ARTICLE
Auteur(s) : Rémi Letestu1, Florence
Nguyen-Khac2, Frédéric Davi2
1Service d’hématologie biologique, hôpital Avicenne,
125, route de Stalingrad, 93000 Bobigny
2Service d’hématologie biologique, hôpital
Pitié-Salpêtrière, 47-83, bd de l’Hôpital, 75013 Paris
La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est caractérisée par une
évolution remarquablement hétérogène. Alors que certains patients
ont une maladie totalement indolente pendant des dizaines d’années,
d’autres meurent plus ou moins rapidement en dépit de tout
traitement. Les classifications introduites par Rai et Binet il y a
une trentaine d’années, basées sur des signes cliniques
(adénopathies, hépatosplénomégalie) et des paramètres biologiques
simples (numération formule sanguine) ont permis de distinguer
trois groupes de patients ayant des pronostics distincts [1, 2].Ces
classifications ont été les gold standards pour guider les
stratégies thérapeutiques. Cependant, elles ne permettent pas de
prédire précisément l’évolutivité de la maladie, en particulier
chez les patients appartenant au groupe de faible risque. Ainsi,
parmi les malades initialement en stade A de Binet, soit les deux
tiers des cas de LLC, plus de 40 % évoluent vers des stades B
et C, et 50 % auront besoin d’être traités.Depuis une dizaine
d’années, de nouveaux marqueurs à valeur pronostique ont été
identifiés. Certains marqueurs sériques tels la β2microglobuline,
la thymidine kinase, le CD23 soluble, reflètent vraisemblablement
la masse tumorale et/ou sa capacité proliférative. Mais ce sont les
caractéristiques immunophénotypiques, chromosomiques et
moléculaires de ces leucémies qui constituent actuellement les
outils pronostiques les plus performants.
Facteurs pronostiques immunophénotypiques
Rémi Letestu
La cytométrie en flux (CMF) est un outil fondamental dans la prise
en charge diagnostique des syndromes lymphoprolifératifs. Elle
permet de déterminer précisément un profil d’expression des
marqueurs de membrane pour chaque cellule analysée. Dans la LLC, la
stabilité du phénotype des cellules pathologiques et la présence de
cibles caractéristiques permettent le plus souvent un diagnostic
positif aisé, en particulier grâce à l’application de
recommandations diagnostiques actuellement bien validées [3, 4]. De
nombreux marqueurs ont montré leur intérêt dans l’évaluation du
pronostic dans la LLC, et la CMF a toute sa place aux côtés des
techniques de biologie moléculaire et de cytogénétique comme outil
pronostique. Elle permet la recherche de marqueur spécifique
membranaire ou intracytoplasmique au sein d’une population
hétérogène sans nécessiter de purification préalable de la
population d’intérêt. Cette dernière peut en effet être
spécifiquement isolée par un choix judicieux de marqueurs
caractéristiques. La CMF est une technique de choix pour la
recherche de marqueurs associés à l’évolution clinique, parmi
ceux-ci, le CD38 et la kinase ZAP-70 ont été le sujet de nombreuses
études et sont probablement les plus connus.
CD38
Le CD38 est une glycoprotéine membranaire d’environ 45kDa
présentant diverses fonctions. C’est une ecto-enzyme (ADP-ribosyl
cyclase et hydrolase) qui se comporte également comme un récepteur
membranaire et intervient dans l’adhésion et la signalisation
cellulaire grâce à l’interaction avec son ligand le CD31 [5, 6].
Sur les cellules lymphoïdes, le CD38 est un marqueur d’activation
et de maturation non spécifique de lignée, il a été proposé comme
une cible pour des anticorps monoclonaux thérapeutiques dans le
myélome multiple. Dans le cadre de la LLC, la possibilité d’une
expression membranaire du CD38 [7] dans un groupe de patients a été
documentée bien avant que ne soit soulevé l’intérêt de son étude
par S. Zupo et al. Leurs travaux ont en effet montré une
réponse à la stimulation du BCR par antiIgM variable selon la
présence ou non d’une expression du CD38 à la surface des cellules
et suggéré une implication physiopathologique de cette molécule
[8].
L’intérêt pronostique de l’expression membranaire du CD38 a été
mis par la suite au premier plan. Ce marqueur a tout d’abord été
proposé comme marqueur de substitution à l’étude du statut
mutationnel des gènes IgH [9, 10]. De nombreuses études ont été
menées dans les années suivantes pour tenter de préciser cette
corrélation conduisant à des résultats parfois contradictoires. Si
l’usage de ce marqueur en tant que substitut des mutations
somatiques n’a pas été clairement validé, l’intérêt du CD38 comme
facteur pronostique indépendant a néanmoins été démontré
[11-14].
Parallèlement il est apparu que, en fonction de la procédure
technique utilisée, les résultats obtenus pouvaient être très
variables. Le choix du clone d’anticorps ainsi que celui du
fluorochrome auquel il est conjugué sont critiques et doivent être
validés avec soin. Enfin le mode d’interprétation du résultat du
marquage a été beaucoup débattu et le seuil de positivité reste
actuellement controversé. Les premières études ont établi un seuil
de positivité à 30 % [9, 15], certains auteurs ont aussi
utilisé un seuil de 20 % [16, 17] ou encore les moyennes
d’intensité de fluorescence [12]. Cependant, la pertinence de ces
seuils a été remise en question par la description de
l’hétérogénéité du niveau d’expression du CD38 d’un patient à
l’autre ainsi que l’existence d’un profil d’expression bimodal chez
de nombreux sujets. Un profil bimodal correspond à l’association
d’une population négative à une population positive dont la
proportion est très variable (8-72 %) ; chez ces
patients, l’évolution est plus défavorable que si le marqueur est
négatif [18]. Allant dans le même sens, une étude a montré peu
après qu’un seuil de positivité de 7 % avait une valeur
pronostique significative [19].
Devant ces difficultés techniques et d’interprétation, une
approche légèrement différente a été proposée utilisant une méthode
quantitative. Cependant, la supériorité de la quantification sur
l’expression en pourcentage pour l’identification des sujets à
pronostic défavorable n’est pas clairement établie. Certains
auteurs ont suggéré que la quantification avait un intérêt chez le
sujet jeune (< 60 ans) et dans le groupe stade A de la
classification de Binet [20]. Plus récemment, une autre équipe a
montré que l’application d’un seuil de positivité à 5 % était
suffisante pour la stratification pronostique, la quantification
n’apportant pas d’information supplémentaire dans leur étude
portant sur 78 patients [21].
Au total, l’évaluation de l’expression du CD38 sur les cellules
de LLC est un marqueur pronostique validé mais peu utilisé dans la
stratification pronostique des patients participant aux essais
cliniques probablement en raison de l’absence de consensus
technique définitif.
ZAP-70
Depuis que son expression a été détectée dans les cellules de LLC
par des études de profil d’expression génique, la kinase ZAP-70 a
été un centre d’intérêt croissant [22]. L’association au marqueur
pronostique de référence que sont les mutations somatiques des
gènes des immunoglobulines en a fait une cible privilégiée dans les
études pronostiques. Pressentie comme un marqueur de substitution
du statut mutationnel des gènes des immunoglobulines [23, 24]
l’expression de ZAP-70 ne s’est avérée qu’imparfaitement corrélée
aux mutations somatiques. Le pourcentage de concordance est
variable selon les études et les techniques utilisées et se situe
le plus souvent entre 75 et 85 % [25-29]. Par la suite, la
signification pronostique propre de l’expression de ZAP-70 a été
démontrée [26, 28-30] ce qui justifie les efforts déployés depuis
pour mettre au point une méthode de détermination fiable. En marge
de son importance dans la compréhension des mécanismes
physiopathologiques de la maladie, l’étude de l’expression de
ZAP-70 dans la LLC est aussi un défi technique.
ZAP-70 est une protéine tyrosine kinase de la famille Syk ayant
une fonction cruciale dans les cellules T. Impliquée dans la
cascade de la signalisation intracellulaire après l’engagement du
TCR, elle est aussi fortement exprimée dans les cellules NK où elle
intervient dans la signalisation du récepteur FcγRIIIa. Par
conséquent, toute méthode de mesure réalisée sur un échantillon de
sang périphérique devra être soit capable de différencier
l’expression dans les cellules T et NK de celle des cellules de LLC
soit comporter une étape préalable de purification. Différentes
approches techniques ont été testées pour l’évaluation de
l’expression de ZAP-70 :
- – au niveau de l’ADN génomique avec l’étude de la
méthylation du promoteur du gène [31],
- – au niveau ARN par PCR semi-quantitative et PCR
quantitative en temps réel [23, 30, 32],
- – au niveau protéique par immunoblot, immunocytochimie
[33, 34].
La CMF est un outil particulièrement adapté pour repérer les
différentes sous-populations cellulaires au sein d’un échantillon
sanguin. Par contre, la localisation intracellulaire de la molécule
est une difficulté technique et son homologie avec Syk est un
écueil pour la production d’anticorps spécifiques. De plus,
l’expression de ZAP-70 a longtemps été considérée comme restreinte
aux lignées T et NK mais des études récentes montrent qu’elle peut
aussi être observée dans les précurseurs B médullaires [35, 36],
dans les cellules B matures sous certaines conditions d’activation
[37] ou dans des sous-populations cellulaires de la rate et de
l’amygdale [36, 38]. L’expression dans les cellules B normales
circulantes est encore controversée [37].
Néanmoins, la possibilité de réaliser des immunomarquages
multiparamétriques en CMF en fait une méthode attractive pour ce
type d’application. Plusieurs études ont décrit des procédures
techniques utilisant des anticorps, des stratégies d’analyse et des
modes d’expression des résultats différents [24-26]. Devant la
multiplication des procédures techniques, une standardisation était
donc fondamentale dans le but d’une utilisation en pratique
quotidienne et dans les essais cliniques. Des travaux
d’harmonisation ont été menés par plusieurs équipes françaises dans
le cadre d’un protocole de soutien aux innovations thérapeutiques
coûteuses [39] et un groupe de travail multinational [40]. Les
résultats ont été publiés récemment et fournissent des
recommandations validées pour la mise en place de cette analyse
mais tous les aspects délicats de la technique ne sont pas résolus.
Par ailleurs, de nouveaux réactifs donnant des résultats
prometteurs ont été commercialisés depuis peu, il est donc
important que l’effort d’harmonisation se poursuive afin d’établir
des règles d’application précises.
Conclusion
La CMF est une méthode utilisée dans un but diagnostique et
pronostique depuis de plusieurs années dans la LLC. La similitude
de l’historique des marqueurs CD38 et ZAP-70 est intéressante, tous
deux proposés comme marqueur de substitution de l’étude du statut
mutationnel des gènes des immunoglobulines, ils se sont révélé
avoir une signification pronostique propre. Dans les deux cas des
difficultés de méthodologie et d’interprétation ont freiné leur
utilisation dans la prise en charge des patients mais un véritable
effort de standardisation a été réalisé pour ZAP-70. Il reste à le
valider dans des essais cliniques en lui attribuant une valeur dans
la stratification du risque évolutif des patients afin de pouvoir
bénéficier dans un avenir proche d’un nouveau marqueur pronostique
fiable et informatif détectable par CMF. Enfin, différents groupes
ont souligné l’intérêt de combiner les deux marqueurs ZAP-70 et
CD38 [25, 28, 30]. La contribution de la CMF dans l’évaluation
pronostique des patients reposera peut-être sur la recherche d’un
profil immunophénotypique prédictif résultat de l’association de
plusieurs marqueurs.
Facteurs pronostiques cytogénétiques
Florence Nguyen-Khac
Les difficultés de classification de certaines hémopathies
lymphoïdes chroniques B rendent quelquefois l’interprétation des
analyses cytogénétiques publiées délicate. En effet, selon les
études, la distinction n’est pas toujours faite entre LLC, LLC
atypique, leucémie prolymphocytaire B, phase leucémique de
lymphome, les critères diagnostiques morphologiques et
immunophénotypiques n’étant pas toujours homogènes. Par ailleurs,
il faut aussi tenir compte de la date du diagnostic, du stade
clinicobiologique Binet ou Rai, et d’un éventuel traitement
antérieur à l’étude cytogénétique.
Cytogénétique conventionnelle (CC) (caryotype standard) et
hybridation in situ fluorescente (FISH)
Depuis les années 1980, malgré l’introduction de cultures longues
(72 à 96 h) en présence d’agents mitogènes classiques des
lymphocytes B, comme le 12-O-tétradécanoylphorbol-13-acétate (TPA),
lipopolysaccharide (LPS), pokeweed mitogen (PWM), seuls 40 à
50 % des cas étudiés de LLC présentaient des anomalies
chromosomiques clonales par CC [41-43]. Les anomalies les plus
fréquemment observées étaient la trisomie 12, la délétion partielle
ou translocation impliquant le bras long du chromosome 13 (13q),
les délétions partielles du bras long du chromosome 6 (6q), du bras
court du chromosome 17 (17p), et du bras long du chromosome 11
(11q), et plus rarement un réarrangement du chromosome 14, en
14q32, au locus des gènes codant pour les chaînes lourdes des
immunoglobulines (IGH) [42]. De rares translocations récurrentes
juxtaposant les IGH à un gène partenaire sont rapportées, comme la
t(14;18)(q32;q21) impliquant le gène BCL2 en 18q21 ; la
t(14;19)(q32;q13) impliquant le gène BCL3 en 19q13 ; de
manière exceptionnelle la t(11;14)(q13;q32) impliquant le gène BCL1
(codant pour la cycline D1) en 11q13 ; la translocation
t(2;14)(p13;q34) impliquant le gène BCL11A en 2p13 [44-46]. Plus
récemment, la t(1;6)(p35;p25) impliquant le gène IRF4 en 6p25 et un
gène non identifié en 1p35 a été décrite [47].
À partir des années 1990, la recherche spécifique par FISH des
anomalies récurrentes initialement observées par CC a permis de
montrer leur grande fréquence (dans plus de 80 % des cas de
LLC analysés) et de mettre en évidence leur valeur pronostique
[48]. Les analyses par FISH pouvant être réalisées sur métaphases
et sur noyaux interphasiques, permettent d’une part de mettre en
évidence des anomalies cryptiques non vues par caryotype standard,
et d’autre part d’analyser un plus grand nombre de cellules.
Plus récemment, l’application de nouvelles techniques de
stimulation par le CD40 ligand (CD40L) ou avec des
CpG-oligodeoxynucléotides (CpG-ODN), associées ou non à des
interleukines (IL4 et IL2 respectivement) [49-51], ont permis
d’augmenter considérablement le nombre d’anomalies chromosomiques
détectées par caryotype standard, présentes dans 80 à 90 % des
cas selon les études [45, 46, 51].
Valeur pronostique des anomalies chromosomiques
Délétions 13q14
La délétion impliquant la bande 13q14 est souvent cryptique (non
visible par CC), et présente dans 55 à 63 % des cas, selon les
études, ce qui en fait l’anomalie cytogénétique la plus fréquente.
Cette délétion est hétérozygote, plus rarement homozygote. Elle
peut être associée à une translocation chromosomique impliquant la
bande 13q14. La région minimale de délétion est située en 13q14.3
autour des locus D13S272 et D13S319. Calin et al. ont décrit deux
micro-RNAs miR-15 et miR-16 localisés dans cette région, et qui
sont sous-exprimés dans 68 % des LLC testées [52, 53]. Ces
micro-RNAs favorisent l’apoptose, en régulant de façon négative le
gène BCL2 [54]. Dans l’étude par FISH interphasique de Döhner et
al., les patients avec délétion 13q14 isolée (sans autres anomalies
retrouvées avec le jeu de sondes utilisées) ont la meilleure survie
globale et la plus longue médiane de l’intervalle sans traitement
[48]. Il semblerait cependant que la survie sans traitement soit
significativement moins longue chez les patients associant une
délétion 13q à une translocation chromosomique que chez les
patients avec une délétion 13q isolée [45].
Trisomie 12
La trisomie 12, par CC ou par FISH, est trouvée dans
approximativement 13 à 25 % des cas, selon les nombreuses
études publiées. La zone minimale critique de trisomie semble
restreinte aux bandes 12q13-15 [55, 56]. La signification
pronostique de la trisomie 12 est controversée selon les
différentes publications [57]. Il pourrait y avoir une association
entre la présence de trisomie 12 et une augmentation du pourcentage
de lymphocytes atypiques, avec un immunophénotype atypique. Dans
les études récentes, la valeur pronostique de la trisomie 12 en
termes de survie serait nulle [48], elle n’aurait pas non plus
d’incidence sur la survie sans traitement dans l’analyse de Mayr et
al. [45]. Cependant des données préliminaires de l’étude CLL1
allemande montrent que le groupe de patients avec délétion 17p,
délétion 11q ou trisomie 12 a une survie sans progression diminuée
[58].
Délétions 11q22-23
Les délétions 11q22-23 sont retrouvées dans environ 11 à 18 %
des cas selon les séries, les analyses par FISH avec des sondes
couvrant la région minimale de délétion (comprenant le locus du
gène ATM) ayant permis d’augmenter et de préciser la fréquence de
cette anomalie par rapport à la CC. En effet, la région minimale de
délétion de 2-3Mb a été identifiée en 11q22.3-q23.1 [59], et le
gène candidat potentiel suppresseur de tumeur impliqué dans la LLC
est le gène ATM dans cette région. La présence de
mutations/délétions bialléliques d’ATM, et l’absence ou la
diminution d’expression d’ATM décrites dans des LLC en font un bon
candidat [60-63]. Stankovic et al. ont montré que les tumeurs avec
un allèle mutant d’ATM présentent in vitro des réponses
ATM-dépendantes défectueuses aux irradiations [62, 64]. Et il est
important de savoir que des mutations d’ATM peuvent entraîner un
dysfonctionnement de la voie p53 [65, 66]. Il existe selon les
études une mutation du gène ATM dans 22 % à 40 % des cas
de LLC avec délétion 11q [63, 64]. Inversement, il existe des
mutations hétérozygotes d’ATM, sans délétion associée de l’autre
allèle, et Austen et al. suggèrent qu’il pourrait y avoir un effet
dominant négatif de cette mutation, avec un impact pronostic sur la
survie des patients.
La délétion 11q est souvent associée à la présence
d’adénopathies multiples périphériques, abdominales et
médiastinales, une progression plus rapide de la maladie, un
intervalle sans traitement plus court, et une survie globale
diminuée [57]. Austen et al. montrent que les LLC avec une délétion
11q sans mutation de l’autre allèle ont une phosphorylation normale
des cibles dépendantes d’ATM, et suggèrent que dans ces cas, la
perte d’ATM n’est pas en rapport avec le mauvais pronostic [64].
Enfin, la délétion 11q pourrait apparaître au cours de l’évolution
de la maladie dans de rares cas de LLC [67].
Délétions 17p13
Les anomalies structurales du bras court du chromosome 17,
responsables le plus souvent de la perte de la bande 17p13, sont
observées dans 4 % des cas [42, 68]. Les études par FISH avec
des sondes couvrant le locus du gène suppresseur de tumeur TP53 en
17p13 retrouvent une délétion TP53 dans 7 % des cas [48]. Il
existe une bonne corrélation entre la délétion TP53 et la mutation
de l’autre allèle (72 à 83 % des cas), cependant elle n’est
pas absolue [69, 70]. Les anomalies TP53 ont un impact pronostique
majeur, avec une survie globale plus courte, et une non-réponse aux
agents alkylants et aux analogues des purines [68, 71, 72]. En
analyse multivariée, la délétion TP53 est le facteur pronostique le
plus puissant [48]. Il a été décrit des cas d’apparition de
délétion TP53 au cours de l’évolution de la maladie [13]. Devant
l’importance de ce facteur pour la prise en charge thérapeutique,
il est important d’harmoniser et de valider les différentes
méthodes pour détecter les délétions TP53 : mise en culture ou
non des cellules, sondes, seuils de positivité par FISH
interphasique.
Délétions 6q
Leur incidence est évaluée à 6 % par cytogénétique
conventionnelle [42]. Une région minimale de délétion de 3cM a été
identifiée dans la bande 6q21 [73, 74]. L’implication des gènes
localisés dans cette région dans la LLC n’est pas établie à ce
jour. Les analyses par FISH avec une sonde 6q21 retrouvent une
incidence de délétion proche d’environ 7 % [48, 75]. La
délétion 6q est associée à une lymphocytose plus élevée, des
adénopathies plus nombreuses, mais il n’existe pas de différence en
terme de survie par rapport aux LLC sans délétion 6q [48].
L’intervalle plus court sans traitement observé dans une étude
[76], ne semble pas être confirmé par d’autres [48, 75].
Caryotypes complexes et translocations chromosomiques
Avec les nouvelles techniques de stimulation par CD40L ou CpG-ODN,
Mayr et al. observent que la présence de translocations
chromosomiques (équilibrées et déséquilibrées) est un facteur
indépendant de mauvais pronostic et influe sur la survie sans
traitement et la survie globale [45]. La présence d’un caryotype
complexe (> 3 aberrations chromosomiques) est aussi
un facteur de mauvais pronostic, mais avec un impact moindre. Dans
le même ordre d’idée, Dicker et al. concluent que la présence de
translocations déséquilibrées corrèle significativement avec le
statut non muté des gènes IGH, et que la présence d’un caryotype
complexe et de translocations équilibrées corrèlent avec
l’expression positive du CD38 [46].
Conclusion
Les deux anomalies cytogénétiques reconnues comme étant de mauvais
pronostic à ce jour et pouvant orienter la prise en charge
thérapeutique sont la délétion partielle du bras long du chromosome
11/délétion ATM, et la délétion partielle du bras court du
chromosome 17/délétion TP53. La trisomie 12, qui aurait une
influence sur la survie sans progression, a été retenue comme
critère de mauvais pronostic et donc faisant partie des critères
décisionnels pour le protocole CLL7 portant sur les LLC stade A.
D’autres anomalies cytogénétiques sont en cours d’évaluation.
Les caryotypes complexes et les translocations seraient des
facteurs de mauvais pronostic indépendants. De plus, les anomalies
cytogénétiques pouvant être associées entre elles, il semblerait
qu’une anomalie isolée n’ait pas la même valeur pronostique que
plusieurs anomalies associées. Enfin, des résultats préliminaires
non encore publiés suggèrent que le pourcentage de cellules avec
délétion TP53 sur cellules non cultivées par FISH interphasique
serait important pour la signification pronostique. Toutes ces
observations doivent être validées et il semble donc important
d’une part d’inclure dans les protocoles une étude cytogénétique
conventionnelle et par FISH, et d’autre part d’homogénéiser les
analyses par FISH sur noyaux interphasiques.
Facteurs pronostiques moléculaires
Frédéric Davi
Statut mutationnel des immunoglobulines
Depuis de nombreuses années, l’étude des séquences nucléotidiques
gènes de chaînes lourdes d’immunoglobulines (IGVH) exprimées par
les lymphocytes B malins est utilisée en particulier pour situer
les hémopathies dans le schéma de différenciation physiologique des
lymphocytes B, et définir plus précisément leur origine cellulaire.
Les premiers travaux de ce type effectués sur les LLC avaient
montré l’utilisation d’un répertoire IGVH non muté [77]. Ceci était
cohérent avec le concept généralement admis alors que les cellules
de LLC dérivaient un type de lymphocyte B particulier, qui chez la
souris constitue un lignage appelé B1 ; celui-ci est
caractérisé notamment par l’expression de CD5, la production
d’anticorps polyspécifiques de faible affinité, ayant souvent une
activité auto-anticorps et codés par des gènes IGVH non ou peu
mutés. Cependant, avec l’accumulation de données sur les séquences
IGVH des LLC, il est apparu que dans environ la moitié des cas,
celles-ci comportaient un nombre variable de mutations somatiques
[78]. Enfin, en 1999, deux observations princeps ont montré
clairement que l’absence ou la présence de ces mutations dans les
gènes IGVH était associée à une évolution très différente de la
maladie [9, 10]. Ainsi, dans la série de Hamblin et al. les cas
avec des IGVH mutés avaient une médiane de survie de 293 mois,
alors qu’elle n’était que de 95 mois pour les cas exprimant
des IGVH non mutés [10]. Depuis, de nombreuses études ont confirmé
la valeur pronostique du statut mutationnel des IGVH.
La détermination du statut mutationnel des IGVH implique la
réalisation de la séquence nucléotidique de la région variable des
Ig, obtenue préalablement après amplification par réaction de PCR à
partir de l’ADN ou l’ARN extrait des cellules tumorales, et sa
comparaison avec les séquences germinales les plus proches. Par
prudence, eu égard au possible polymorphisme, les séquences
présentant plus de 98 % d’homologie ont été initialement
considérées comme non mutées. Ceci suppose bien entendu que la base
de séquences qui sert de référence tienne compte de ces
polymorphismes et soit régulièrement mise à jour. À ce titre, la
base IMGT est à ce jour celle qui répond le mieux à cette exigence
[79]. En fait, dans une dizaine de cas où le gène germinal
correspondant a pu être identifié chez les patients à partir de
leurs cellules non tumorales, la divergence de séquences était due
essentiellement à des mutations somatiques et non à des
polymorphismes [80]. Par ailleurs, si des seuils de 97 % voire
95 % ont été proposés par certaines équipes [19, 81], la
valeur de 98 % est celle qui est reconnue par la majorité des
études comme étant la plus discriminante sur le plan clinique [69,
82].
En outre, certains gènes IGVH semblent échapper à la
classification muté/non muté et conférer leur propre valeur
pronostique. C’est particulièrement le cas pour le gène VH3-21 dont
une équipe suédoise avait noté la fréquence particulière
(12 %) et l’évolution défavorable quel que soit le degré de
mutation [83]. Une étude sur les LLC des pays méditerranéens
(France, Espagne, Italie, Grèce) a montré que la fréquence
d’utilisation de ce gène était bien moindre (3 %) et que l’on
distinguait deux classes de patients utilisant le gène
VH3-21 : ceux exprimant un récepteur « canonique »
(très forte homologie sur toute la séquence IGVH, en particulier la
région CDR3, et chaînes légères identiques) et d’évolution
défavorable indépendamment du degré d’homologie, et ceux
hétérogènes (régions CDR3 hétérogènes et chaînes légères
distinctes) dont l’évolution dépendait du statut mutationnel [84].
L’analyse du répertoire des IGVH d’un grand nombre de LLC a révélé
qu’en fait plus de 20 % des cas expriment un récepteur
« canonique », répartis en une cinquantaine de groupes
d’homologie, dont certains avaient une évolutivité indépendante du
statut mutationnel [85].
Plusieurs études ont évalué la corrélation entre les différents
marqueurs pronostiques. Le statut mutationnel des IGVH est un
indicateur indépendant des stades cliniques de la classification de
Binet, ce qui a permis à Vasconcelos et al. de décrire quatre
groupes de patients avec des médianes de survie globale
significativement différentes [86]. La délétion 13q est plus
fréquemment retrouvée dans les LLC avec un statut muté des IGH [19,
46, 69]. À l’inverse, si les anomalies cytogénétiques de mauvais
pronostic, telles les del(11q) et del(17p) sont détectées très
majoritairement parmi les cas exprimant des IGVH non mutés, cette
association n’est pas absolue et de fait elles constituent un
facteur pronostique indépendant du statut mutationnel [19, 64, 69].
En raison de la difficulté à réaliser cette analyse en pratique
routinière, les protéines CD38 et ZAP-70 ont été proposées comme
marqueurs de substitution [9, 24]. S’il existe une association
entre l’expression de CD38 et IGVH non mutés, le degré de
corrélation varie selon les études, ceci étant lié au moins en
partie à l’utilisation de seuils de positivité différents [9, 15,
69, 81]. De fait, CD38 peut être considéré comme un marqueur
pronostique indépendant avec sa propre valeur clinique [14, 81].
Cependant son expression peut varier au cours de la maladie,
contrairement au statut mutationnel des IGVH qui est un paramètre
fixe [14]. De même, les cas de LLC avec IGVH non mutés tendent à
être préférentiellement ZAP-70-positifs, mais là aussi des
discordances (7 % à 25 %) avec le statut mutationnel ont
été rapportées [23-26, 29]. Dans une étude très récente, Kröber et
al. ont montré que ces discordances étaient associées à la présence
d’une del(11q) ou del(17p) dans le groupe IGVH non mutés,
ZAP-70-négatifs, et à l’utilisation du gène VH3-21 dans le groupe
IGVH mutés, ZAP70-positifs [29]. Une étude américaine comparant la
capacité des IGVH et de ZAP-70 à prévoir le délai entre le
diagnostic et le début du traitement a montré un avantage en faveur
de ZAP-70 (risque relatif de 4,9 versus 2,5) [26]. En revanche, une
étude française a montré que si ZAP-70 est un bon indicateur de la
survie sans progression chez les patients en stade A, il n’était
absolument pas prédictif de la survie globale des patients en
stades B et C, contrairement au statut mutationnel des IGVH
[87].
Marqueurs pronostiques issus des données du transcriptome
La raison pour laquelle l’évolution de la maladie est si différente
en fonction du statut mutationnel des IGVH est encore mystérieuse.
Les analyses du transcriptome ont réfuté l’hypothèse qu’il s’agisse
de deux maladies différentes dans la mesure où les avec IGVH mutés
et non mutés ont un profil d’expression génique globalement
similaire, qui les distingue clairement des autres hémopathies
lymphoïdes B [22, 88]. En dépit de cette signature moléculaire
unique, ces deux formes diffèrent néanmoins dans l’expression de
plusieurs dizaines de gènes. C’est ainsi que ZAP-70 a été mis en
évidence comme transcrit préférentiellement dans les LLC avec IGVH
non mutés, découverte inattendue dans la mesure où cette protéine
était jusqu’alors considérée comme spécifique des cellules T et NK.
De manière similaire, a été identifié le gène codant pour la
lipoprotéine lipase (LPL) dont l’expression corrèle avec le statut
IGVH non mutés et une survie moindre [87, 89]. Nous avons récemment
montré que ses performances en tant que marqueur de substitution du
statut mutationnel et de pronostic pouvaient être améliorées par la
quantification simultanée du gène ADAM29, qui lui au contraire est
exprimé préférentiellement dans les LLC à IGVH mutés [87]. Ainsi,
sur une série de 127 LLC, le rapport LPL/ADAM29 avait une
concordance de 90 % avec le statut mutationnel (contre
76 % pour LPL seul et 82 % pour ADAM29 seul). En outre,
si ce rapport LPL/ADAM29, comme ZAP-70, était un marqueur
pronostique indépendant pour la survie sans évènement chez les
patients en stade A, il s’avérait également capable de prédire la
survie globale chez les patients en stade B/C, contrairement à
ZAP-70.
Des profils d’expression différents selon le statut mutationnel
des IGVH et ZAP-70 ont été également mis en évidence très récemment
pour les micro-ARNs. Cette classe de petits ARN non codants,
intervient dans la régulation de nombreux gènes cellulaires, et
leur localisation sur le génome suggère un rôle dans de nombreux
cancers. C’est le cas pour deux d’entre eux, miR-15 et miR-16, qui
sont situés dans la région de délétion 13q13 [52]. Calin et al. ont
montré qu’un groupe de 13 micro-ARNs différenciait les LLC
ZAP-70-positifs avec IGVH non mutés de celles ZAP-70-négatifs avec
IGVH mutés, et constituaient un indicateur de progression de la LLC
[53].
Autres marqueurs
L’érosion des télomères est un processus physiologique qui est le
reflet du nombre de divisions et du vieillissement cellulaire, et
est contrebalancée par l’enzyme télomérase. Celle-ci est également
un élément essentiel pour l’immortalisation des cellules, et de ce
fait une activité télomérase élevée a été détectée dans la majorité
des cancers. Dans les cellules de LLC, l’expression de la
télomérase est variable, et un taux élevé est associé à des IGVH
non mutés, une maladie évolutive et une survie moindre [90, 91].
L’activité télomérase est également corrélée négativement avec la
longueur des télomères. Ce dernier paramètre est un facteur
pronostique de survie, et fait intéressant aussi bien dans les
stades A que les B/C [91, 92].
CLLU1 est un gène récemment identifié par la technique de
differential display et dont l’expression semble être spécifique de
la LLC [93]. Il pourrait coder pour une protéine ayant une forte
homologie avec l’interleukine 4, cytokine jouant un rôle dans la
survie des cellules de LLC. L’expression de CLLU1 est corrélée avec
le délai de traitement initial et dans une moindre de mesure la
survie [94].
Enfin, des polymorphismes de certains gènes, tels BAX [95] et
BCL2 [96], ont été décrits comme ayant une valeur pronostique, mais
ces résultats demandent à être confirmés.
Conclusion
Devant l’émergence de nouvelles stratégies thérapeutiques, un des
enjeux de la prise en charge de la LLC est le choix du traitement
le plus adapté pour un patient en fonction de son profil évolutif.
La dernière décennie a vu apparaître un grand nombre de paramètres
biologiques pronostiques. Leur valeur relative nécessite qu’ils
soient évalués en parallèle sur des grandes séries de patients. À
ce jour, ce sont essentiellement les marqueurs cytogénétiques et le
statut mutationnel des IGVH qui sont ou vont être utilisés dans un
futur proche pour la stratification thérapeutique. La finalisation
de la standardisation des techniques de cytométrie en flux
permettra vraisemblablement à ces paramètres de figurer en bonne
place dans l’arsenal des marqueurs pronostique décisionnels. À
l’avenir, il est envisageable que de nouvelles méthodologies basées
sur la quantification simultanée de l’expression de multiples
gènes, sous un format de PCR quantitative ou de puces à ADN,
puissent fournir rapidement une évaluation du pronostic de la LLC.
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