Les souris transgéniques : 1. un passé bien rempli, un avenir très prometteur

ARTICLE

En 1944 parut dans le Journal of Experimental Medicine un article prémonitoire dans lequel on pouvait lire « Biologists have long attempted by chemical means to induce in higher organisms predictable and specific changes which thereafter could be transmitted in series as hereditary characters... » [1]. Cette phrase définissait avant la lettre ce que Gordon et al. [2] appelèrent 36 ans plus tard un organisme transgénique : un animal ou une plante ayant intégré dans son génome un fragment d'ADN étranger et capable de le transmettre à sa descendance. La transgenèse est maintenant une technique de routine qui se pratique chez de nombreuses espèces végétales et animales, aussi bien invertébrés, comme la drosophile ou le nématode, que vertébrés, poissons ou mammifères (cochons, lapins, moutons, chèvres, rats ou souris). Parmi les mammifères, c'est chez cette dernière espèce que la majorité des études sont réalisées car son temps de génération est relativement court (la gestation dure 3 semaines), les embryons des stades préimplantatoires sont aisément manipulables et cultivables et il est possible d'établir des lignées de cellules souches embryonnaires (ES) que l'on peut modifier génétiquement, sélectionner en culture et réimplanter dans un embryon pour transmettre la modification génétique à la descendance.

La transgenèse
« classique » :
une addition aléatoire
de séquences étrangères

C'est en 1976 que parut le premier article décrivant une souris ayant intégré dans son génome un fragment d'ADN exogène par suite de l'infection de blastocystes par un rétrovirus [3]. Si cette première souris n'exprimait pas le transgène, elle était néanmoins transgénique dans la mesure où elle pouvait transmettre de façon mendéléienne cette nouvelle séquence virale au même titre que n'importe lequel de ses propres caractères. Depuis cette première, plusieurs techniques aboutissant à l'obtention de souris transgéniques ont été décrites dont la complexité de mise en œuvre et l'efficacité sont variables : infection de stades préimplantatoires par un virus contenant des séquences d'ADN exogènes [4, 5], transfert d'ADN par incubation de spermatozoïdes dans une suspension d'ADN [6, 7] ou micro-injection d'ADN dans un œuf tout juste fécondé [8, 9]. Bien que relativement lourde et délicate, cette dernière technique est la plus couramment utilisée : au cours de cette manipulation, une suspension d'ADN est micro-injectée dans un des deux pronoyaux d'un embryon au stade une cellule. En général, le transgène s'intègre avant le stade deux cellules de sorte que toutes les cellules qui dérivent de la cellule-œuf portent dans leurs chromosomes la nouvelle séquence d'ADN (figure 1).

Le transgène s'intègre de manière aléatoire dans n'importe lequel des chromosomes, plusieurs copies s'insérant en général au même endroit dans une orientation dite tête-queue (5'-3'-5'-3'). Du fait de ce caractère aléatoire, le site d'intégration d'un transgène n'est pas le même dans les différentes lignées de souris transgéniques établies à partir d'une même construction. Le nombre de copies intégrées est également variable. Excepté dans les cas où le transgène contient une séquence particulière appelée DCR (dominant control region), telle celle décrite dans le groupe des gènes ß-globine [10, 11], il n'y a généralement pas de corrélation entre le nombre de copies intégrées et le niveau d'expression d'un transgène. Contrairement à ce que l'on pourrait croire, plusieurs articles récents laissent même penser qu'un trop grand nombre de copies peut provoquer l'inhibition de l'expression du transgène [12]. Ce phénomène est bien décrit chez la drosophile où l'on a pu montrer une inactivation non seulement en cis mais également en trans, la présence du transgène étant responsable de l'inactivation de l'expression du gène endogène portant des séquences proches (ou identiques) de celles du transgène [13]. L'influence éventuelle du nombre de copies et des séquences proches du site d'intégration sur l'expression du transgène est donc variable d'une lignée à l'autre. Seuls les patrons d'expression ou les traits communs à toutes les lignées seront imputables au transgène lui-même, d'où l'importance de dériver et d'analyser plusieurs lignées de souris transgéniques portant la même construction.

Pour s'affranchir de l'influence probable des séquences d'ADN flanquant le transgène, il est possible de l'encadrer de courtes séquences de type SCS (specialized chromatin structure), MAR (matrix attachment region) ou SAR (scaffold associated region) présentes dans de nombreux gènes [14-16]. Ces séquences riches en adénines et thymines définissent des domaines génétiques fonctionnels. Au lieu d'injecter un court fragment d'ADN, il est également possible de micro-injecter des séquences d'ADN génomique beaucoup plus grandes telles celles que contiennent les BAC (bacterial artificial chromosome), les YAC (yeast artificial chromosome) [17] ou les MAC (mammalian artificial chromosome) [18]. Bien que moins aisément manipulables et plus fragiles, ces chromosomes artificiels contenant de 100 kilobases à plusieurs mégabases d'ADN génomique permettent d'étudier des gènes ou des groupes de gènes dans leur configuration naturelle, nantis de la plupart des séquences qui assurent leur expression correcte au cours du développement et dans le tissu ou l'organe approprié. Cette approche a également l'avantage de faciliter la caractérisation et l'étude fonctionnelle de gènes en diminuant le nombre de constructions à réaliser [19-22].

Les gènes rapporteurs : une souris verte
qui courait...

Lorsque l'on a caractérisé les éléments proximaux et distaux nécessaires à l'expression correcte in vivo d'un gène, on peut fabriquer des gènes de fusion A/B dans lesquels les séquences de régulation du gène A sont accolées aux séquences codantes d'un gène B et gouvernent son expression (figure 2). Le gène B peut coder n'importe quelle molécule biologique que l'on veut surproduire ou dont on veut connaître la fonction dans un tissu donné (surexpression/ expression ectopique, c'est-à-dire dans un tissu dans lequel elle ne s'exprime pas naturellement) [23, 24]. Il peut également coder une molécule facilement repérable, telle la ß-galactosidase de
E. coli qui, en présence du substrat X-gal, « colorie » les cellules qui l'expriment en bleu, ou bien encore la GFP (green fluorescent protein) extraite de la méduse Aequorea victoria qui a l'avantage de fluorescer sans que sa mise en évidence n'endommage irrémédiablement les cellules qui la synthétisent [25-27]. Enfin, le gène B peut correspondre à un gène suicide ou coder une toxine qui provoquera la mort des cellules qui l'expriment et par contre-coup l'absence des cellules dérivées de ces cellules progénitrices [28-30]. Un exemple de cette approche, bien connu dans le domaine de la régénération hépatique, est offert par l'analyse de souris transgéniques synthétisant dans leur foie l'activateur du plasminogène de type urokinase, uPA. Une concentration plasmatique élevée d'uPA donne lieu à une hypofibrinogénémie et à une hémorragie néonatale fatale. Seules les souris chez lesquelles l'expression du transgène est abolie survivent car les hépatocytes n'exprimant pas l'uPA, par suite d'un réarrangement des séquences du transgène, prolifèrent et remplacent intégralement le foie lésé [31]. Ces souris Alb/uPA ont été par la suite très largement utilisées, en particulier dans des expériences de transplantation pour tester la capacité réplicative d'hépatocytes adultes [31, 32].

Les systèmes d'induction : promoteurs inductibles
et systèmes bigéniques

Pour ne pas courir le risque de fabriquer une souris transgénique non viable ou incapable de se reproduire du fait de l'expression délétère du transgène, il est parfois utile d'établir des lignées dans lesquelles le transgène est silencieux et dont l'expression est ultérieurement inductible de façon contrôlée. Le système le plus simple consiste à utiliser un gène de fusion dont les séquences de régulation sont inductibles après administration, par voie orale ou veineuse, de l'agent inducteur. Le promoteur du gène de la métallothionéine, dont l'expression est accrue par les métaux lourds, a largement été utilisé à cette fin [24]. Cependant, l'inconvénient de ce promoteur ou de ce type d'approche est, d'une part, que l'activité intrinsèque du promoteur n'est généralement pas nulle même en l'absence de l'agent inducteur, et, d'autre part, que le taux d'induction est généralement faible. Des systèmes plus performants se développent rapidement. La figure 3 en illustre un, basé sur l'utilisation de la tétracycline [33]. Chez la bactérie, les gènes de résistance à la tétracycline sont, en l'absence d'antibiotique, maintenus inactifs par la fixation d'un répresseur (tetR) sur une séquence particulière (tetO). En présence de tétracycline, le répresseur se détache et l'expression des gènes de résistance est activée (figure 3, A). Bujard et al. ont transformé le répresseur en activateur (figure 3, B). Ils ont ensuite développé un premier système (tet-off) dans lequel l'expression d'un gène lié aux séquences tetO est réprimée en présence de tétracycline et activée en l'absence de la drogue ; puis, ils ont mis au point un deuxième système, inverse (tet-on), dans lequel l'expression du gène n'est activée qu'en présence de drogue. Dans les deux cas, l'application de ce système à la transgenèse [34, 35] nécessite la création de deux lignées de souris transgéniques : une première qui synthétise l'activateur (tTA) (ou l'activateur modifié rtTA) dans le tissu et au moment désiré en fonction de la spécificité des séquences de régulation qui contrôlent son expression ; une deuxième qui a intégré le gène de fusion tetO-X (figure 3, B). Basés sur ce principe, d'autres systèmes bigéniques dans lesquels l'expression d'un gène couplé à un récepteur d'hormones stéroïdes [36] ou de glucocorticoïdes [37] est activée par administration d'ecdysone ou de progestérone sont en plein développement.

Le bricolage moléculaire : les recombinases Cre
et FLP

La transgenèse a également beaucoup évolué grâce à l'utilisation d'autres molécules empruntées à des bactériophages ou des levures. Sauer [38] montra le premier qu'une enzyme, la recombinase Cre du bactériophage P1, pouvait fonctionner dans les cellules d'organismes supérieurs, telles les plantes et les souris ; elle peut y reconnaître, si on les y a préalablement introduits, ses sites de reconnaissance spécifiques, appelés loxP, qui correspondent à un élément répété de 34 paires de bases. Suivant la localisation de ces sites et leur orientation, la protéine Cre peut déléter un fragment d'ADN flanqué de sites loxP, inverser son orientation ou bien encore induire une translocation chromosomique [39] (figure 4). En 1992, Westphal et al. utilisèrent les propriétés d'excision de la Cre pour activer l'expression d'un transgène codant l'oncogène T du virus SV40 [40]. Ils construisirent une première lignée de souris transgéniques dans lesquelles le gène tumoral T lié à des séquences de régulation spécifiques du cristallin (maA) était silencieux car un fragment d'ADN flanqué de deux sites loxP contenant un arrêt de transcription (stop) bloquait la production de l'oncogène (figure 5). Puis, ils croisèrent ces souris avec une autre lignée de souris transgéniques exprimant la recombinase Cre. Des tumeurs apparurent dans les yeux de tous les descendants héritant des deux transgènes car la Cre, excisant le signal stop, induisait la production de l'oncogène T. Depuis cette étude pionnière, le système Cre/loxP est largement utilisé, en particulier pour produire des lignées de souris transgéniques contenant une seule copie d'un transgène [12] ou inactiver spécifiquement un gène [41]. Un système très similaire, cette fois-ci emprunté à la levure, utilisant la recombinase FLP (prononcer « flip ») et ses sites de reconnaissance frt, a récemment fait ses preuves chez la souris [42]. Ces différents systèmes, que l'on peut utiliser simultanément, alliés à la culture des cellules ES et à la recombinaison homologue, viennent augmenter considérablement les possibilités d'introduire des mutations subtiles dans la lignée germinale [43].

REFERENCES

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