ARTICLE
Auteur(s) : Luc
Douay1,2,3, Ali G Turhan4, Hélène
Lapillonne1,2,3
1Inserm, UMR_S 893, Prolifération
et différenciation des cellules souches, Paris
2UPMC Univ. Paris 06, UMR_S 893, Paris
3Service d’hématologie biologique, Hôpital
Armand-Trousseau, Paris
4UPRES EA 3805, Laboratoire d’hématologie
et oncologie, Université de Poitiers
On caresse l’idée d’un « sang artificiel » universel et sûr
depuis plus de cinquante ans. Notre rêve d’un sang artificiel doit
se limiter aux globules rouges, cellules primordiales à la fonction
essentielle, transporter l’oxygène pour le délivrer à tous les
tissus de l’organisme. Cette fonction vitale est assurée par un
pigment particulier, l’hémoglobine. Ainsi, quand on parle de « sang
artificiel », on évoque simplement le remplacement de cette
hémoglobine.
À première vue, le globule rouge (GR) peut paraître extrêmement
frustre : un simple sac qui a perdu les éléments vitaux, noyau et
mitochondries. C’est en réalité une cellule qui a poussé sa
spécialisation, transporter l’oxygène, jusqu’à éliminer tout ce qui
est inutile. Mais cette cellule sait être unique. Il existe,
en effet, à sa surface plus d’une trentaine de familles de groupes
sanguins, qui imposent les règles de compatibilité
transfusionnelle.
En libérant l’hémoglobine de ce sac ou en la remplaçant par une
molécule totalement synthétique, tout en conservant la capacité de
transport d’oxygène, on toucherait au but du « GR artificiel
». Toutes les tentatives de conception de substituts sanguins,
depuis cinquante ans, se sont révélées décevantes [1, 2], voire
dangereuses. On ne remplace pas aussi facilement la nature.
L’hématopoïèse contrôlée in vitro
Si l’on ne peut remplacer la nature, pourquoi ne pas « simplement »
la copier ? Nous maîtrisons suffisamment la biologie des cellules
souches hématopoïétiques (CSH) [3] pour espérer fabriquer en
laboratoire des hématies humaines. On peut raisonnablement avancer
qu’il sera bientôt possible d’en produire suffisamment pour en
transfuser [4].
Si l’on se donne comme objectif de produire des GR humains à
partir de CSH dans un but transfusionnel, on s’impose d’emblée deux
défis. Le premier est qualitatif. De façon paradoxale, si
cette cellule est aussi simple, c’est qu’elle a suivi un long
parcours, qui l’a amenée à expulser son noyau. Il faudra donc
reproduire en laboratoire ce cheminement naturel. Le second
est quantitatif. Un concentré de GR transfusé à un patient contient
2 000 milliards de GR. Il ne s’agit donc pas de se
limiter à une prouesse de laboratoire mais bien d’être capable de
répondre à ces exigences.
Les CSH représentent 1 cellule sur 10 000 dans la
moelle osseuse. En contact étroit avec le micro-environnement
médullaire, elles prolifèrent et se différencient selon une
hiérarchie bien définie [5]. On sait, depuis les années 1980, que
les CSH sont très nombreuses dans le sang du cordon ombilical [6].
On sait aussi les mobiliser de la moelle vers le sang par
l’injection de facteurs de croissance spécifiques, ce qui facilite
leur recueil [7].
Le micro-environnement médullaire est constitué de cellules
différentes, regroupées sous le terme générique de cellules
stromales. Elles sécrètent des facteurs solubles, activateurs ou
inhibiteurs, qui régulent la production des CSH et facilitent leurs
interactions [8-11].
Ces connaissances fondamentales sur l’hématopoïèse ont amélioré
la pratique des greffes de moelle osseuse et permis d’élargir le
concept à celui de greffe de CSH de sang périphérique ou de sang de
cordon. On cherche depuis une dizaine d’années à améliorer les
greffes de CSH en augmentant leur nombre dans les greffons. On
parle d’expansion ex vivo [4]. En travaillant sur ce thème, la
tentation est venue de les contraindre à se différencier
spécifiquement vers la lignée des GR, appelée lignée érythroïde.
Cette lignée a toutefois une particularité essentielle : à la fin
de sa maturation dans la moelle osseuse, la cellule érythroïde
expulse son noyau avant de passer dans le sang. Ainsi naît le GR,
la seule cellule de l’organisme à durée de vie longue
(120 jours), malgré l’absence de noyau.
Le cahier des charges idéal
Si on laissait courir notre imagination pour rêver la transfusion
idéale de demain, on pourrait aboutir au concept suivant : produire
de façon automatisée des culots de GR universels à partir d’une
source infinie de cellules souches. Un tel programme nécessite le
développement de nouvelles technologies pour produire in vitro des
populations pures de GR, immédiatement disponibles, dénuées de
toutes lésions de stockage. L’aboutissement serait un automate de
culture capable de fabriquer et de conditionner des quantités
importantes de GR universels (O rhésus négatifs), générés à partir
de cellules souches humaines. Ces GR de culture (GRc) devront
évidemment avoir les mêmes qualités fonctionnelles et les mêmes
caractéristiques immunologiques que des GR issus de donneurs. En
d’autres termes, leur capacité transfusionnelle devra être au moins
équivalente à celle des GR normaux.
Le concept final serait donc celui d’un automate de culture qui
conserverait l’autorenouvellement des CSH et permettrait la
différenciation, la séparation et le conditionnement de culots
globulaires immédiatement transfusables, lesquels répondraient aux
exigences des agences de régulation européennes et américaines.
Pour atteindre ces buts, des avancées importantes, quasi
révolutionnaires, devraient être réalisées dans plusieurs domaines
de la recherche comme celui du contrôle de
l’expansion/différenciation des CSH/progéniteurs ou celui de la
bio-ingénierie. Un rêve impossible ? Analysons ici les obstacles à
franchir.
Les jalons biologiques à franchir
Un globule rouge mature
Surmonter cet obstacle implique de créer in vitro les conditions
expérimentales répondant à trois impératifs : stimuler la
prolifération des CSH primitives, induire leur engagement exclusif
vers la lignée érythroïde et aboutir au stade ultime de maturation,
le GR énucléé.
Nous avons initialement proposé [12] un protocole d’expansion de
CSH issues de sang de cordon (SC) dans un milieu défini et sans
stroma, reposant sur une l’addition séquentielle de facteurs de
croissance. Partant d’une population enrichie en cellules souches
et progéniteurs hématopoïétiques, le protocole permettait une
production cellulaire importante (jusqu’à 200 000 fois
d’amplification) et pure de précurseurs érythroïdes (95 à 99
%), contenant de l’hémoglobine fœtale (HbF). Contrairement à nos
observations ex vivo, ces progéniteurs/précurseurs injectés à la
souris NOD-SCID étaient capables de continuer à proliférer in vivo
et de se différencier en quatre jours jusqu’au stade terminal de
cellules énucléées, confirmant le rôle majeur du
micro-environnement dans la différenciation terminale
érythroïde.
Sur la base de ces données, nous avons conçu un second protocole
d’expansion et de différenciation des cellules CD34+ d’origine
sanguine, médullaire et de sang placentaire en trois étapes [13] :
une première en milieu liquide, de prolifération cellulaire et
d’induction de différenciation érythroïde en présence de stem cell
factor (SCF), d’interleukine 3 (IL3) et d’érythropoïétine
(Epo) ; une seconde sur un modèle de reconstitution de
micro-environnement [14] (lignée stromale murine MS5 ou
cellules dérivées des cellules souches humaines mésenchymateuses),
en présence d’Epo seule; une troisième en présence des seules
cellules stromales, sans aucun facteur de croissance. Nous montrons
que ce protocole, en milieu défini sans sérum, autorise à la fois
l’expansion massive de CS/progéniteurs CD34+ et la différenciation
complète jusqu’au stade de GR matures parfaitement
fonctionnels.
Ces conditions permettent d’obtenir, au quinzième jour, un
plateau d’amplification cellulaire moyenne de 20 000 fois
pour des cellules CD34+ issues de la moelle osseuse ou du sang
périphérique, de 30 000 fois pour celles issues de
cytaphérèses mobilisées par G-CSF et 200 000 fois pour
celles provenant de sang de cordon. L’engagement vers la lignée
érythroïde est morphologiquement évident dès le huitième jour.
La différenciation terminale est ensuite rapide.
La maturation en GR adultes se poursuit du 15e au
18e jour, comme en témoigne la négativation progressive
du CD71, récepteur de la transferrine, et du laser dye styryl (LDS,
marqueur des acides nucléiques). À ce stade, 90 à 100 % des
cellules sont énucléées.
Un globule rouge fonctionnel
Ces réticulocytes et GR générés in vitro se révèlent
fonctionnellement identiques aux GR natifs. Ils ont un contenu
en glucose-6-phosphate-déhydrogenase et en pyruvate-kinase qui
correspond au caractère homogène et jeune des populations
cellulaires produites. Ceci témoigne de leur capacité à réduire le
glutathion et à maintenir le taux d’ATP pour éviter l’accumulation
de 2-3 diphosphoglycérate (2-3 DPG) qui produirait une
baisse d’affinité de l’hémoglobine pour son ligand.
Leur déformabilité, évaluée par ektacytométrie, est comparable à
celle des GR natifs [15].
L’hémoglobine contenue dans ces GR est fonctionnelle. Elle se
comporte comme une hémoglobine tétramérique, comme en témoigne la
coopération entre les différentes sous-unités validant son
comportement allostérique (étude par flashphotolyse). Elle est
capable de fixer et de relarguer l’oxygène avec une valeur log(P50)
de 1,2 et un coefficient de Hill (N50) de 2,28,
comme attendu d’une hémoglobine native dont les valeurs normales
sont respectivement de 1,3 et 2,29 (courbes à l’équilibre
à 37 °C par Hémox analyzer). Ces données sont confirmées
par tonométrie réalisée à 25 °C.
Injectés à la souris NOD/SCID, ces réticulocytes humains
produits ex vivo mûrissent normalement en GR et sont détectés aussi
longtemps que peuvent l’être des GR témoins (trois jours).
Les jalons technologiques à franchir
Produire des quantités en rapport
avec les besoins transfusionnels
L’objectif à atteindre est la production de culots globulaires
contenant 2 000 milliards de GR. De façon
intéressante, l’expansion cellulaire atteinte au cours de la
première étape de culture est directement corrélée à sa durée.
Ainsi, en la prolongeant de quelques jours, les niveaux
d’amplification cellulaire peuvent atteindre 1 x
107, 2 x 105 fois respectivement pour
les cellules provenant du sang placentaire, de cytaphérèse et/ou de
moelle osseuse, tout en préservant le niveau d’énucléation durant
les phases suivantes (70-90 %).
Si l’on considère d’une part qu’un SC contient de 2 à
5 x 106 CD34+ ou qu’une cytaphérèse mobilisée par
un facteur de croissance comme le granulocyte-colony stimulating
factor (G-CSF) permet de recueillir habituellement 4-8 x
106 CD34+ par Kg de poids, et que d’autre
part les niveaux d’amplification sont respectivement de l’ordre
2 x 105 et 107 fois, c’est bien
l’équivalent de 10 à 20 concentrés de GR qui peuvent être
ainsi produits à partir d’un seul prélèvement.
Pour prétendre à une application clinique, il nous faut créer
les outils qui permettront une production automatisée de culots
globulaires. En effet, si la génération de GR à partir de sang
périphérique ou de sang placentaire est maintenant facile à
l’échelon de la paillasse, personne n’a, à ce jour, été capable
d’en produire des quantités suffisantes. Il est évidemment
impératif que les GR générés aient la même fonctionnalité que les
GR natifs, en terme notamment de capacité de transport et de
relargage de l’oxygène. Ceci requiert des progrès importants en
matière de biologie cellulaire. Pour atteindre ces prérequis, des
avancées considérables doivent être faites dans le contrôle de
l’expansion, de l’autorenouvellement et la différenciation des
progéniteurs hématopoïétiques. Un tel système doit être le plus
automatisé possible pour assurer une reproductibilité et une
standardisation en limitant les interventions humaines. D’autres
avancées majeures sont requises en matière d’automatisation de la
sélection cellulaire, de la culture et du packaging. Un véritable
défi, qui n’est pas impossible à relever.
Rêver de globules rouges universels
Ce système de culture permettra probablement une approche nouvelle
dans la recherche du GR « universel » dépourvu des principaux
systèmes de groupe sanguin ABO/Rh. Il ne s’agit plus ici de
tenter d’éliminer un antigène déjà formé, mais d’empêcher leur
synthèse avant que le globule n’atteigne sa maturité.
Les systèmes ABO ou Rh, non exprimés sur les cellules souches,
sont présents dès le stade d’érythroblaste. Deux possibilités sont
envisageables. La première est l’inhibition de l’expression
des gènes dans les cellules CD34+. La seconde est l’inhibition
intracellulaire biochimique des glycosyltransférases spécifiques
des antigènes A et B. Quel que soit le mécanisme, cette
inhibition doit être mise en route dès le stade de la CSH CD34+ et
poursuivie jusqu’à celui du GR. Ces méthodes peuvent éviter
les effets secondaires inhérents aux procédures d’élimination [16]
ou de masquage d’antigènes [17], actuellement en cours
d’évaluation.
Demain, de nouvelles sources de cellules souches
hématopoïétiques
L’utilisation thérapeutique de CSH implique qu’elles puissent se
différencier in vitro comme le font in vivo les cellules natives.
Les cellules souches embryonnaires humaines (hES) et plus
récemment décrites, les cellules souches pluripoptentes induites
(iPS) sont un formidable espoir de sources illimitées de cellules
souches pour tous les types de tissus.
Les cellules souches embryonnaires humaines (hES)
Le développement de lignées de hES, en 1998, par le groupe de J.A.
Thomson, a fait naître de nouveaux espoirs en terme de thérapie
cellulaire et offre un modèle d’études unique à la compréhension
des premières étapes du développement [18]. De par le monde,
plus de 400 lignées cellulaires de hES sont ainsi répertoriées
et viennent illustrer l’espoir placé dans ce modèle cellulaire.
Les lignées de hES sont établies à partir des cellules de la
masse cellulaire interne de l’embryon humain au stade de
blastocyste, au cinquième jour après la fécondation. Les hES
sont des cellules indifférenciées, pluripotentes, qui possèdent des
propriétés remarquables :
- – elles sont capables de se renouveler indéfiniment in
vitro en présence de basic fibroblast growth factor (b-FGF) en
coculture sur des fibroblastes primaires de souris (MEF) ;
- – elles se caractérisent par l’expression spécifique
d’antigènes de surface SSEA-3, SSEA-4, TRA1-60, TRA1-81, et de
gènes tels que Nanog, Oct4, Rex1, Sox2, témoins de leur caractère
indifférencié ;
- – elles maintiennent un caryotype normal 46,XX ou 46,XY,
et une activité télomérase élevée ;
- – elles présentent un cycle cellulaire tout à fait
particulier avec une phase G1 quasi inexistante, une phase S
prépondérante, circonstances favorables à la prolifération
cellulaire ;
- – elles se distinguent par leur capacité in vitro et in
vivo à donner naissance à tous les types cellulaires issus des
trois feuillets embryonnaires (ectoderme, endoderme et mésoderme)
et induisent des tératomes lorsqu’elles sont injectées sous forme
indifférenciée à la souris NOD/SCID.
Ainsi, les hES représentent une source potentiellement illimitée
de cellules capables de générer des cellules hématopoïétiques et
plus spécifiquement des GR à des fins thérapeutiques, greffe ou
transfusion [19, 20].
Hématopoïèse et développement
Lors du développement, l’hématopoïèse procède à partir du mésoderme
et s’installe en deux phases successives : l’hématopoïèse primitive
et l’hématopoïèse définitive [21]. L’hématopoïèse primitive est
transitoire, se développe entre la 3e et la
9e semaine de gestation, et apparaît au niveau des îlots
sanguins du sac vitellin (mésoderme extra-embryonnaire). Elle donne
naissance à des érythroblastes primitifs, des macrophages, des
mastocytes et des hémangioblastes (précurseur commun à potentiel
mixte hématopoïétique et angioblastique), mais pas aux lymphocytes,
ni aux CSH. Parallèlement, l’hématopoïèse définitive débute dans la
région aorto-gonado-mésonéphros (AGM) (mésoderme
intra-embryonnaire) dès la cinquième semaine de gestation, avec
production d’hémangioblastes, des premières CSH définitives et de
toutes les lignées hématopoïétiques, avant de migrer dans le foie
fœtal à partir de la 7e semaine, puis la moelle osseuse
à partir du quatrième mois de gestation. Seules les CSH définitives
sont capables de reconstituer l’hématopoïèse chez des souris
irradiées. Alors que l’érythropoïèse primitive génère des
érythroblastes nucléés, mégaloblastiques avec production
d’hémoglobine embryonnaire, l’érythropoïèse définitive permet la
production d’érythrocytes énucléés, normocytaires, qui synthétisent
progressivement de l’hémoglobine fœtale, puis adulte.
Pour la première fois, les hES offrent cette possibilité
d’étudier in vitro toutes les étapes du développement physiologique
de l’hématopoïèse et de comprendre les mécanismes pathogéniques
dans un contexte pathologique.
hES et différenciation hématopoïétique
Avant toute différenciation cellulaire, les hES expriment déjà des
antigènes et des gènes que l’on retrouve classiquement au sein de
la population de CSH :
- – CD117 (c-kit), CD133 (AC133) et CD90 (thy-1) ;
- – les gènes LMO2, AML1 et c-MYB.
Ces cellules expriment également les gènes KDR/flk1 et
FLT-1, gènes impliqués dans la différenciation endothéliale.
Après suppression des conditions de culture favorables au
maintien des hES indifférenciées (b-FGF et MEF), la différenciation
in vitro des hES peut être obtenue par deux voies différentes : la
formation de corps embryoïdes qui miment la différenciation vers
les trois feuillets embryonnaires sous formes d’agrégats
cellulaires compacts non adhérents, et la coculture sur un stroma
cellulaire adapté pour favoriser la différenciation vers le lignage
d’intérêt.
Différenciation hématopoïétique par formation
de corps embryoïdes
La différenciation hématopoïétique par formation de corps
embryoïdes (CE) est optimisée par l’ajout de cinq cytokines (SCF,
FLT3-L, IL3, IL6 et G-CSF), et de BMP-4, facteur induisant la
différenciation mésodermique [22-24], alors que le
VEGF-A165 favorise la différenciation érythropoïétique
[25]. L’appréciation de la différenciation hématopoïétique se fonde
sur :
- – l’expression d’antigènes de surface en cytométrie en
flux (CD34, CD38, CD45, CD31, CD41a et CD235a) ;
- – l’expression de gènes par PCR quantitative (GATA-1,
GATA-2, SCL/TAL1, EKLF, PU-1 et les globines) ;
- – enfin, la formation de colonies clono-spécifiques
(CFU).
Au bout de 72 à 96 heures, les CE peuvent donner
naissance à des colonies « blastiques » à double potentiel
hématopoïétique et endothélial. D’une part, les cellules adhérentes
donnent naissance à des colonies de type vasculaire avec expression
de gènes tels que KDR et CD31. D’autre part, la population
cellulaire non adhérente, en suspension, exprime des gènes comme
GATA-1 et les chaînes de globine embryonnaire, témoignant de
leur engagement hématopoïétique [22, 25-27].
À partir du cinquième jour, les premières CSH
CD34 apparaissent, pour atteindre 10 % de la population
cellulaire totale aux 12e et 15e jours.
La différenciation hématopoïétique des hES permet ainsi
d’obtenir tous types de colonies (CFU-E, CFU-GM, CFU-GEMM, BFU-E et
CFU-MK) et tous types cellulaires, y compris les cellules
lymphoïdes. Il est intéressant de préciser que les CE de
J7/J12 donnent préférentiellement naissance à une hématopoïèse
primitive qui coïncide avec l’expression des gènes SCL/TAL-1,
GATA-1, GATA-2, EKLF, C-MYB, PU-1 et des chaînes de globine
embryonnaire et fœtale, alors que les CE de J12/J20 permettent
l’émergence d’une hématopoïèse plus définitive, avec apparition
modérée de l’expression des chaînes de globine adulte [22,
25-27].
L’avantage certain de la différenciation par la formation de CE
réside dans la reconstitution in vitro du modèle in vivo selon
l’installation en deux phases successives primitive et définitive
de l’hématopoïèse [28].
Différenciation hématopoïétique par coculture
Les stromas cellulaires adaptés et testés pour leur capacité à
induire les hES vers l’hématopoïèse sont principalement les lignées
cellulaires : S17 (stroma médullaire murin), C116 (sac
vitellin murin), MS5 (stroma murin médullaire),
OP9 (stroma médullaire murin déficient en M-CSF), FH-B-hTERT
(stroma de foie fœtal murin avec expression constitutive de hTERT),
AM20.1B4 et UG26.1B6 (stroma d’AGM murin), EL08.1D2
(stroma de foie fœtal murin) et les cellules primaires de foie
fœtal et de la région AGM d’origine murine [29-33]. Le stroma
murin OP9 apparaît comme le plus efficace, avec une production
de cinq à dix fois supérieure en CSH et progéniteurs par rapport
aux autres stromas MS5, S17 et C117 [30]. Les lignées
cellulaires de la niche hématopoïétique (AGM et foie fœtal)
favorisent nettement la formation de colonies [33]. Au cours de la
différenciation cellulaire des hES, la séquence d’apparition de
l’expression des gènes et des antigènes de surface est la suivante
: CD34, GATA-1 et GATA-2 à J3, CD31 et
SCL/TAL-1 à J4, CD41a et CD43 à J5 et CD45 à
J8. En parallèle, les premières colonies à se former sont les
CFU-E, suivies par les CFU-GEMM, les CFU-GM et les CFU-G. Avec ce
système, le pourcentage de CSH CD34+ peut atteindre 20 % de la
population totale. Le CD43 (leukosialin) émerge comme un
marqueur intéressant de part son expression plus précoce que le
CD45 et sa capacité à discriminer parmi les cellules CD34+ les
cellules à potentiel endothélial (CD34+CD43-CD31+KDR+) et
mésenchymateux (CD34+CD43-CD31-KDR-). De plus, les
progéniteurs CD43+CD235a+CD41a+CD45+ s’orientent vers une
différenciation érythroïde et mégacaryocytaire, alors que les
progéniteurs CD43+CD45+/-Lin- s’orientent vers une différenciation
myéloïde et lymphoïde [34].
hES et différenciation érythroïde terminale
Les travaux traitant spécifiquement de la
différenciation/maturation érythroïde terminale à partir de hES
sont encore peu nombreux [35-38]. Les deux modalités de
différenciation cellulaire in vitro (CE et coculture) sont
développées et aboutissent selon le protocole : soit à une
érythropoïèse primitive, avec génération d’érythroblastes
acidophiles mégaloblastiques produisant majoritairement de
l’hémoglobine embryonnaire [35, 36], soit à une érythropoïèse
définitive, avec génération de GR matures énucléés, avec une
hémoglobine le plus souvent mal caractérisée. En effet, fin 2008,
la génération in vitro de GR a été rapportée par deux groupes
utilisant deux approches différentes : les premiers utilisent un
système de coculture des hES sur un stroma de foie fœtal et
optimisent ainsi la formation de colonies érythroïdes (BFU-E) au
sein desquelles sont générés quelques GR coexprimant fortement les
chaînes de globine alpha, bêta, gamma et epsilon en
immunofluorescence et PCR quantitative [38] ; le second groupe
utilise un protocole de différenciation assez complexe, où se
succèdent des phases d’induction de différenciation des hES vers
l’hémangioblaste, d’amplification sous l’influence de la protéine
recombinante HoxB4 et différenciation/maturation érythroïde
selon le protocole de génération de GR ex vivo publié par notre
groupe [37]. Les auteurs aboutissent à la production d’une
population érythrocytaire majoritairement mature composée à 40 % de
GR. Notre équipe a également développé un protocole de
différenciation des hES en globules rouges matures et fonctionnels.
Notre protocole fait intervenir deux étapes successives : une
première étape d’induction précoce de l’érythropoïèse par formation
de corps embryoïdes en présence d’un cocktail de huit cytokines,
suivie d’une étape de différenciation/maturation érythroïde
terminale (MCG Nat. Biotech). L’engagement érythroïde est complet
avec l’obtention au final de 60% de globules rouges matures,
fonctionnels, capables de synthétiser plus de 90% d’hémoglobine F.
De plus, les conditions de culture permettent de s’affranchir
de tout stroma cellulaire et de la sélection des cellules
CD34 positive. À ce jour, les érythroblastes et/ou les GR
générés à partir de hES synthétisent au mieux de l’hémoglobine
fœtale, mais pas d’hémoglobine adulte. Ces résultats sont
toutefois très encourageants mais à moduler au regard des très
faibles niveaux d’amplification : quel que soit le protocole
utilisé, une hES donne au mieux naissance en moyenne à 2000,
résultat sans commune mesure avec les niveaux d’amplification à
partir des CSH de sang de cordon [37, 38].
En France, la recherche à partir des hES est légalement très
réglementée (loi et décret d’application en 2004) et étroitement
encadrée par l’Agence de la Biomédecine qui délivre les
autorisations. L’utilisation des hES en recherche permettra des
avancées considérables en terme de recherche fondamentale sur la
compréhension du développement cellulaire et tissulaire de l’homme.
Tout reste à faire dans le domaine délicat des applications des hES
à la thérapie cellulaire, « outil » peut être déjà remplacé par les
cellules adultes reprogrammées en cellules ES-like ou iPS (induced
pluripotent stem cell).
Les cellules souches pluripotentes adultes
Multipotent adult progenitor cells
Au cours des dernières années, plusieurs études ont clairement
montré qu’il était possible d’isoler des cellules souches adultes
pluripotentes à partir des tissus adultes. Les travaux initiés
par le groupe de C. Verfaillie [39] ont été les premiers à
démontrer la faisabilité de cette procédure, en utilisant
essentiellement une technique de sélection négative : déplétion de
cellules ayant des antigènes de différenciation, suivie d’une
culture à long terme à très faible densité, en présence de
concentrations très faibles de sérum (2,5 % de SVF) et de cytokines
EGF et PDGF.
Les cellules obtenues par cette procédure, désignées sous le
terme de multipotent adult progenitor cells (MAPC) ont peu de
marqueurs de différenciation, mais expriment Oct4, le facteur de
transcription majeur des cellules souches embryonnaires. Elles
présentent surtout un potentiel de prolifération majeur (jusqu’à
120 divisions), ce point étant un élément important pour la
production en quantité importante de cellules hématopoïétiques
matures. Des expériences de différenciation ont montré
d’emblée la difficulté d’induction de l’hématopoïèse, jusqu’à la
découverte du fait que seulement les MAPC surexprimant des
quantités importantes d’Oct4 étaient capables de générer une
hématopoïèse in vitro et in vivo.
La difficulté d’obtention de MAPC de manière reproductible a été
le problème majeur dans plusieurs laboratoires, mais d’autres types
de populations cellulaires, ayant des caractéristiques similaires à
celles de MAPC ont récemment été décrits dans les tissus adultes
murins et humains.
Unrestricted somatic stem cells
Kogler et al. [40] ont montré qu’il était possible d’isoler à
partir du sang de cordon, une population désignée sous le terme
d’unrestricted somatic stem cells (USSC) après deux à quatre
semaines de culture. Ces cellules possèdent des
caractéristiques de cellules pluripotentes, et la technique
d’obtention est beaucoup plus adaptée que les MAPC pour une
utilisation clinique, dans la mesure où le sang du cordon est déjà
un produit de thérapie cellulaire et que les conditions de culture
ne font pas intervenir des cytokines. La fréquence de ces
cellules paraît cependant faible, car, à la fin de la période de
culture, des colonies adhérentes étaient détectables avec une
fréquence de quatre colonies par échantillon de sang du cordon,
mais chaque colonie présentait par ailleurs un potentiel de
prolifération majeur pouvant théoriquement atteindre
1015 cellules [40].
Ces cellules possèdent par ailleurs un potentiel de
différentiation vers les trois feuillets embryonnaires, avec
possibilité de génération in vitro de cellules neurales,
cardiomyocytaires et hépatiques. Le potentiel hématopoïétique
de ces cellules a été testé dans un modèle de mouton après
injection intra-utérine, avec démonstration d’une hématopoïèse
humaine détectable pendant plusieurs mois [40], suggérant la
survenue d’un auto-renouvellement hématopoïétique, indiquant un
potentiel hématopoïétique « souche » des USCC. Ces résultats
font penser que des cellules souches USCC que l’on peut isoler à
partir d’une source cellulaire déjà en utilisation clinique (sang
du cordon) seraient probablement plus facilement utilisables pour
une production in vitro de GR. Cependant plusieurs points devront
être testés avant d’envisager cette possibilité à l’échelle
clinique. En effet, la première question est la fréquence des USSC
dans un échantillon donné, dans la mesure où le travail
initialement présenté indique qu’environ 30 % des échantillons de
sang du cordon testés possédaient le potentiel de générer USSC in
vitro (94 cordons sur 233 testés).
Ce problème peut certes être résolu dans le cadre de la mise en
place d’une plateforme de cellules souches permettant de collecter
des échantillons dans une banque de grade clinique. Cependant les
difficultés techniques restent à franchir, notamment pour
l’induction d’un potentiel hématopoïétique in vitro, ce qui est un
élément préalable nécessaire à la mise en place de techniques de
génération de GR. Ce défi est donc relativement similaire à
celui observe avec les cellules ES humaines.
Autres sources de cellules souches multipotentes
Au cours des dernières années, plusieurs équipes ont décrit des
cellules souches « multipotentes » obtenues à partir de tissus
adultes, comme la moelle osseuse, la peau, le tissu adipeux et,
plus récemment, le liquide amniotique [41]. Cette dernière source
est intéressante, dans la mesure où elle est aussi cliniquement
facilement accessible et que des banques de cellules amniotiques de
grade clinique pourraient facilement être mises en place.
Les cellules souches désignées sous le terme d’amniotic
fluid-derived stem cells (AFSC) sont obtenues par une sélection
positive des cellules exprimant le récepteur c-kit, qui sont
ensuite cultivées dans un milieu classique de type MEM en présence
de 15 % de sérum de veau fœtal. Des clones de cellules c-kit+
sont ensuite amplifiés, avec un potentiel de prolifération
important, pouvant aller jusqu’à 250 doublements de
population. Les AFSC ont des télomères longs, un caryotype
normal, et leur injection à la souris immunodéficiente ne génère
pas de tumeur détectable [41]. Sur le plan des marqueurs de
surface, ces cellules sont CD34-, CD45- et CD133-, et expriment
Oct4, et Tra-1-81 comme les cellules souches embryonnaires. Dans le
travail initial, ces cellules sont rapportées comme étant capables
de générer des cellules musculaires et des cellules
hepatocyte-like, mais leur potentiel hématopoïétique n’est pas
démontré avec certitude, en particulier leur capacité de générer
des cellules érythroïdes.
Cellules souches spécifiques de patients
L’utilisation clinique future de toutes les sources potentielles de
cellules souches multipotentes décrites dans les chapitres
précédents pose le problème de leur immunogénicité.
Ce problème, concernant également les lignes de cellules
souches embryonnaires humaines, a conduit certains investigateurs à
envisager des stratégies de génération de cellules souches «
spécifiques de patients ». Une approche originale, dont la
faisabilité a été démontrée chez la souris, est la procédure de «
clonage thérapeutique » par transfert d’un noyau d’une cellule
adulte dans un ovocyte énucléé par micromanipulation [42]. Cette
procédure permet ainsi de « reprogrammer » le noyau adulte dans le
contexte cytoplasmique de l’ovocyte, qui effectue après le
transfert nucléaire des divisions symétriques, avec, par la suite,
apparition d’une structure embryonnaire ressemblant à un
blastocyste. La masse interne de cette structure est alors
extraite et mise en culture en présence de LIF, permettant
l’obtention d’une lignée de cellule-souche embryonnaire.
Les lignées obtenues à partir de ces procédures sont capables
de subir des différenciations multiples vers plusieurs tissus
adultes portant les mêmes antigènes d’histocompatibilité que la
souris donneuse de noyau. Ce type de stratégie est certes
extrêmement attractif, mais des difficultés persistent quant à la
mise en place des méthodes reproductibles d’induction de
l’hématopoïèse à partir de cellules souches embryonnaires, en
particulier en ce qui concerne l’hématopoïèse définitive qui ne
peut actuellement être détectée. Les deux autres problèmes
majeurs sont la disponibilité des donneuses d’ovocytes et le
problème éthique. Ainsi, une application à grande échelle de la
technologie de clonage thérapeutique ne pourra être justifiée que
si des avancées majeures survenaient dans la méthodologie
d’induction d’une hématopoïèse définitive à partir de cellules
souches embryonnaires humaines, permettant la mise en place d’une
technique robuste de production de GR humains.
La dernière révolution : induced pluripotent stem cells
Le domaine de la recherche sur les cellules souches a été modifié
de manière profonde et probablement durable par la description
récente de la technologie de reprogrammation de cellules adultes
par surexpression de gènes de pluripotence. Cette technique a été
mise au point par le groupe de Yamanaka [43, 44], qui a réalisé un
criblage approfondi des gènes de pluripotence nécessaires et
suffisants pour l’induction d’une pluripotence dans les cellules
adultes. Cette équipe a ainsi identifié quatre gènes de
pluripotence (Oct4, Klf4, Sox2 and c-myc), dont la
surexpression dans une cellule fibroblastique embryonnaire ou
adulte permet d’induire un phénotype de cellule-souche absolument
identique à celui des CS embryonnaires dérivées des blastocytes,
comme cela a été confirmé par d’autres [45]. En effet, les lignées
de CS obtenues de cette manière, désignées sous le terme d’induced
pluripotent stem cell (iPSC), sont capables de contribuer à tous
les tissus adultes après injection dans un blastocyste, avec, par
ailleurs, toutes les autres caractéristiques des lignées de CS
embryonnaires, y compris la génération de tératomes chez la souris
immunodéficiente et expression de marqueurs de pluripotence [44,
45]. Les techniques initiales d’isolement des colonies d’iPSC
ont la nécessité d’utilisation d’une souche de souris transgénique
dans laquelle le locus Fbx15, un gène cible d’Oct4 contrôlant
l’expression du gène de résistance à un G418 par une procédure
de recombinaison homologue. Les cellules qui exprimaient le
gène Oct4 devenaient donc résistantes à l’antibiotique
Néomycine, permettant l’identification des colonies de type
embryonnaire. Ces dernières, qui devenaient aussi
identifiables par leurs morphologies caractéristiques, étaient
ensuite individuellement isolées et amplifiées dans les conditions
de cellules souches embryonnaires murines, notamment en présence de
LIF. Une étape importante dans la mise en évidence de la
pluripotence des iPSC a été franchie par les expériences démontrant
leur capacité de transmission germinale [46]. Cependant, la
surexpression de c-Myc, entraînait, de manière attendue, des
tumeurs chez certaines souris. Récemment, il a été montré que la
combinaison d’Oct4, de Klf4 et de Sox2 était suffisante
pour l’induction du phénotype pluripotent [47].
Les perspectives d’utilisation clinique potentielle de la
technologie d’iPSC ont rapidement apparu par la démonstration de la
faisabilité de cette approche de programmation dans les cellules
humaines [48]. En effet, il a été montré que l’expression des
quatre gènes de « Yamanaka » était suffisante pour générer des
iPSC, mais les fibroblastes adultes et les cellules
mésenchymateuses étaient relativement résistants à l’induction,
sauf lorsque les cellules exprimaient l’antigène T de SV40 et
hTERT [48]. En parallèle, la faisabilité des iPSC à partir des
cellules adultes humaines a été montrée par l’équipe de Thomson,
qui a utilisé une combinaison de gènes différente de celle de
Yamanaka, comprenant Oct4, Sox2, Nanog et Lin28 [49]. Parmi ces
quatre gènes, Oct4, Sox2 et Nanog apparaissent comme
suffisantes pour générer des iPSC à partir de cellules adultes.
L’application de cette technique aux cellules humaines [50] a
également été facilitée par le fait que le criblage initial par la
morphologie des colonies paraît satisfaisant, suivi par la
caractérisation phénotypique et moléculaire. Les techniques de
différenciation ont, par ailleurs, commencé à être mises en place.
Ainsi, le potentiel hématopoïétique des iPSC humaines a été
démontré [51]. La possibilité de programmation de tissus
adultes, à partir de tissus adultes provenant de patients atteints
de maladies diverses, a été montrée [52], avec, notamment,
démonstration de la génération de neurones dopaminergiques
autologues chez les patients atteints de Parkinson [53]. Plus
récemment, des cellules souches CD34+ mobilisées par cytaphérèse
ont été montrées comme étant programmables [54]. Les progrès
rapides de ce domaine permettent de donner des réponses à des
inquiétudes soulevées par l’introduction de gènes via les
rétrovirus ou les lentivirus dans les cellules humaines [55]. En
effet, les approches de virus non intégratifs sont en cours de
développement, ainsi que la possibilité d’excision de constructions
virales par des procédures de type Cre/Lox [56, 57]. Certains
agents chimiques, comme le valproate de sodium, semblent également
favoriser la génération d’un phénotype iPS à partir de cellules
adultes [58].
L’enthousiasme généré par la technologie iPSC ne doit pas
cependant conduire à une sous-estimation des difficultés
d’induction de l’hématopoïèse à partir des iPSC, par rapport aux
cellules souches embryonnaires. Les mécanismes de la
reprogrammation sont loin d’être élucidés ; en particulier, la
surexpression de gènes de pluripotence exogène semble induire
l’expression de gènes endogènes correspondants, mais l’extinction
de gènes transmis par les rétro- ou lentivirus est nécessaire avant
qu’une utilisation clinique puisse être envisagée [56, 57].
L’avantage majeur de cette technologie est le caractère autologue
des cellules produites, mais des possibilités d’induction de
tumeurs par un processus de programmation mal contrôlée ne sont pas
exclues. Les progrès futurs permettront sans doute cependant
des stratégies innovantes de programmation, par la mise en place de
protéines diffusibles qui pourraient remplacer la technologie de
transfert de gènes de pluripotence.
Un scénario futuriste pourrait donc déjà être envisagé pour des
applications de la technologie des iPS visant à produire des GR
autologues : Si ce scénario devient une réalité au cours du
XXIe siècle, un patient pris en charge pour une
pathologie hématologique grave comme une aplasie médullaire ou
leucémie aiguë, pourrait se voir proposer une biopsie cutanée pour
la constitution d’un master cell bank d’IPSC ayant pour but la
production de CSH autologues. Ces cellules, générées dans un
laboratoire de thérapie cellulaire de grade clinique, pourraient
ensuite être utilisées pour la génération de cellules
différenciées, y compris les GR autologues et compatibles. Une
étape importante dans cette direction a été déjà réalisée dans un
modèle de drépanocytose chez la souris, avec correction de la
mutation dans les iPSC par recombinaison homologue, suivie de
greffe de CSH normales/hétéro dérivées des iPSC « réparées »
[59].
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