La lymphopoïèse T, à la fin d’un long voyage à travers des sites et des potentialités multiples

ARTICLE

hma.2011.0563

Auteur(s) : Amine Boudil, Vanessa Zepponi, Lamia Skhiri, Sophie Ezine sophie.ezine@inserm.fr

Inserm U1020, Université Paris-Descartes, Faculté de Médecine Necker, 156, rue de Vaugirard, 75730 Paris cedex 15

Tirés à part

Contrairement aux autres lignées sanguines, les cellules T se développent à distance de la moelle osseuse, source de leurs progéniteurs. C’est dans le thymus que ce développement se déroule pour aboutir à la génération de cellules T matures éduquées pour échapper aux processus auto-immuns. Par ailleurs, un nombre sans cesse croissant de progéniteurs est identifié dans plusieurs sites, intermédiaires probables de différentes populations en route vers leur destination ou appartenant à une même voie non encore identifiée.

Parce qu’il ne contient pas de cellules ayant la potentialité de s’auto-renouveler, le thymus doit importer périodiquement des progéniteurs hématopoïétiques. Sur ce site spécialisé, un réseau complexe de facteurs régulateurs va interagir pour inhiber les potentiels non T et produire le précurseur T (pré-T), à l’origine de tous les thymocytes. La compréhension des mécanismes qui contrôlent la génération des pré-T permettrait d’améliorer l’immunité cellulaire chez les patients âgés et de promouvoir la thymopoïèse pour augmenter les cellules T matures en périphérie. De plus, les méthodes récentes permettant de générer in vitro des précurseurs T vont ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques ; en effet, ces progéniteurs sont immédiatement compétents pour restaurer une réponse immune et peuvent être manipulés génétiquement pour le traitement des déficits immunitaires.

Origine de la voie lymphoïde T

Till et Mc McCulloch ont démontré que toutes les cellules du sang dérivent d’un type cellulaire unique, la cellule souche hématopoïétique (CSH) localisée dans la moelle osseuse [1]. Les CSH sont capables de s’auto-renouveler et de se différencier [2]. Ce sont des cellules immatures qui n’expriment pas les marqueurs des cellules matures appelés « lignage » (Lin, Lineage). Spangrude et al. ont été les premiers à identifier le phénotype des CSH. Ce phénotype sert de référence pour identifier les populations hématopoïétiques chez la souris, Lin^- Sca-1⁺ (Stem-Cell Antigen) c-kit⁺ (récepteur à tyrosine kinase, c-kit, dont le ligand est le SCF (stem-cell factor) (LSK) [3].

Les voies de différenciation utilisées par les CSH pour passer d’un état multipotent vers des progéniteurs engagés ont été longtemps débattues pour la voie lymphoïde T et le sont encore. Au cours de l’hématopoïèse adulte, de multiples routes ont été décrites au cours desquelles les progéniteurs s’engagent dans des lignées ayant des potentiels de développement très distincts. Dans un premier temps, les CSH à long terme (LT-CSH : long term), douées d’auto-renouvellement et qui peuvent reconstituer le compartiment hématopoïétique de façon infinie, se différencient en progéniteurs à durée de vie plus limitée (ST-CSH : short term). Ces CSH donnent par la suite des progéniteurs multipotents (MPP) qui ont perdu leur capacité d’auto-renouvellement et sont à l’origine de précurseurs de plus en plus restreints dans leur potentiel de développement. Un schéma initial de l’hématopoïèse avait postulé qu’après les MPP, deux voies sont possibles pour les progéniteurs : la voie de la lignée lymphoïde (CLP [common lymphoid progenitor] générant les populations B et T, NK [natural killer]) et celle de la lignée myéloïde (CMP [common myeloid progenitor] qui génère les granuleux-macrophages) (figure 1).

Cependant, de nouvelles données suggèrent un schéma de différenciation hématopoïétique différent. Dans ce nouveau schéma hématopoïétique, la population CLP descendrait directement de la sous-population de MPP VCAM-1^- Flt-3^high (LMPP) [4, 5] ; ainsi, cette nouvelle population (LMPP [lympho-myeloid progenitors]) génère principalement les cellules de la lignée lymphoïde [6]. En amont, les MPP VCAM-1⁺ Flt-3^low vont perdre le potentiel mégacaryocyte/érythroïde (en produisant le CMP), avant de générer les LMPP. Ainsi, dans cette nouvelle configuration les granulocytes/macrophages seront issus des CMP et des MPP.

Plus récemment, une population de progéniteurs multipotents (MLP [multilymphoid progenitor]) possédant les capacités T, B, NK et myéloïdes a été identifiée chez l’Homme [7]. Ces données rejoignent celles obtenues chez la souris adulte rapprochant les lignées T et myéloïdes [6]. Cependant, ces travaux viennent d’être reconsidérés et les données récentes révèlent une séparation nette des lignées lymphoïdes et myéloïdes [8]. En effet, ici, les auteurs ont généré une souris exprimant la Cre recombinase sous le contrôle du promoteur du récepteur alpha de l’interleukine 7 (IL7r) (récepteur de cytokine le plus important lors de la lymphopoïèse) permettant de suivre le développement des lymphocytes. Ainsi, les cellules pro-T descendent de cellules ayant exprimé ce récepteur, contrairement aux cellules myéloïdes. Ceci permet de démontrer que les lignées lymphoïdes et myéloïdes ne partagent pas de progéniteurs communs.

La lymphopoïèse thymique

La thymopoïèse est un processus complexe et dynamique au sein d’une structure contenant des cellules épithéliales (originaires de l’endoderme) et un mésenchyme (originaire de la crête neurale). Ces tissus attirent des progéniteurs dont ils vont assurer la différenciation et la maturation fonctionnelle [9].

Avant l’établissement de la vascularisation, les progéniteurs migrent dans le mésenchyme avant d’atteindre le compartiment épithélial. Certains expriment des récepteurs pour les chimiokines (CCR7, CCR9 et CXCR4) [10]. Après vascularisation, un grand nombre de molécules sont retrouvées sur les progéniteurs récemment entrés dans le thymus [11]. En l’absence de cellules capables de s’auto-renouveler, ce recrutement est relativement continu [12]. La nature des cellules qui s’implantent dans le thymus et leur stade d’engagement vers le lignage T sont des questions encore débattues et qui pourraient trouver leur solution dans les nouveaux modèles du poisson zèbre [13].

L’accessibilité du thymus est contrôlée, à la fois par le nombre de progéniteurs intrathymiques présents [14] et la quantité de cellules T matures en périphérie [15]. Les travaux de Rossi et al. ont montré que l’interaction de la P-sélectine, exprimée par les cellules endothéliales, avec son récepteur PSGL1, exprimé par les progéniteurs T circulants, est l’une des premières étapes de la séquence de transmigration des progéniteurs à travers l’endothélium thymique [16]. Cependant, cette migration obéit aussi à des périodes alternativement réfractaires et permissives, suggérant un autocontrôle interne, probablement régulé par l’accessibilité des niches stromales [17]. Ceci alerte sur les conditions employées lors des études expérimentales de la thymopoïèse, toujours abordée après une irradiation et greffe de moelle osseuse.

Une fois dans le thymus, les chimiokines CCR7 et CXCR4 vont guider les progéniteurs au sein des différentes zones de cellules épithéliales [18]. La caractérisation et l’identification des molécules de migration vers le thymus font l’objet de nombreux travaux. Une des applications immédiate serait l’augmentation de la colonisation thymique chez les transplantés de moelle osseuse pour qui la régénération du compartiment T est très lente [19]. Ceci n’est envisageable qu’avec un thymus possédant une fonction résiduelle, ou à défaut après greffes d’épithéliums thymiques générés in vitro.

Ainsi, en plus de la génération de cellules T matures, un rôle essentiel du thymus est de restreindre à la lignée T les progéniteurs multipotents qu’il recrute (figure 1). Au cours de ce développement, les progéniteurs qui ont colonisé le thymus vont dans une première étape acquérir la compétence T et s’engager définitivement dans le lignage αβ ou γδ, au cours de la phase TN2-3 (voir ci-dessous), puis proliférer avant de subir les événements de sélection (phase DP, SP) qui vont aboutir à la formation des cellules T matures CD4+ et CD8+ capables de quitter le thymus et de coloniser les organes périphériques. Ainsi, la production de cellules T est caractérisée par la différenciation de vagues successives de progéniteurs ayant perdu leur auto-renouvellement. Dans le thymus, chaque progéniteur subit environ 20 divisions relativement symétriques pour générer un large pool de cellules immatures qui seront sélectionnées ; environ 12 de ces divisions se déroulent en 14 jours au sein de la population TN [20]. Chaque vague de différenciation dure environ 3 semaines.

La majorité des précurseurs intrathymiques n’exprime pas les marqueurs CD3, CD4 et CD8, et est donc appelée thymocytes triples négatifs (TN) (ou doubles négatifs DN [CD4, CD8]). Ils représentent 1 à 2 % des thymocytes totaux et sont subdivisés en 4 sous-populations selon le profil d’expression de la molécule d’adhésion CD44 et la chaîne α du récepteur à l’interleukine 2, CD25 (IL2Rα) [21, 22]. La population qui assure une thymopoïèse efficace et complète est ckit + CD44⁺CD25^- (appelée ETP, 0,01 % du thymus); elle s’implante dans une niche située au niveau de la jonction cortico-médullaire, très vascularisée, et y sera abritée pendant 10 jours, au cours desquels une intense prolifération aura lieu [23]. Celle-ci est importante étant donné le faible nombre de cellules qui peut accéder à l’organe. Les ETP sont multipotentes, mais possèdent une activité B réduite ; les potentialités NK, DC et myéloïdes sont nécessaires pour assurer, au moins partiellement, la maturation de ces lignées dans le thymus (notamment la présentation d’antigènes assurée par des B, macrophages ou DC). Cependant, d’autres progéniteurs plus restreints (en termes de potentialités) contribuent aussi à la thymopoïèse. Ainsi, un environnement thymique fonctionnel est favorable au développement de plusieurs lignées qui soutiendraient (par la production de facteurs solubles et molécules d’adhérence ?) ce développement T. Lors des conditionnements pour les transplantations de moelle osseuse ces processus sont vraisemblablement altérés.

Les ETP se différencient en cellules TN2 et gagnent l’expression du marqueur CD25. Les TN2 génèrent ensuite les cellules TN3, CD44^-CD25⁺, qui à leur tour se différencient en TN4 (CD44^-CD25^-). Durant cette progression, ces progéniteurs vont perdre séquentiellement les potentialités non T, et acquérir les caractéristiques de l’identité T. C’est chez la souris que ce développement a été le mieux étudié, mais des stades similaires sont retrouvés chez l’Homme [24]. Chacun de ces stades est le siège d’événements cruciaux pour l’engagement dans la voie T. En effet, les ETP ont un potentiel B réduit mais conservent leur potentiel de développement en cellules NK (NK1.1⁺) et en cellules dendritiques DC (CD11b⁺CD11c⁺), ainsi qu’un potentiel de génération de macrophages (CD11b⁺F4.80⁺) [25–27]. Les progéniteurs TN2 initient leur migration de la jonction cortico-médullaire pour se localiser au niveau de la partie interne du cortex, où elles y résident pendant 2 jours [23]. Aucune génération de lymphocytes B (CD19⁺) n’a été détectée, par contre ces cellules sont toujours capables de générer des cellules T et myéloïdes (CD11b⁺) [28]. À ce stade, l’expression de l’ARNm de Rag1 est fortement augmentée et des réarrangements des loci du TCR-γ et du TCR-δ, ainsi que DJβ sont détectés [29, 30]. Nos travaux montrent que l’utilisation combinée des trois marqueurs (CD44, CD25 et cKit), permet d’identifier au sein de la fraction TN2 (CD44⁺CD25⁺), deux intensités d’expression de cKit : cKithi (population TN2E) et cKitlo (population TN2L). Les profils de co-expression génique révèlent que la population TN2E est essentiellement Rag1-CD3ε-pTα-, alors que la TN2L est Rag1 ± CD3ε ± pTα-. La population TN2L possède donc une signature T plus avancée : elle est dépourvue de potentialité DC et NK contrairement à la population TN2E, mais génère efficacement des lymphocytes T. Ainsi, la population TN2L représente le premier stade d’engagement vers la lignée T dans le thymus. Au stade TN3, seule la potentialité T est présente ; ces précurseurs T siègent dans le cortex externe et s’y multiplient. Toutes les cellules sont ckit^- CD25+ CD44- et caractérisées par l’expression du pré-TCR en surface [31]. Les populations TN3 concentrent toute l’activité pré-T dans le thymus.

Ainsi, dès leur entrée dans le thymus, des mécanismes qui commencent à être élucidés vont renforcer le développement T et inhiber les autres potentiels. L’activation de la signalisation par le récepteur Notch1 et l’un de ses ligands est l’étape initiale à l’engagement T ; il n’est pas clair si ce signal est reçu dans le thymus ou à l’extérieur. L’absence de cette signalisation conduit au développement d‘autres lignées dans le thymus [32, 33].

Développement lymphocytaire T in vitro et intérêts thérapeutiques

Le thymus représente donc un environnement spécifique pour le développement et la génération en très grand nombre de lymphocytes T à partir des progéniteurs de la moelle osseuse. Les multiples facteurs environnementaux impliqués ne sont pas encore identifiés. En fait, ces études ont longtemps souffert du manque d’un système de culture in vitro, contrairement au lignage B [34]. La présence de progéniteurs T était le plus souvent analysée in vivo après greffe de cellules d’intérêt à des animaux irradiés ou in vitro en culture organotypiques de lobes thymiques fœtaux. La culture des lobes thymiques (fetal thymic organ culture [FTOC]) permet aux CSH d’être différenciées en cellules T, dans un environnement tridimensionnel où l’on peut moduler les facteurs de croissance [35]. Cependant, ce système avait un certain nombre d’inconvénients : coÛt élevé, rendement cellulaire limité (peu de cellules étaient produites, et donc la culture de plusieurs dizaines de lobes était nécessaire) et longue durée d’expérimentation (préparation des gestantes contrôlées, prélèvement de lobes thymique fœtaux à jours 12-14 de la vie embryonnaire, de plusieurs fœtus). Plus récemment, un autre système in vitro très performant a vu le jour.

L’échec des tentatives de production de cellules T en présence de lignées stromales dérivées de la moelle osseuse ou bien du thymus a montré la nécessité d’un ou plusieurs facteur(s). À la fin des années 1990, deux articles importants ont mis en avant le rôle de la signalisation Notch pour la spécificité T par rapport à B [36, 37]. Parallèlement, Schmitt et Zúñiga-Pflücker ont constaté que le ligand de Notch, Delta-like 1 (Dll-1), est fortement exprimé par le stroma thymique du fœtus ; en revanche cette expression est complètement absente pour le stroma OP9 dérivé de la moelle osseuse. La lignée stromale OP9 était bien connue pour assurer la différenciation des cellules myéloïdes, B et NK après coculture avec des progéniteurs hématopoïétiques en présence d’une combinaison appropriée de cytokines et de facteurs de croissance [38, 39]. D’où l’idée de transformer la lignée cellulaire OP9 pour lui faire exprimer le ligand Dll-1: OP9-DL1 n’est plus capable de supporter le développement de cellules B à partir des CSH, mais a gagné la capacité d’inciter/de promouvoir l’engagement T in vitro avec une différenciation identique à celle observée dans le thymus [40]. Environ 2 000 à 5 000 fois plus de progéniteurs peuvent être obtenus selon cette technique. Les cellules stromales du thymus expriment fortement un autre ligand, Dll-4, qui semble jouer un rôle efficace dans le développement des cellules T, avec la capacité d’inciter le développement vers le lignage T de façon plus importante que Dll-1 [41]. Delta-like 4 est fortement exprimé dans la région sous-capsulaire et le cortex externe, alors que Dll-1 est plus fortement exprimé à la jonction cortico-médullaire, site d’entrée des progéniteurs [42]. Ces travaux indiquent aussi qu’à concentration de ligands faibles, Dll-4 est plus puissant à induire un développement T avec une inhibition de l’activité B. Dll-4 permet une activation significative du signal Notch des CSH et donc une meilleure activation des gènes cibles pour inciter l’engagement T. Ces découvertes ont permis la mise en place d’un système in vitro simple permettant de développer de façon importante des cellules T matures à partir d’une seule cellule progénitrice. Des résultats identiques ont été obtenus chez la souris avec des progéniteurs Lin- et chez l’Homme avec des progéniteurs CD34⁺ [43, 44]. Ainsi, la culture de CSH sur ces stromas OP9-Dll1 ou -Dl4 en présence des cytokines IL-7 et FLT3-L génère un grand nombre de précurseurs T et NK, en 3 semaines environ et produit des T matures.

Contrairement à Dll-1, la force de liaison de Dll-4 avec les thymocytes immatures semble plus importante. Par ailleurs, il a été établi que l’interaction de Dll-4 avec son récepteur s’effectue plus fortement, entre les TN1 et TN3, ensuite elle diminue au stade TN4 et devient indétectable aux stades plus matures, DP et SP [45, 46]. Afin de mieux disséquer le rôle de Dll-4, les deux équipes de F. Ratdke et S. Habu ont permis d’établir une lignée de souris transgénique, chez laquelle le gène Dll-4 est inactivé de manière conditionnelle dans les cellules épithéliales du thymus (système Foxn1-Cre) [47, 48]. Ils ont ainsi démontré que cette délétion provoque un blocage complet du développement T au stade TN1, accompagné par un développement ectopique de cellules B dans le thymus.

En conclusion, même si Dll-1 et Dll-4 sont fonctionnellement redondants dans leur capacité à promouvoir le développement T in vitro, il est évident qu’in vivo Dll-4 est le partenaire physiologique de Notch1 dans le processus de la lymphopoïèse T. Cette différence d’expression de Dll-4 dans le thymus pourrait constituer un gradient auquel l’intensité de l’interaction Dll-4/Notch1 augmenterait progressivement de la medulla vers le cortex. Ce gradient pourrait ainsi moduler la force de la signalisation Notch1 lors du passage des stades pro-T (ETP et TN2) au stade pré-T (TN3). Il serait ainsi impliqué dans l’induction graduelle de l’engagement vers la lignée des lymphocytes T, par la perte progressive des potentialités : B, myéloïde et NK.

La découverte du rôle clé joué par le récepteur Notch1 et ses ligands DII-1 et DII-4 dans l’engagement T, permettrait de pouvoir utiliser, dans la pratique médicale, les progéniteurs lymphoïdes pour augmenter la reconstitution T [49]. Cette approche peut accélérer la réponse immune et l’activité antitumorale chez les patients immunodéficients, tels que ceux sous forte chimiothérapie ou ayant subi une greffe de moelle osseuse allo- ou autologue. Ces progéniteurs protègent aussi contre les infections opportunistes rencontrées chez certains sujets infectés. Pour éviter de recontaminer ces progéniteurs générés in vitro, il est indispensable de manipuler génétiquement ces populations pour les rendre résistantes à l’infection du patient [50]. D’autres essais ont été réalisés dans des infections VIH [51] et des traitements antitumoraux [52].

La restauration d’un système immunitaire dépend aussi d’une structure thymique fonctionnelle. Ainsi, suite à une fonction thymique qui décline, plusieurs stratégies ont été utilisées afin d’augmenter la thymopoïèse : l’utilisation de facteurs de croissance et d’hormones (l’IGF1 [insulin growth factor 1], le KGF [keratinocyte growth factor], les interleukines 2, 7, 12 et 15 [53]. Ces traitements permettent de restaurer la capacité cellulaire d’un thymus en involution (vieillissement, conditionnement pour les greffes de cellules souches, radiothérapies, chimiothérapies, etc.).

La machinerie moléculaire de l’identité T

Contrairement à la différenciation des lymphocytes B où Pax5 a été intronisé comme « master gene » [54], aucun candidat équivalent n’a à ce jour été mis en évidence pour la lignée T. Cependant certains gènes ont déjà leur place dans le réseau qui va conduire à l’établissement de cette identité (tableau 1). En effet, avant d’atteindre son but (devenir une cellule pré-T au stade TN3), le progéniteur qui a colonisé le thymus va passer par toutes les autres potentialités depuis son entrée (stade ETP) jusqu’à ce stade (transition TN2-TN3).

Tableau 1 Expressions et fonctions des facteurs étudiés dans la différenciation et l’engagement vers la lignée T

La spécialisation T est initiée quand les progéniteurs rencontrent les ligands de la famille Delta-like du récepteur Notch1 dans l’environnement thymique ou en amont. Auparavant, dans la moelle osseuse, le passage de la CSH vers le progéniteur lymphoïde CLP, s’accompagne de la perte de l’expression de Gata2 et Lmo2 [55]. Le maintien de Lmo2 dans les thymocytes induit l’expression de plusieurs gènes associés normalement aux CSH et réprime les gènes T de différenciation [56]. Par ailleurs, la perte de Gata2 (qui joue un rôle dans le développement et la prolifération des CSH et MPP) est initiée dès les stades MPP, ce qui laisse la possibilité du branchement d’une voie lymphoïde à ce stade.

Dans le thymus, au sein des progéniteurs, la co-expression de Notch1 et d’autres partenaires à identifier, va se mettre en place. Ainsi au cours de leur différenciation, ces thymocytes vont devoir prendre plusieurs décisions : après s’être affranchi des potentiels de toutes les autres lignées sanguines, la cellule pré-T va continuer à faire des choix d’engagement dont le plus précoce sera celui de l’orientation vers les lignées αβ ou γδ, réalisé au cours de la transition TN2-TN3.

Le gène important pour l’engagement T est Notch1. La famille Notch comprend 4 récepteurs transmembranaires, représentatif d’une ancienne famille très conservée de régulateurs du développement décrite, dans un premier temps, pour son rôle dans la neurogenèse chez l’embryon de Drosophila melanogaster [57]. Seul Notch1 possède un rôle primordial dans les phases précoces du développement T (voir ci-dessus). Notch2 est plus fortement exprimé dans la moelle osseuse que Notch1, cependant Notch1 est plus fort dans les ETP. Il n’est pas encore clair si le rôle essentiel de Notch1 est fonction de la qualité ou de la quantité du signal.

Chez la souris, Notch1 et ses gènes cibles (CD25, Gata3, pTα, etc.) sont intensément exprimés dans les TN1-3 avant la phase de la sélection-β, par la suite, leur expression baisse de manière non négligeable [58, 59].

Les greffes par voie intrathymique et intraveineuse de cellules de moelle osseuse de souris déficientes pour Notch1, induisent un développement ectopique de cellules B dans le thymus des souris receveuses, alors que le développement T est bloqué dès le stade TN1 [37]. Par ailleurs, la transduction de progéniteurs par un vecteur rétroviral, qui code pour une forme de Notch1 constitutivement active (Notch1IC), génère des cellules DP (CD4+CD8+) au niveau de la moelle osseuse et un blocage précoce de la différenciation B.

La capacité du signal Notch à bloquer l’accès aux voies de différenciation myéloïde et DC a été clairement établie, même dans des conditions de surexpression de facteurs myéloïdes comme C/EBP et Pu1 [32, 33]. En réponse à la surexpression de Pu1, l’impact immédiat de Notch est de maintenir l’expression des facteurs de transcription nécessaires au stade pro-T. Cela peut être interprété comme un effet « protecteur » des gènes T par Notch, contre une potentielle baisse d’expression médiée par Pu1. Ce mécanisme protecteur s’étend à plusieurs gènes T, codant pour des facteurs de transcription, comme C-myb, les protéines E, Bcl11b, Gfi1 et Tcf1.

Aux stades plus tardifs, les molécules de la famille Notch jouent un rôle plus complexe, à la fois au cours des événements de sélection dépendants du TCR et la différenciation des cellules T matures en périphérie. Des essais in vitro, ont montré que l’interaction Notch/Delta est nécessaire au niveau de la β-sélection, pour à la fois soutenir la prolifération et la différenciation, complétant ainsi les signaux générés par le pré-TCR [60–62].

Les protéines E sont des régulateurs positifs de la transcription de Notch1 au cours du développement des thymocytes [63, 64]. Ainsi, les lignées E2a-/- présentent une forte réduction de l’expression de Notch1 et de ses gènes cibles (Hes1, Deltex, pTCRa, CD25); de plus les CSH- E2a-/- ne génèrent pas de cellules T en culture sur un stroma compétent OP9-DL1. Par ailleurs, la signalisation par le pré-TCR augmente l’expression de Id3 dans les TN3 et inhibe l’activité des protéines E, conduisant rapidement à une diminution de la transcription de Notch1 [65]. Un des régulateurs négatifs de Notch1 est la protéine p53 [66].

Un gène cible de Notch1, Gata3, est impliqué dans l’engagement T mais sa fonction n’est pas encore déterminée. Gata3 est un facteur de transcription à doigts de zinc qui lie l’ADN au niveau d’une séquence spécifique composée d’une série de quatre nucléotides, GATA [67]. Les souris Gata3 KO sont létales, au cours de la gestation à cause de malformations cardiaques [68]. Des oligonucléotides antisens inhibent le développement T, de précurseurs du foie fœtal, in vitro [69]. Ainsi, Gata3 a été considéré pendant longtemps comme le gène de l’engagement vers la lignée T. Il contrôle aussi directement ou indirectement le développement des cellules T [70] et des NK thymiques [71]. Il est indispensable pendant la phase de β-sélection au stade TN3 (CD44-CD25+) et pour la génération des cellules T CD4+ matures [72].

En dépit de son implication dans la progression du processus de différenciation T, Gata3 n’est pas un simple gène équivalent aux gènes « clés» spécifiques de lignée comme, Gata1 pour les érythrocytes et Pax5 ou Ebf pour les cellules B. L’expression forcée de Gata3 dans les CSH n’améliore pas le processus de différenciation T : elle le bloque complètement. La forte expression de Gata3 dans les CSH de souris adultes induit une différenciation en mégacaryocytes [73], alors que dans les thymocytes précoces du fœtus, cela induit une différenciation en mastocytes [74]. La conversion en mastocytes est efficacement bloquée par le biais de la signalisation Notch1. Quand l’interaction Notch-Delta se produit, l’expression forcée de Gata3 bloque la survie des cellules, induisant ainsi la rupture du processus de différenciation en mastocytes.

Cette surexpression de Gata3 provoque temporairement une forte baisse d’expression de Pu1 dans les ETP et TN2, et une augmentation de l’expression du gène « mastocyte » MITF (microphthalmia associated transcription factor), ainsi que des deux autres membres de la famille GATA, Gata1 et Gata2. Par la suite, d’autres gènes codant pour des facteurs de transcription « mastocytes » sont induits, SCL (Tal1) et Gfi-1b, alors que les gènes T sont encore plus réprimés. L’émergence de cellules viables est alors dépendante du retrait du signal Notch. Les cellules acquièrent ainsi un phénotype de précurseurs de mastocytes c-Kit^hiThy-1^loCD27⁻. Ces cellules achèvent leur maturation en présence de cytokines spécifiques aux mastocytes et acquièrent le phénotype FcγRI⁺. Dans des conditions normales, le facteur clé responsable de l’initiation de la différenciation des mastocytes est Gata2. Vu la forte homologie des séquences peptidiques entre GATA2 et GATA3, l’expression de GATA3 à fortes doses pourrait mimer la fonction de GATA2 et permettre d’ouvrir l’accès à la voie des mastocytes en activant des gènes, normalement régulés par GATA2.

Gata3 est potentiellement un candidat « gardien » de l’identité T : il serait capable d’exercer une action antagoniste sur l’option myéloïde dans un contexte normal. La conversion vers la voie myéloïde, sous l’influence de la surexpression de facteurs de transcription myéloïdes comme C/EBP et PU.1, est inhibée par la co-expression de Gata3 [32] : l’augmentation du niveau d’expression du gène codant pour le marqueur myéloïde Mac-1 (CD11b) est bloquée. Toutefois, dans cette étude, il reste à définir comment Gata3 inhibe l’option myéloïde : est ce qu’il agit en empêchant une baisse d’expression de Notch et des protéines E, qui sont requises pour un développement T complet ?

L’établissement d’une lignée de souris exprimant le gène rapporteur lacZ sous le contrôle du promoteur de Gata3, a permis de montrer que son expression augmente dans le thymus, une première fois, au cours de la phase de β-sélection et une deuxième fois, au cours de l’engagement vers la voie des cellules matures CD4⁺ [75].

Gata3 joue un rôle fonctionnel : il est impliqué dans la régulation de l’expression de plusieurs gènes nécessaires à la lignée T, en fixant directement le promoteur de Rag2, les enhancers de TCR et une région régulatrice de CD8 [76-78].

La signalisation Notch1 est nécessaire pour la fonction de Gata3 et cette signalisation, seule, n’est pas suffisante pour assurer la spécialisation T [79].

Une étude récente a montré que l’activité du gène Gata3 était essentielle au stade ETP, et qu’il n’avait aucun rôle dans la survie et la prolifération de ces progéniteurs [80]. Ainsi, même si Notch1 est exprimé avant Gata3 dans les progéniteurs médullaires, que toutes les ETP co-expriment ces 2 gènes, la relation Notch1-Gata3 reste encore peu claire.

Un autre facteur dont l’expression est augmentée dans les progéniteurs dès leur entrée dans le thymus, est Hes1 (hairy and enhancer of split 1), un des gènes cibles de Notch, un facteur de transcription de la famille bHLH. Il agit en homodimère pour exercer une fonction de répresseur transcriptionnel, en se fixant sur des régions appelées N boxes et en recrutant un autre répresseur transcriptionnel Groucho [81, 82]. La souris Hes1 déficiente meurt pendant la gestation suite à un défaut dans le développement du système nerveux. Quatre-vingt-dix pour cent des embryons KO sont dépourvus de thymus, alors que chez les 10 % restants, la taille du thymus est très réduite. Aucune cellule T mature n’est détectable dans ces thymus. Les données obtenues à partir de la souris déficiente pour Hes1 indiquent que ce facteur est requis pendant le développement T [83]. Les souris reconstituées avec des cellules du foie fœtal Hes1KO, ont un compartiment T complètement bloqué au stade TN1. Par ailleurs, la surexpression de Hes1 par transduction rétrovirale de progéniteurs de moelle osseuse, montre l’absence de développement des lignées myéloïde et B chez les souris receveuses alors que le compartiment des cellules T est efficacement reconstitué avec une distribution normale entre les SP CD8 et SP CD4 [84]. Ainsi, Hes1 pourrait avoir un rôle dans la prolifération plutôt que l’engagement vers le lignage T.

Enfin, l’induction d’une expression constitutive de Hes1 dans le thymus, par la génération d’une lignée de souris transgénique dont l’expression de Hes1 est sous le contrôle du promoteur Lck, génère des lymphomes thymiques de cellules T matures avec une faible pénétrance ; dans ces cellules, la surexpression d’Hes1 augmente les niveaux d’expression des gènes Notch1, Notch3 et C-myc [85]. Hes1 possède une activité oncogénique et pourrait donc augmenter le pouvoir tumorigène des gènes qu’il active.

Un troisième gène, Bcl11b, vient de rentrer dans cette catégorie, grâce à la génération de souris mutantes. Bcl11b (Rit1/Ctip2) est un gène suppresseur de tumeur. Il a été identifié par son implication dans l’induction de lymphomes thymiques, induits par des rayons gamma [86, 87]. Chez l’Homme, il existe des recombinaisons chromosomiques aberrantes au niveau du locus Bcl11b, trouvées de façon récurrente dans les leucémies T [88, 89]. Bcl11b code pour un membre de la famille des protéines à doigts de zinc [86] et interagit avec le complexe de déacétylase d’histones, dont le facteur Sirt1, impliqué dans le remodelage du nucléosome, qui représente l’un des complexes majeurs de répression transcriptionnelle chez les cellules de mammifères [90]. Toutefois, les gènes cibles de Bcl11b ne sont pas connus. Sa délétion dans la lignée germinale altère les phases précoces du développement T causant un blocage au stade TN3 et une augmentation de l’apoptose reflétée par un nombre de thymocytes très réduits [86]. Sa surexpression contribue à une augmentation de l’expression de la chimiokine CCR9 dans l’embryon de poisson [91]. L’expression de ce gène est détectée dans la population TN2, et persiste ensuite au cours de la thymopoïèse ; les niveaux d’expression les plus élevés sont détectés dans les progéniteurs thymiques. La délétion de Bcl11b dans ces progéniteurs entraîne la génération de cellules NK dans le thymus et l’expression des gènes T spécifiques (Notch1, Gata3, TCF1) est très réduite [92]. Ainsi, son expression empêche les cellules T de s’engager dans le lignage NK. Bcl11b est donc appelé « gardien de l’identité T ». La concentration en IL7 pourrait jouer un rôle dans la surexpression de ce facteur [93].

Le facteur TCF1 (T cell Factor-1) et son partenaire LEF1 (lymphoid enhancer factor-1) sont les effecteurs nucléaires de la voie Wnt. Ils sont requis à la fois au cours de la phase de transition TN1/TN2 et la β-sélection [94]. Chez la souris, la fonction de TCF1 devient de plus en plus importante en fonction de l’âge, pour la génération de vagues de précurseurs T qui puissent atteindre le stade TN2 [95]. En réponse à la signalisation de Wnt, la β-caténine migre dans le noyau et converti TCF1 de répresseur par défaut à activateur [96, 97]. Si ces antagonistes de la voie Wnt sont introduits, la différenciation T est alors bloquée dès le stade TN1. Il n’a pas été encore démontré si le complexe TCF1/LEF1 fonctionne en activant les gènes de l’identité T. Les microarrays réalisés ont montré que l’activation de la voie Wnt dans les thymocytes induit surtout l’expression des gènes du cycle cellulaire et ceux codant pour les molécules d’adhésion [98]. En absence de TCF1, la cellularité thymique chute ; il pourrait servir à réguler IL7Ra, BCL-XL et les facteurs T spécifiques CD3e et CD4.

Une étude clé de l’équipe de Tenen a mis en évidence un élément cis-régulateur « bifonctionnel » de l’expression du gène Pu1 [99]. À travers cet élément, TCF1 pourrait contrôler à la fois l’expression précoce de Pu1 et sa répression plus ultérieurement, au cours du développement T. Pu1 peut lui même réprimer l’expression du gène TCF1 [33]. Cela implique qu’au cours de la transition TN2-TN3, les deux régulateurs transcriptionnels Pu1 et Tcf1 s’opposent l’un à l’autre dans un cycle de répression mutuelle pour déterminer le choix d’engagement vers la lignée T versus celle des DC. Puisque l’extinction de Pu1 au stade TN3 coïncide avec une augmentation des niveaux d’expression des gènes spécifiques à la lignée T, le complexe TCF1/Lef1 pourrait vraisemblablement participer à la régulation positive des gènes.

De concert avec Notch, Ikaros joue aussi un rôle clé [100].

Ikaros1 : au moins deux autres membres (Aiolos et Hélios les mieux connus) de cette famille sont exprimés dans le thymus, en partie de façon continue depuis les stades de progéniteurs hématopoïétiques. La lignée de souris déficiente pour Ikaros1 n’a pas de développement T au stade fœtal mais présente un développement T au stade postnatal [101].

Il semble donc que le facteur Ikaros1 soit indispensable pour le développement T au cours de la vie fœtale, mais que des mécanismes partiellement compensatoires se mettent en place à partir de la naissance. Cependant, ces hypothétiques mécanismes ne sont pas suffisants au cours de la vie adulte puisque les étapes de prolifération aux stades TN et DP sont altérées, le nombre de cellules TN3 est largement diminué et la différenciation est complètement dirigée vers la lignée SP CD4.

Georgopoulos et al. ont produit des souris, dont le domaine de liaison à l’ADN de la protéine Ikaros a été supprimé [101]. Ces souris expriment donc une protéine Ikaros non fonctionnelle appelée dominant négatif (DN de la protéine Ikaros). Ces souris Ikaros DN KO meurent en 3 semaines d’infections graves et aucune cellule T, B, NK ou DC n’est générée.

Les cellules DP Ikaros KO ne prolifèrent pas, indiquant que la protéine Ikaros est également importante pour la prolifération en réponse à la signalisation du TCRβ. Ainsi, Ikaros serait impliqué dans la signalisation du TCR. D’autre part, les souris Ikaros KO meurent en 3 mois de lymphomes T, cela suggère qu’Ikaros est un gène suppresseur de tumeur en présence de la signalisation du TCR. Une étude récente a montré qu’Ikaros peut réprimer la transcription des gènes cibles associés à Notch ; cela contribue probablement à sa fonction de suppresseur de tumeur [102].

Les gènes suivant participent à la mise en place du programme T, soit parce que leur extinction inhibe la phase TN2 (Gfi1), soit parce qu’ils se maintiennent avec une faible expression durant cet engagement (Pu1).

Gfi1: le facteur de transcription Gfi1 est important à la fois pour le développement des cellules T, des DC et des neutrophiles [103, 104] : leur génération est fortement altérée chez les souris déficientes pour ce gène.

Chez la souris Gfi1 déficiente, le développement T est partiellement bloqué entre la transition TN2-TN3, alors que le compartiment TN1 est dépourvu de cellules de phénotypes cKit^hiIL-7R^lo [105, 106]. De plus, cette souris présente une production altérée de cellules SP CD4 et une production soutenue de SP CD8, en comparaison avec la souris sauvage. Ces perturbations sont concordantes avec le profil d’expression de Gfi1 dans le thymus, qui est induit dans les cellules TN2 et persiste jusqu’au stade DP [107]. Gfi1 pourrait être impliqué dans la répression de l’expression des membres de la famille Id, puisque dans le thymus de souris Gfi1^−/−, les gènes Id2 et Id1 sont exprimés de manière aberrante, à des niveaux très élevés [106]. Il semblerait que Gfi1 interfère avec l’activité transcriptionnelle de Pu1 par une interaction protéique directe [108]. Dans le contexte du développement T, il est possible que Gfi1 soit utilisé de façon analogique pour maintenir l’identité T s’opposant à la fois à Pu1 et Id2, pour réprimer respectivement les autres alternatives du développement DC et NK.

Pu1 : Pu1 possède un double rôle, il est en effet impliqué à la fois dans la différentiation myéloïde et lymphoïde [109]. À fortes doses d’expression, Pu1 induit une différenciation myéloïde alors qu’à faibles doses, il favorise une différenciation vers la lignée des lymphocytes B, par l’induction de l’expression de l’IL7Rα [110].

La lignée de souris Pu1 déficiente est létale au stade périnatal, suite à une forte altération de l’ensemble du système hématopoïétique, observée également au stade fœtal [111-113]. Concernant le développement T, il a été démontré que la souris déficiente pour le gène Pu1 présente un défaut dans la génération des lymphocytes T. Toutefois, son expression dans les thymocytes est exclusivement restreinte aux stades précoces TN1 et TN2 et il semble qu’elle soit hautement corrélée avec le potentiel myéloïde maintenu à ces stades [25, 114]. Les thymocytes Pu1 déficients ne peuvent pas générer de DC in vitro [115]. Aux stades thymiques plus tardifs, où Pu1 est éteint, la transduction de Pu1 restaure la capacité de développer des monocytes/DC [32, 33, 115, 116]. Ainsi, tant que Pu1 est exprimé, il a la capacité de préserver le potentiel myéloïde aux stades pro-T TN2. Quand l’expression de Pu1 est forcée aux stades TN2 et TN3, il a la capacité de « démanteler » l’identité T des thymocytes. Au premier jour post-transduction, Pu1 fait baisser légèrement l’expression de plusieurs gènes T [33]. Cet effet répresseur est accompagné d’une augmentation de l’expression du gène myéloïde CD11c. Ainsi, l’un des rôles de Pu1 in vivo serait de ralentir le processus de différenciation T pendant la phase intensive de prolifération aux stades pro-T. La surexpression de Pu1 dans les TN2 et TN3 ne permet pas la reconversion de ces cellules si elles reçoivent un signal continu de Notch1 [32, 33]. Sous ces conditions, elles peuvent se développer en DP. Ainsi, Notch peut moduler la réponse à la surexpression de Pu1. Le rôle du signal Notch consisterait donc à protéger les gènes de l’identité T contre l’effet suppresseur de Pu1.

Comme mentionné au début, les populations ETP, TN2 et TN3 sont dépourvues de potentialité B, ce qui démontre que cette activité est réprimée rapidement après l’entrée dans le thymus. Notch pourrait induire directement ou indirectement l’extinction des gènes EBF1 et Pax5, gènes B spécifiques [117]. La suppression des autres potentiels est orchestrée par Notch et ses gènes cibles suivant une chorégraphie qui reste encore à déterminer ; elle doit aussi mettre en valeur ses partenaires et la dose à laquelle ils interviennent.

Les précurseurs extrathymiques et les fuites du thymus

Plusieurs précurseurs peuvent être retrouvés en circulation, déjà restreints à la lignée T avant leur entrée dans le thymus, et présents dans différents organes (dont les ganglions, le sang, la moelle osseuse, la rate et l’intestin) ce qui suggère qu’il existe des environnements extrathymiques favorables à la génération, la survie et la prolifération des précurseurs T. Ces précurseurs doivent coloniser le thymus pour terminer leur différentiation en cellules T matures. Il est ainsi possible qu’ils contribuent au développement T en contournant les premières étapes de différenciation intrathymique (figure 2, tableau 2).

Tableau 2 Localisation, phénotype et fonctions des progéniteurs des lymphocytes T

Dans la MO, des précurseurs T capables de générer des cellules T matures et fonctionnelles (CD4⁺ et CD8⁺ TCRαβ⁺) après culture pendant 48 h ont été identifiés par l’équipe de S. Strober [118]. Cette population a pour phénotype Lin^- Sca1^lowcKit^lowIL7Ra^-/lowCD44⁺Thy1 ⁺CD2^- [119]. Un autre travail identifie, après greffe de moelle osseuse, des précurseurs T dans la rate [120, 121]. Des précurseurs de phénotypes identiques sont aussi retrouvés dans la rate de souris (C57Bl6) et nude (souris athymique) non manipulées. La sous-population de ces précurseurs Lin-Thy1+ CD25+ ne génère in vitro que des cellules T et est donc complètement restreinte à la lignée T. Cette population est ainsi engagée dans la lignée T indépendamment du thymus mais doit compléter sa différenciation T dans le thymus [122]. La présence des ligands Delta-like 1 dans la rate permet la génération de précurseurs T, celle de Delta-like 4 dans l’épithelium thymique permet d’assurer la différenciation en cellules T matures [41].

Des précurseurs T ont été aussi caractérisés dans le sang fœtal de souris contrôles [123] et le sang adulte de souris transgéniques [124]. Des phénotypes similaires sont retrouvés Lin^-Sca1⁺cKit^lowIL7Ra^lowCD44+. Une seule étude a décrit chez les souris transgéniques exprimant l’oncostatine M, une population de précurseurs c-kit^low IL-7Rα⁺ qui sont bloqués en phase G1 du cycle cellulaire à un stade CD44⁺ CD25^low (TN1) [125]. Par ailleurs, à la base de certaines cryptes intestinales, de petits agrégats d’environ un millier de cellules lymphoides appelées cryptoplaques, Saito et al. ont retrouvé des cellules immatures de phénotype Lin^- Thy-1⁺ c-kit⁺ IL-7Rα⁺ CD25⁺. Ces progéniteurs, in vivo, génèrent des LIE (lymphocytes intra-épithéliaux) de façon thymo-indépendante [126].

Il est impossible d’affirmer si l’ensemble des précurseurs décrits ci dessus sont des intermédiaires d’une même voie de différenciation ou s’ils proviennent de voies différentes (car ces différentes populations possèdent des marqueurs communs). Ces différents précurseurs extrathymiques pourraient constituer des compartiments de réserve en cas de lymphopénie, permettant une génération T plus rapide après colonisation du thymus que celle réalisée par les précurseurs pluripotents de la moelle osseuse, d’où leur intérêt majeur en thérapie. Ainsi, l’origine des précurseurs T extrathymiques et leur relation aux précurseurs intrathymiques nécessitent d’autres travaux.

Le thymus a toujours été considéré comme un site d’export de cellules T matures, or il a récemment été démontré que des progéniteurs T Lin^- CD44⁺ pouvaient sortir du thymus et coloniser les organes lymphoïdes [127, 128]. L’export des thymocytes matures s’effectue au niveau de la jonction cortico-médullaire [129]. Les thymocytes exportés rejoignent la circulation sanguine, lymphatique, ou probablement les deux à ce niveau. L’expression de S1P₁ est fortement augmentée au niveau de la transition entre les thymocytes DP et les thymocytes SP les plus matures [130, 131]. Le récepteur 1 de la sphingosine-1-phosphate, S1P₁ (sphingosine-1-phosphate receptor 1), couplé aux protéines G, est impliqué dans le développement du système vasculaire [132] et est nécessaire à l’export des lymphocytes T du thymus [131]. Son ligand, la S1P (Sphingosine-1-Phosphate), est présent à plus forte concentration dans le sang et la lymphe que dans les tissus lymphoïdes. Il semble que l’export des thymocytes soit médié par un gradient de S1P (établi par l’activité de la S1P lyase) [133, 134]. La régulation des molécules qui participent à la migration hors du thymus est encore inconnue.

Conclusion

Ainsi, une sous-population de progéniteurs encore à caractériser, quitte la moelle osseuse pour entrer dans le thymus et initier le développement de la lignée T. Au cours des étapes extra- et intrathymiques, les potentiels non T sont graduellement perdus sous le contrôle des facteurs de transcription et des signaux de l’environnement. L’engagement final dans la voie T est acquis/complété dans le thymus. Plusieurs questions sont encore non résolues. Quels sont les signaux responsables de la sortie du compartiment médullaire et de l’entrée dans le thymus ? Quels sont les mécanismes qui éliminent les potentialités non T ? Sont-ils tous différents ? Les travaux futurs apporteront certaines réponses qui nous permettront d’avancer dans les connaissances de la lymphopoïèse T.

Conflits d’intérêts

aucun.

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