Les progéniteurs endothéliaux comme produit de thérapie cellulaire des pathologies cardiovasculaires ?

ARTICLE

Auteur(s) : David M Smadja^1,2,3, Ivan Bieche^1,4,5, Martine Aiach^1,2,3, Pascale Gaussem^1,2,3

¹Université Paris-Descartes
²Inserm Unité 765, Laboratoire d'hématologie, Faculté de pharmacie, 4 avenue de l'observatoire, 75006 Paris
³Service d'hématologie biologique, Hôpital européen Georges-Pompidou, Paris
⁴Inserm Unité 745, Laboratoire de génétique, Faculté de pharmacie, 4 avenue de l'observatoire, 75006 Paris
⁵Laboratoire d'oncogénétique, Centre René-Huguenin, Saint-Cloud

Chez l'adulte, l'angiogenèse permet le développement d'un réseau de capillaires par bourgeonnement des vaisseaux préexistants. Depuis 1997, un nouveau concept a émergé, fondé sur la découverte dans le sang périphérique adulte de précurseurs des cellules endothéliales capables de revasculariser un tissu ischémique dans des modèles précliniques [1]. Ces cellules, appelées cellules progénitrices endothéliales (PEC), possèdent une capacité d'expansion qui leur confère une utilité potentielle dans le domaine de la thérapie cellulaire angiogène autologue pour le traitement des pathologies ischémiques [1]. Dans les très nombreux articles publiés depuis la découverte des PEC en 1997, ce que l'on appelle des « progéniteurs endothéliaux » par abus de langage sont en fait des précurseurs engagés dans la lignée endothéliale. Actuellement, ces cellules sont plutôt qualifiées en tant que « cellules formant des colonies », et dérivent d'un progéniteur d'origine probablement médullaire dont la nature est mal définie. La moelle adulte contient les cellules souches multipotentes qui, comme leur nom le suggère, peuvent se différencier dans un grand nombre de types cellulaires, y compris les cellules endothéliales [2]. Un hémangioblaste – le précurseur commun des cellules souches hématopoïétiques et des cellules endothéliales – a toutefois été identifié chez l'adulte alors que l'on croyait qu'il existait seulement au cours du développement embryonnaire [3].

Les PEC diffèrent des cellules endothéliales circulantes, qui proviennent d'une lésion de l'endothélium vasculaire [4], par un potentiel de prolifération supérieur en culture dans un milieu contenant des facteurs de croissance spécifiques. De plus, quand des PEC d'origine humaine sont injectés chez des souris immunodéprimées ayant subi une ischémie des membres inférieurs, ils contribuent à la formation de nouveaux vaisseaux et à la récupération du flux, contrairement aux cellules endothéliales matures qui n'ont aucun effet dans ce modèle.

Cette revue a pour but de rassembler les données actuelles sur la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des PEC et de donner quelques pistes pour conditionner et expandre ces cellules dans le but de développer un produit de thérapie cellulaire.

Isolement des progéniteurs endothéliaux en culture : deux entités cellulaires

Les nombreux travaux consacrés à la biologie des PEC au cours des dernières années font apparaître une hétérogénéité phénotypique avec obtention en culture d'au moins deux types de cellules [1, 5] :

- des cellules adhérentes dites « précoces » (early) qui, après 4 à 7 jours de culture, présentent certaines des caractéristiques phénotypiques des cellules endothéliales. Leur potentiel de prolifération est faible et elles expriment, en outre, les marqueurs leucocytaires CD14 et CD45. Cependant, elles sécrètent de nombreuses cytokines qui participeraient à leurs propriétés angiogènes in vivo. Selon la procédure de culture, ces cellules sont appellées CFU-Hill (Hill étant l'inventeur de la méthode) ou CAC (circulating angiogenic cells) ;

- des cellules « tardives » (late), donnant naissance à des colonies adhérentes apparaissant en 2 à 3 semaines, à fort potentiel de prolifération. Les cellules qui en dérivent après expansion ont un phénotype endothélial. Ces PEC tardifs, encore appelées ECFC (endothelial colonies forming cells), expriment le CD34 et le récepteur du VEGF (VEGFR2 ou KDR). Selon leur origine, le potentiel de prolifération de ces cellules est différent, ce qui a conduit l'équipe d'Ingram à établir une hiérarchie à l'intérieur de ces progéniteurs tardifs, similaire à la classification établie pour les cellules souches hématopoïétiques [6].

La distinction en cellules précoces et tardives évoquée par Hur en 2004 a clarifié la dénomination des PEC. En effet, comme cité plus haut, ces différents types cellulaires étaient tous dénommés progéniteurs endothéliaux.

Les PEC précoces, qui expriment le CD14, sont les cellules identifiées par Asahara en 1997, et au sujet desquelles le plus de travaux ont été publiés. Cependant, leur origine et leur réelle appartenance aux cellules progénitrices d'une part, et à la lignée endothéliale, d'autre part, sont encore discutées.

Plus récemment, l'équipe de Elsheikh [7] a tenté d'isoler la sous-population qui exerçait des propriétés de cellules endothéliales progénitrices au sein des cellules mononucléées du sang circulant. La population CD14+VEGFR2+ semble être la population cellulaire à l'origine de la revascularisation observée avec des cellules CD14+. Une sous-population de cellules CD14+VEGFR2+ étudiée par l'équipe de Romagnani [8] qui présente une expression faible de CD34 (CD34 low) ainsi qu'une expression de marqueurs d'immaturité NANOG et OCT4, suggère qu'il s'agit bien de cellules progénitrices à phénotype endothélial. Enfin, l'équipe de Pampee Young a récemment mis en évidence l'origine myéloïde des PEC précoces obtenues ex vivo dans un modèle d'angiogenèse tumorale [9]. Ces différentes données suggèrent que les PEC sont issus de deux voies distinctes de différenciation, dont une au moins fait intervenir un progéniteur myélomonocytaire. D'ailleurs, cette appartenance à la lignée leucocytaire a été prouvée par la mise en évidence de BCR-ABL dans ces cellules différenciées à partir de cellules mononucléées de patients atteints de leucémie myéloïde chronique [10, 11].

En 2005, l'équipe de David Ingram a isolé au sein d'un endothélium mature une sous-population qui exerçait des propriétés clonogéniques et prolifératives de progéniteurs endothéliaux tardifs, ce qui a soulevé l'hypothèse d'une niche vasculaire dans l'endothélium [12]. Ainsi, le mur vasculaire pourrait être un réservoir de PEC et ainsi une activation de l'endothélium pourrait être une source de PEC, afin de les mobiliser vers la circulation.

Caractérisation phénotypique des PEC

Comme nous l'avons détaillé dans le paragraphe précédent, deux types de cellules au phénotype endothélial sont obtenus en culture : les PEC précoces et tardifs. Un des marqueurs communs aux deux populations de PEC est le récepteur VEGFR2. Toutefois, la caractérisation phénotypique des PEC ne doit pas être réalisée de manière isolée, mais accompagnée de tests fonctionnels permettant d'affirmer leurs caractéristiques fonctionnelles en termes notamment de capacité de prolifération.

Étant donné l'utilité potentielle des PEC comme marqueur cellulaire de cancer ou de pathologie cardiovasculaire, mais également comme produit de thérapie cellulaire, une meilleure caractérisation des PEC est nécessaire. Dans ce contexte, notre équipe a recherché l'expression différentielle de gènes de cellules souches dans chacun de ces types cellulaires. Ainsi, nous avons montré une expression sélective des « Bone morphogenetic proteins » 2 et 4 (BMP2/4) dans les PEC tardifs par comparaison aux PEC précoces [15]. Les BMP appartiennent à la famille du TGF-β. Ce sont des cytokines impliquées dans la croissance des os et du cartilage et dont le rôle est connu dans l'embryogénèse et la formation précoce du squelette. Plus récemment, la voie des BMP a été impliquée dans l'engagement de la cellule souche embryonnaire vers l'hémangioblaste [16]. Dans ce travail, nous montrons en outre un rôle angiogène des BMP. En effet, BMP2 et 4 induisent in vitro (figure 1) :

• – l'engagement des cellules CD34+ vers la lignée endothéliale ;
• – et une augmentation du potentiel proangiogène des PEC tardifs, notamment en activant les propriétés de prolifération, de migration et de formation de pseudo-tubes de ces cellules.

Enfin, l'ajout de l'inhibiteur spécifique des BMP, Noggin, au fibrobast growth factor dans un modèle de matrigel sous cutané chez la souris C57/Bl6, induit une inhibition importante de la vascularisation des implants. Dans le modèle d'ischémie de la patte postérieure de la souris nude, l'activation des PEC par les BMP augmente leur potentiel proangiogène [15]. Enfin, nous avons caractérisé le phénotype des cellules responsables de la néovascularisation observée dans des spécimens d'amputation de patients présentant une ischémie critique de jambe et ayant reçu une injection locale de cellules mononucléées de moelle osseuse en autologue [17]. Les cellules endothéliales constituant les néovaisseaux sont fortement positives pour BMP2/4, suggérant que les cellules impliquées dans la néovascularisation ont un phénotype de PEC tardifs et permettant d'exclure l'hypothèse de l'incorporation de PEC précoces au néovaisseau.

Exploration fonctionnelle des PEC in vivo

À l'issue de l'observation des effets bénéfiques retrouvés dansces essais précliniques et cliniques, une abondante littérature est parue au cours de ces dernières années afin de tenter d'expliquer les rôles respectifs des PEC précoces et tardifs et de mieux connaître leurs propriétés fonctionnelles respectives.

Caractérisation fonctionnelle des PEC in vitro

Une des propriétés fonctionnelles qui permet de différencier les PEC précoces et tardifs est leur aptitude à proliférer et s'expandre in vitro. Ainsi, les PEC précoces sont dépourvus de capacité de prolifération tandis que les PEC tardifs peuvent se multiplier dans un milieu adéquat pendant plus de 5 semaines, ce qui en fait une population intéressante dans le cadre de la mise au point d'un produit de thérapie cellulaire [5]. De plus, les PEC tardifs ont des propriétés de prolifération et d'expansion différentes selon les sources à partir desquelles ils sont isolés. Ainsi, l'équipe de Ingram a suggéré l'existence d'une hiérarchie dans les PEC selon si les colonies proviennent de sang adulte ou de sang de cordon [6]. Les PEC tardifs ont également montré une capacité plus importante que les cellules endothéliales matures à proliférer in vitro [5], ainsi qu'une meilleure réactivité aux facteurs de croissance [23]. Enfin, les PEC, qu'ils soient précoces ou tardifs, montrent une résistance à l'apoptose et au stress oxydatif plusimportante que les cellules endothéliales matures [24,25]. En effet, les PEC sont capables de résister à d'importantes concentrations d'espèces réactives de l'oxygène sans entrer en apoptose grâce notamment à un équipement enzymatique (manganèse super-oxyde dismutase et glutathione peroxydase-1) permettant un gain de survie [25, 26].

Les propriétés invasives des PEC sont également importantes, expliquant que celles-ci soient capables d'atteindre leur cible ischémique. Ainsi, l'équipe de Stefanie Dimmeler a montré en 2005 que les PEC précoces exprimaient des taux importants de cathepsine L, protéase essentielle à l'invasion des tissus ischémiques par les PEC [27]. De plus, l'équipe de Françoise Dignat-George a caractérisé le potentiel protéolytique de progéniteurs tardifs isolés à partir de sang de cordon. Ces PEC ont un potentiel protéolytique supérieur à celui de cellules endothéliales matures. Ce potentiel repose sur une activité u-PA cellulaire et sécrétée importante, ainsi que sur la surexpression membranaire de son récepteur u-PAR par les PEC, contribuant à leurs capacités de prolifération, de migration et d'organisation en réseau tubulaire in vitro. De plus, l'expression du système u-PA/u-PAR est encore accrue sous l'effet de facteurs de croissance angiogènes. Ces données suggèrent qu'un potentiel protéolytique élevé dépendant du système de l'urokinase contribue aux capacités angiogènes spécifiques des PEC.

Les intégrines, composées d'une sous-unité α et β, jouent un rôle important dans le « homing » et la migration des leucocytes, mais également des PEC. En effet, plusieurs études ont mis en évidence un rôle de la sous-unité β2 [28, 29]. Des études in vitro d'adhérence ont indiqué que β2 interviendrait dans l'adhérence des progéniteurs endothéliaux et myéloïdes à l'endothélium mature, contrairement aux sous-unités β1 qui ne seraient pas impliquées dans ce processus [28]. La contribution des intégrines β1 est plus complexe. En effet, α4β1 permettrait d'augmenter l'adhésion des PEC grâce à son ligand VCAM-1 [30]. De plus, dans un modèle de tumeur, l'inhibition de α4β1 permettrait de bloquer de manière significative l'adhérence et le homing des PEC dans des sites d'angiogenèse actifs, évalués par microscopie intravitale [31]. L'intégrine α6 pourrait également être impliquée dans les processus de différenciation des PEC [32, 33].

Préconditionnement des PEC

Ainsi, le traitement des PEC par le VEGF [32] mais également par les fucoïdanes [33] induit une augmentation de synthèse d’α6. Le prétraitement des PEC avec du SDF-1 permettrait la surexpression des sous unités α4 et αM impliquées dans le homing des cellules immatures vers le site d'ischémie et renforce l'adhérence des PEC à l'endothélium mature [34]. Bien évidemment, ces procédés, s'ils devaient être utilisés en thérapie cellulaire, devront être développés dans des conditions de grade clinique.

L'extrapolation de données précliniques chez la souris avait permis d'estimer la quantité de sang nécessaire à prélever chez l'homme pour obtenir un produit de thérapie cellulaire endothélial à environ 19 litres. Il faut donc forcément trouver un moyen d'augmenter le nombre de PEC par une mobilisation in vivo ou une méthode d'expansion in vitro adéquate. Les inhibiteurs de réductase de HMG-CoA, les statines, ont été les premières molécules publiées ayant la capacité de mobiliser les PEC chez des patients coronariens ainsi que dans des modèles expérimentaux [35, 36]. Ceci s'accompagne d'une augmentation des capacités migratrices des PEC in vitro et in vivo. Les mécanismes par lesquels les statines agissent sur les PEC ne sont pas clairs mais pourraient impliquer l'activation de la PI3-kinase, d'Akt et l'activation de laNO synthase endothéliale (eNOS) [36, 37]. Le NO joue un rôle crucial dans les PEC et son expression est indispensable pour la mobilisation des cellules médullaires et desPEC[38-40]. De plus, des composés activateurs du NO induisent la différenciation de cellules souches en cellules hématopoïétiques et endothéliales et pourraient être utilisés dans le prétraitement des cellules des patients présentant un infarctus du myocarde [41].

D'autres stratégies proposent l'utilisation de la E-selectine soluble [42], l'activation de l'EphrineB4 par le Fc-ephrine B2 [43], ou l'activation de la β2 intégrine [28] par des anticorps, et enfin l'HMGB1 [44], afin d'augmenter les propriétés angiogènes des PEC. Une des pistes développées par notre groupe est l'activation du récepteur à la thrombine PAR-1 par le peptide SFLLRN.

Rôle de l'activation du PAR-1, principal récepteur de la thrombine, sur les PEC

La prolifération des PEC, induite de façon dose-dépendante par le SFLLRN, est observée uniquement au cours des 40 premiers jours de culture. Cette observation confirme des travaux déjà décrits et notamment ceux de Murasawa et al. [46] qui montrent qu'après 21 jours de culture, la longueur des télomères est significativement diminuée, et donc que les cellules perdent progressivement leur potentiel prolifératif, se rapprochant ainsi des propriétés des cellules endothéliales matures. D'ailleurs, nous avons étudié le rôle de PAR-1 sur des PEC issus de sang adulte et l'activation du PAR-1 n'induit pas d'effet prolifératif sur ces cellules. Nos résultats confirment l'hypothèse d'une hiérarchie entre les différents PEC d'origine fœtale ou adulte et suggèrent que l'effet proangiogène directdu PAR-1 ne s'exprimerait que chez les cellules les plus immatures [47].

Nous avons recherché les possibles interactions du PAR-1 avec l'angiopoïétine 2. En effet, en plus de ses rôles déjà connus dans la formation de l'arbre vasculaire, Hildbrand et al. [48] ont montré que l'angiopoïétine 2 avait un rôle dans l'expansion des PEC ex vivo. De plus, il a été décrit que la thrombine induisait la synthèse d'angiopoïétine 2 in vitro [49], mais également in vivo [50, 51]. Ainsi, nous avons pu attribuer l'effet prolifératif de l'activation du PAR-1 sur les PEC à l'induction de l'expression du gène de l'angiopoïétine 2 et de la synthèse de la protéine [52].

Pour expliquer les effets de l'activation du PAR-1 sur la migration et la différenciation cellulaire, nous avons étudié la modulation de l'expression d'une soixantaine de gènes impliqués dans l'angiogenèse et avons mis en évidence un rôle du système autocrine SDF-1 et de son récepteur CXCR4. La migration est essentielle pour le « homing » des PEC vers les tissus ischémiques. Les deux principaux facteurs de croissance libérés lors de l'hypoxie d'un tissu induite par une ischémie expérimentale ou clinique sont le VEGF et le SDF-1 [53-55]. Les cellules activées par le SFLLRN migrent en chambre de Boyden vers le VEGF et le SDF-1 mais, toutefois, de manière significativement plus importante vers le SDF-1. Un des mécanismes candidats pour expliquer cette réponse vis-à-vis du SDF-1 est l'augmentation d'expression de CXCR-4 observée à la surface des cellules.

Après un conditionnement des PEC avec le SFLLRN, une augmentation de formation de structures tubulaires en Matrigel est observée, bloquée en présence d'anticorps anti-CXCR-4 et anti-SDF-1. Ici encore, comme pour la migration, et de façon indépendante d'une induction de la prolifération, nous avons montré le rôle de la surexpression de SDF-1 et de CXCR-4 suite à l'activation de PAR-1. Ces effets sur la différenciation cellulaire, sont indépendants de la voie VEGF/VEGFR2, contrairement à ce qui est observé avec les HUVEC [56] [57]. Ainsi, l'effet proangiogène du PAR-1 induit par SDF-1/CXCR-4, indépendamment du VEGF, pourrait être une spécificité des PEC par rapport aux cellules endothéliales matures.

Enfin, la thrombine est également un facteur pro inflammatoire, tout comme l'interleukine 8 (IL-8), chémokine pro-inflammatoire, qui possède des propriétés angiogènes par interaction avec ses récepteurs CXCR1 et CXCR2. Ainsi, nous nous sommes intéressés aux potentielles interactions PAR-1/IL-8 sur les PEC précoces et tardifs. L'IL-8 est fortement exprimée dans les PEC précoces, et son taux dans le milieu conditionné est inchangé après activation du PAR-1. En revanche, la sécrétion d'IL-8 par les PEC tardifs, très faible en conditions basales, est fortement augmentée après activation du PAR-1. L'expression des gènes des récepteurs de l'IL-8, CXCR1 et CXCR2, a été observée uniquement chez les PEC précoces et l'IL-8 des milieux conditionnés de PEC tardifs activés par le peptide activateur de PAR-1 induit la migration en chambre de Boyden des PEC précoces. L'inhibition du PAR-1 par ARN interférence inhibe la voie AP-1 et NF-kB et abolit la synthèse d'IL-8 autant au niveau basal qu'après stimulation du PAR-1. Ces résultats suggèrent que ce processus pourrait participer à la coopération entre les deux types de progéniteurs pendant la néovascularisation, médiée par un effet paracrine [58].

Le rôle de la thrombine est essentiel dans les processus d'athérothrombose. Une fraction active de la thrombine étant liée au caillot de fibrine, nous avons également examiné l'impact d'un réseau de fibrine sur les propriétés des PEC. Nous avons montré que le réseau de fibrine autologue constitue une matrice permettant aux PEC d'acquérir des propriétés anticoagulantes et antifibrinolytiques en plus de leurs propriétés angiogènes [59]. Cela pourrait représenter une piste intéressante comme biomatrice pour l'expansion des PEC, d'autant que ce procédé existe déjà en conditions de grade clinique [60].

Les cellules endothéliales dérivées de cellules souches embryonnaires (CSE) ou d'iPS humaines : rêve ou réalité ?

Les CSE sont caractérisées in vitro et in vivo par leur potentiel à donner naissance aux trois feuillets primordiaux embryonnaires : endoderme, ectoderme, mésoderme, puis à tous les tissus adultes. Cultivées en l'absence des facteurs nécessaires au maintien de leur état indifférencié, en conditions non adhérentes, les cellules vont former des agrégats qui se différencient spontanément de manière non organisée en structures vésiculaires appelées « corps embryoïdes ». Au sein de ces corps embryoïdes sont détectés des marqueurs de l'ectoderme (tissu neurologique), du mésoderme (tissu cardiaque, cellules endothéliales VEGFR2 positives), et de l'endoderme (tissu digestif, respiratoire) [63, 64]. Le caractère prolifératif et la propriété de pluripotence de ces cellules sont démontrés également in vivo après injection des CSE chez la souris immunodéficiente. Les CSE injectées génèrent des tératomes solides comportant des cellules des trois couches primaires et des cellules indifférenciées [61]. Les CSE représentent une source abondante et renouvelable à l'infini de cellules fonctionnelles pour de nombreuses applications en recherche fondamentale et en thérapeutique. In vitro, il a été montré que des CSE pouvaient se différencier en cellules fonctionnelles de nombreux tissus et notamment en cellules du système cardiovasculaire comme les cardiomyocytes ou les cellules endothéliales. Ainsi, l'équipe du Pr. Menasché a obtenu des cardiomyocytes à partir de CSE et observé une amélioration clinique par différenciation de CSE murines in situ dans le cœur de mouton après infarctus [65]. Divers travaux ont également permis d'obtenir des cellules endothéliales à partir de CSE à des stades différents de culture et de maturation (pour revue [66]), efficaces dans des modèles précliniques, seules ou coadministrées avec des cellules musculaires lisses [67-73]. Ces premières publications sont encourageantes pour de futurs essais de thérapie cellulaire, cependant des problèmes restent à résoudre comme la contamination de ces cellules par des protéines animales (sérum de veau, cellules de soutien…) et le risque de formation de tératomes.

La fin de l'année 2007 aura été marquée par une avancée scientifique pleine de promesses au niveau de la médecine régénératrice avec la découverte des iPS (induced pluripotent stem cells). Il s'agit de cellules somatiques humaines adultes reprogrammées en cellules pluripotentes par la transfection de gènes codant 4 protéines responsables du maintien de l'état pluripotent (oct3/4, sox2, associés tantôt à klf4 et c-myc tantôt à nanog et lin28) [74-76]. Ces cellules ont rapidement montré leur efficacité dans le cadre d'une utilisation thérapeutique chez la souris dans le traitement de l'hémophilie [77] ou de la drépanocytose [78]. Plusieurs équipes ont récemment pu dériver des cardiomyocytes et/ou des cellules endothéliales à partir des iPS [79-83], et les premières études fonctionnelles tendent à montrer que ces cellules sont efficaces dans les modèles précliniques. Cependant, les problèmes posés par l'utilisation des cellules iPS restent les mêmes que celles des CSE (contamination par des protéines animales et formation de tératomes) et de futures études sont nécessaires afin de pouvoir établir leur innocuité dans le cadre d'essais de thérapie cellulaire dans les pathologies ischémiques.

Conclusion

Conflit d’intérêts

Références

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