3), une ou 2 cellules totipotentes sont prélevées par
micro-manipulation. Le diagnostic moléculaire s’effectue sur une ou
2 cellules, utilisant les techniques d’hybridation in situ
fluorescente (FISH) pour la détection d’anomalie chromosomique et
la détection du sexe des embryons en utilisant la PCR pour les
anomalies géniques.
Les embryons non porteurs de la maladie génétique sont donc
candidats, les embryons non atteints éventuellement transmetteurs
de l’anomalie génétique sont candidats pour la réimplantation dans
l’utérus maternel.
Les couples peuvent demander un DPI avant toute conception ou
après la naissance d’un enfant atteint.
En France, la loi du 29 juillet 1994 (décret 94-654)
relative au don et à l’utilisation des éléments et produits du
corps humain, à l’assistance médicale à la procréation (AMP) et au
diagnostic prénatal, ainsi que les décrets 95-558 du mai 1995
définissent les conditions dans lesquelles peut se pratiquer le
DPI. Le décret du 24 mars 1998 établit les conditions du
diagnostic biologique effectué à partir de cellules prélevées sur
l’embryon obtenu par fécondation in vitro.
Le DPI n’est autorisé que pour la recherche d’affections
graves et incurables. Un médecin du centre pluridisciplinaire
de diagnostic prénatal (Art.162-16) doit attester de la fiabilité
de l’indication.
En Angleterre, comme en Espagne, le DPI est soumis à une
autorisation préalable d’un comité tel que le HFEA en Angleterre
qui statue sur l’ensemble des recherches pratiquées sur l’embryon
humain. La législation est permissive et non spécifique au DPI dans
la mesure où dans ces deux pays, la recherche sur l’embryon est
autorisée. En effet, dans ces deux pays, on utilise le terme de
« pré-embryon » jusqu’au 14e jour du
développement. Quant à la Belgique et aux Pays-Bas, ces pays n’ont
pas de législation spécifique au DPI. En Italie, depuis juillet
2004, le DPI est devenu interdit comme en Allemagne.
Histoire du DPI
Depuis les premières tentatives de biopsie embryonnaire et
d’obtention de grossesse [1], le diagnostic de l’aneuploïdie et du
sexe par hybridation in situ fluorescente (FISH) a connu une
évolution remarquable. La première application du DPI était de
permettre de dépister dans le cadre des maladies liées à l’X, les
sujets susceptibles d’être atteints. En effet, des sondes et des
amorces spécifiques ont été utilisées pour sélectionner les
embryons après biopsie de blastomère [2, 3].
Bien qu’il soit difficile de connaître le nombre exact des
centres pratiquant le DPI dans le monde, on compte aujourd’hui
environ une cinquantaine de centres de DPI répartis sur une
vingtaine de pays. Plus de 1 200 cycles de DPI ont été réalisés
(701 cycles ont été effectués pour des anomalies chromosomiques et
458 pour des maladies génétiques) pour 770 patientes conduisant à
231 grossesses (20 % après DPI) et 166 naissances. Ce fut en
1997. Fin 1997, on estime à plus de 1500 le nombre d’enfants nés
via le DPI et pour une maladie génétique d’une particulière gravité
[4,5]. En France, plus de 200 enfants sont nés grâce au DPI.
Deux types de DPI doivent être distingués :
- – le DPI pour patients présentant un haut risque de
produire des embryons anormaux (porteurs d’une maladie monogénique
ou d’une aberration chromosomique) ;
- – et le DPI pour dépistage d’aneuploïdie dans lequel
l’intégrité d’un certain nombre de chromosomes-clés est vérifiée.
Ce dernier dépistage est aujourd’hui interdit en France.
Stratégie d’inclusion en ICSI en vue d’un DPI
L’ICSI qui généralement permet l’obtention de plusieurs embryons
permet aux couples à risque de transmettre une maladie génétique,
d’établir le statut génétique de leurs embryons et de ne transférer
que les embryons sains ou porteurs sains.
Une cohorte suffisante d’embryons assure la présence d’au moins
un embryon sain. Cette nécessité d’obtenir plusieurs embryons est
due :
- – à l’influence de la pathologie sur le nombre
d’embryons non atteints et donc transférables ;
- – à la perte de matériel entre la ponction et le
transfert ;
- – à l’influence du nombre d’embryons transférés sur le
taux de grossesses.
Vandervost et al. [5] ont très bien montré une corrélation entre
la pathologie héréditaire et le nombre d’embryons non atteints. De
même le nombre d’ovocytes est significativement lié aux taux de
grossesses avec un taux croissant de grossesses en fonction du
nombre d’embryons transférés chez ces mêmes couples, élément que
l’on connaît bien en AMP.
L’équipe du Pr Liebears [5] montre que moins de 50 %
d’ovocytes obtenus donneront des embryons biopsiables. Ainsi, les
patientes seront sélectionnées sur des critères classiques avec une
extrême vigilance. Vandervost et al. [5] proposent l’annulation des
cycles contenant moins de 6 follicules espérés ; entre 6 et 8,
l’annulation doit être discutée avec le couple.
L’âge de la patiente est un facteur prédictif majeur de bonne
réponse aux stimulations de l’ovulation. Les dosages hormonaux au
3e jour du cycle seront donc un bon corollaire à l’âge pour prendre
une décision.
S’il est difficile de refuser d’emblée d’inclure une patiente en
assistance médicale à la procréation (AMP) en raison de son âge
élevé (40-42 ans), cela l’est d’autant plus dans le cadre d’un
DPI où les patientes sont a priori fertiles. Ainsi, un bilan
mettant en évidence une patiente qui répondrait peu ou pas à une
stimulation d’ovulation en vue d’un DPI doit amener à rediscuter
l’indication et éventuellement à l’intégrer dans un protocole.
L’imagerie permet d’objectiver la qualité de la cavité utérine
et donc l’accueil de l’embryon, ce d’autant qu’il existe des
antécédents de curetage ou de fausse couche tardive.
Le spermogramme est à demander même si l’ICSI est la technique
de choix pour un DPI. Il permet d’éviter les mauvaises surprises le
jour de la ponction (oligo-asthéno-teratozoospermie [OATS] sévère,
azoospermie) et si besoin de rechercher des anomalies génétiques ou
autres devant des pathologies découvertes à ce moment-là (caryotype
parental, anticorps antispermatozoïdes, infection, etc.).
Choix de la stimulation ovarienne
L’existence de trois centres de DPI en France conduit les patients
à consulter loin de chez eux. Les centres d’AMP locaux font relais
et permettent le déplacement des patientes juste pour le jour de la
ponction ovocytaire. Il est souvent plus facile pour le centre qui
effectue le DPI de prescrire le traitement de la stimulation et que
le monitorage soit effectué par le centre relais. Ceci permet de
fixer ensemble les dates de début de traitement, de suivre les
monitorages sur des traitements connus et ainsi de pouvoir annuler
à distance avant de déplacer les patients.
L’échec de stimulation ou l’annulation du traitement est alors
sous la responsabilité du centre de DPI, ce qui facilite la
relation triangulaire patient, centre relais et centre DPI.
Modalité et déroulement d’un DPI
Choix de l’ICSI
La technique de l’ICSI est aujourd’hui la technique de choix pour
un DPI. La PCR en particulier sur une ou deux cellules nécessite
minutie et vigilance. Il s’agit d’éviter toute contamination par de
l’ADN extérieur : en particulier celui de l’opérateur, l’ADN
volatile des PCR antérieures mais aussi les cellules du cumulus ou
d’autres spermatozoïdes qui peuvent venir contaminer le prélèvement
de blastomère si l’embryon a été fécondé en FIV classique.
A ces critères se rajoute également la diminution du risque
d’échec de fécondation. Car, il existe un petit avantage de l’ICSI
par rapport à la FIV classique.
Déroulement et réalisation d’une ICSI en vue du DPI
L’injection d’un spermatozoïde dans l’ovocyte se fait à l’aide de
micromanipulateur et d’un microscope inversé. Le microscope inversé
doit être équipé d’un système optique (Hofmann) permettant
d’observer les ovocytes sans qu’ils soient fixés et colorés. Le
microscope est également équipé d’objectifs et d’oculaires
permettant un grossissement de 100 à 400 fois et d’un système de
micromanipulateur et d’injecteur permettant la manipulation des
cellules observées. Pour réaliser l’injection, il faut deux
micropipettes : une de contention (holding), destinée à
maintenir l’ovocyte pendant l’injection dont le diamètre interne
est de 20 μm, et une d’injection dont le diamètre interne est
de 5-7 μm, destinée à prélever le spermatozoïde, à
l’immobiliser, puis à l’injecter dans le cytoplasme de l’ovocyte.
Préparation des ovocytes
Les ovocytes recueillis sont mis en milieu de culture. Les cellules
du cumulus sont dissociées après incubation des ovocytes durant 1
minute dans un milieu de culture contenant de l’hyaluronidase
(2 % 30 secondes). Les cellules du cumulus sont retirées
par aspiration-refoulement des ovocytes dans une micropipette en
verre dont le diamètre est de 200 μm. Les ovocytes ensuite
sont abondamment rincés dans du milieu de culture.
L’observation au microscope permet alors de noter le stade de
maturité ovocytaire. Seuls les ovocytes matures (métaphase II)
ayant mis leur 1re globule polaire seront
micro-injectés.
Préparation des spermatozoïdes
Les spermatozoïdes sont sélectionnés sur un gradient de densité
(PureSperm) de deux fractions. Les spermatozoïdes sont ensuite
lavés et le culot obtenu est resuspendu dans un milieu de culture.
Quelle que soit l’origine du sperme (éjaculat, épididymaire, ou
testiculaire), une préparation du sperme doit être faite. Ensuite,
les spermatozoïdes sont incubés dans l’incubateur à CO2 jusqu’au
moment de l’injection.
Une fois les deux micropipettes (contention et injection)
placées sur le micromanipulateur, des microgouttes de
spermatozoïdes préparés sont posées dans des microgouttes
visqueuses contenant de polyvinyle pyrrolidone (PVP), et l’ensemble
de ces microgouttes sont placées dans une boîte de Petri. Ceci a
pour but d’isoler et de sélectionner quelques spermatozoïdes migrés
à la périphérie de la microgoutte de PVP.
Une fois le spermatozoïde choisi, il est immobilisé, et ensuite
aspiré dans la micropipette d’injection pour qu’il soit injecté
dans l’ovocyte. Chaque ovocyte est déposé dans une microgoutte de
milieu de culture autour des microgouttes contenant des
spermatozoïdes.
La boite de Petri contenant des microgouttes est recouverte
d’huile de paraffine légère, et posée ensuite sur la platine
chauffante du microscope inversé.
Au moment de l’injection, l’ovocyte est maintenu par une
micropipette de contention et placée dans le champ optique du
microscope. La micropipette d’injection contenant le spermatozoïde
est ensuite doucement introduite dans le cytoplasme de l’ovocyte.
Les ovocytes microinjectés sont remis en milieu de culture à 37°
sous 5 % de CO2. La fécondation est observée 18 à
22 heures post-microinjection par l’apparition des deux
pronuclei.
Déroulement d’une biopsie embryonnaire (J3) en vue d’un
DPI
La biopsie embryonnaire se fait en général à J3 de la culture
embryonnaire dans le but d’obtenir un embryon entre 6 à 8 cellules
pour un diagnostic par PCR ou FISH au mieux sur 2 blastomères d’un
même embryon.
Avant le début de la biopsie des embryons
L’examen des embryons est réalisé en présence du biologiste
responsable du diagnostic. La décision du nombre d’embryons à
biopsier ainsi que le nombre de blastomères à prélever par embryon
sera prise en commun.
Pendant la biopsie des embryons
La biopsie embryonnaire à J3 nécessite de créer une perforation
dans la zone pellucide par l’utilisation du laser.
Après la perforation de la zone pellucide, un ou deux
blastomères sont ainsi aspirés par la micropipette
d’aspiration.
Le ou les blastomères isolés seront mis à la disposition du
biologiste responsable du diagnostic.
L’embryon biopsié sera immédiatement remis en culture. Il est
important de visualiser le noyau du blastomère sélectionné en
présence des biologistes responsables de l’analyse génétique. Une
photographie du blastomère biopsié sera prise. La biopsie
embryonnaire sera répétée autant de fois qu’il y a d’embryons
biopsiables. Ces précautions ont été suggérées par les centres de
référence effectuant le DPI depuis une dizaine d’années.
La viabilité de l’embryon biopsié et du blastomère est notée.
Elle dépend fondamentalement de la difficulté et de la précision du
geste demandant une extrême reproductibilité. Selon les équipes de
référence, la mise au point nécessite entre 6 et 9 mois. Elle
s’effectue sur des embryons donnés à la recherche par des couples
dont le projet parental est accompli ou sur des embryons obtenus
après FIV ou ICSI et jugés de qualité insuffisante pour une
congélation après transfert.
Le transfert embryonnaire
Grifo et al. [6] rapportent les résultats d’une dizaine d’années
soit plus de DPI.
Entre 1995 et 2005, 304 cycles du DPI ont été réalisés chez 190
couples ; 181 (60 %) pour maladies monogéniques et 123
(40 %) pour avortement spontané et translocation. Dans les
maladies monogéniques, 87 % (soit 158 sur 181 cycles) se sont
soldés par un transfert embryonnaire. Le taux d’implantation a été
de 24 % avec un taux de grossesse clinique de 35 %.
Vingt-trois des cycles DPI pour maladies génétiques n’ont pas
abouti à un transfert.
Gianaroli et al. [7] ont effectué chez 86 patientes présentant
un mauvais pronostic (échecs répétés d’implantation, indication de
caryotype pour âge maternel, translocation) 116 cycles d’ICSI. Deux
groupes ont été individualisés : groupe I qui a bénéficié d’un
transfert à J3 en fin d’après-midi avec une analyse par FISH des
chromosomes XY, 13, 16, 18 et 21 et groupe II dont les embryons ont
été transférés à J4 le matin avec une analyse par FISH des
chromosomes précédents plus le 14, 15 et 22. Leurs conclusions sont
similaires à l’équipe de Grifo avec un commentaire supplémentaire
développant le bénéfice en termes de sélection d’embryons sains et
viables à J4 sans contrainte de temps pour le biologiste
responsable du diagnostic comme pour la patiente. D’autres groupes
effectuent le transfert entre J5 et J6. Leurs résultats montrent
l’absence de dommage de la biopsie embryonnaire sur le
développement embryonnaire jusqu’au stade blastocyste.
La politique de transfert doit rester la même qu’en AMP pour
éviter à ces couples des grossesses multiples. Les grossesses
multiples chez ces patientes présentent les mêmes risques que chez
les autres avec la certitude actuellement d’un diagnostic génétique
anténatal pour confirmer le DPI. L’amniocentèse n’est pas sans
risque supplémentaire pour ces grossesses.
La congélation embryonnaire
La congélation des embryons sains surnuméraires n’a toujours pas
donné de résultats satisfaisants. Dans le monde, après
cryoconservation, une grossesse a été rapportée en 2001 après
transfert d’embryons sains biopsiés. Cependant, on peut réaliser un
DPI sur des embryons congelés-décongelés. Cette approche a permis
l’obtention de quelques naissances.
Aujourd’hui, la congélation peut être conseillée aux couples
avec toute la prudence nécessaire quant aux chances de
réussite.
Indications du DPI pratiqué en 2007 dans le monde
Les indications du DPI sont nées des progrès techniques de la FIV,
de ceux de la cytogénétique et de la biologie moléculaire.
Cette liste n’est pas exhaustive :
- – les maladies génétiques liées au chromosome X :
il en existe plus de 300 parmi lesquelles les plus fréquentes sont
les dystrophies musculaires, l’hémophilie, le syndrome de l’X
fragile ;
- – les couples affectés de maladies monogéniques
récessives dans lesquelles les deux membres sont porteurs sains de
l’anomalie comme dans la dystrophie myoonique, la mucoviscidose, la
thalassémie, la drépanocytose, la maladie de Tay Sachs.
- – les couples affectés d’anomalies structurales
chromosomiques (translocation, inversion) ou numériques (dans
certains cas dits de « mosaïques », l’anomalie ne porte
pas sur toute les cellules.
Plus de 1 500 enfants sont nés à ce jour après DPI ce qui est
peu et démontre les difficultés de cette technique particulièrement
lourde.
Effets du nombre d’ovocytes injectés et du nombre d’embryons
biopsiables
Récemment, l’équipe belge de Vandervorst et al [5] a montré que le
taux de grossesses est corrélé au nombre d’ovocytes injectés et
donc au nombre d’embryons biopsiables. L’étude porte sur 47 couples
soit 84 cycles de DPI. Au total, 1 140 ovocytes ont été récupérés
soit en moyenne de 13,6/ponction (2 à 43). Ils ont comparé le taux
de grossesses selon le nombre d’ovocytes récupérés : groupe I,
le nombre d’ovocytes est égal à 9 et groupe II, le nombre
d’ovocytes est aussi égal à 9 (tableau
1).
Également, dans cette étude, les auteurs ont trouvé une
corrélation positive entre le nombre d’ovocytes récupérés et le
nombre d’embryons biopsiés ainsi que le nombre d’embryons
génétiquement sains.
En conclusion, bien que le nombre d’ovocytes ne soit pas le seul
critère sur lequel le succès de la tentative repose, il reflète la
qualité de la stimulation ovarienne et donc la qualité de
l’endomètre et donc il influence le taux d’implantation. A cela
s’ajoutent le nombre d’embryons à biopsier et donc le nombre
d’embryons sains obtenus.
Tableau 1 D’après [8]
|
Groupe I
|
Groupe II
|
|
Nb d’ovocytes
|
< 9
|
> 9
|
|
Nb de cycles de DPI
|
22
|
62
|
|
Nb d’ovocytes
|
124 (moyen : 5,6)
|
1 020 (moyen : 16,5)
|
|
Nb de cycles avec embryon
|
18
|
59
|
|
Nb d’embryons biopsiés
|
2,23 ± 1,57
|
7 ± 4
|
|
Nb de cycles avec embryons transférés
|
14
|
54
|
|
Nb d’embryons transférés
|
0,77 ± 0,69
|
1,94 ± 1,05
|
|
Taux d’implantation
|
20 %
|
13 %
|
|
Taux de grossesse/cycle
|
9 % (2/22)
|
20,9 % (13/62)
|
Références
1 Handyside AK, Kontogiani EH, Hardy K,
Winston RM. Pregnancies fom biopsied human pré-implantation
embryos sexed by Y specific DNA amplification. Nature 1990 ;
344 : 768-70.
2 Handyside AK, Pattison JK, Penketh RJA,
Winston RML, Tuddenham EGD. Biopsy of human
pré-implantation embryo and sexing by DNA amplification. Lancet
1989 ; II : 347-9.
3 Penketh RJ, Delhanty JD, Vanden Barghe A,
et al. Rapid sexing of human embryos by non-radiactive in situ
hybridization : potential for preimplantation diagnosis of
X-linked disorders. Prenatal Diagn 1989 ; 9 :
489-500.
4 International Working Group on Preimplantation Genetics.
Preimplantation genetic diagnogis — experience of three
thousand clinical cycles. Report of the 11th Annual Metting of the
International Working Group on Preimplantation Genetics, in
conjonction with 10th International Congress of Human Genetics,
Vienna, May 15, 2001. Reprod Biomed Online 2001 ; 3 :
49-53.
5 ESHRE. Preimplantation Genetic Diagnogis Consortium. Data
Collection III, May 2001. Hum Reprod 2002 ; 17 :
233-46.
6 Grifo J, Talebian S, Keegan D, Krey L,
Alder A, Berkeley A. Ten-year experience with
preimplantation genetic diagnosis (PGD) at the New York University
School of Medicine Fertility Center. Fertil Steril 2007 ;
88 : 978-81.
7 Gianaroli L, Magli MC, Ferraretti AP,
Munné S. Preimplantation diagnosis for aneuploidies in
patients undergoing in vitro fertilization with a poor prognosis:
identification of the categories for which it should be proposed.
Fertil Steril 1999 ; 72 : 837-44.
8 Vandervorst M, Liebaers I, Sermon K,
et al. Successful preimplantation genetic diagnosis is related
to the number of available cumulus-oocyte complexes. Hum Reprod
1998 ; 13 : 3169-76.
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