ARTICLE
Nous allons résumer les nouveautés ou les acquis récents
présentés à Adélaïde dans le domaine
de la transplantation de cellules souches du sang périphérique.
Ce congrès faisait suite au congrès organisé en 1993
à Bordeaux sur le même thème.
Description de la cellule souche hématopoïétique
Très peu de nouveautés ont été rapportées
sur ce thème. A. Galy a présenté un résumé
des résultats obtenus par son équipe sur la sous-population
médullaire de phénotype CD34+, CD45RA+,
CD10+, lin-. Cette sous-population ne représente
que moins de 5 % de l'ensemble des progéniteurs CD34+
et est restreinte dans sa capacité hématopoïétique,
ne se différenciant qu'en cellules T, cellules B, cellules NK et
cellules dendritiques (CD1a) sans aucune différenciation myéloïde.
Cette sous-population n'est pas retrouvée dans les cellules souches
du sang périphérique ou du sang de cordon.
C. Eaves et W. Sheridan ont fait la revue générale de tous
les tests fonctionnels permettant l'évaluation des progéniteurs
hématopoïétiques, pour en souligner les difficultés
de standardisation d'un laboratoire à l'autre. Ces tests sont nombreux
: colony forming cells (CFC), long term culture initiating cells
(LTCIC), sur stroma humain ou murin, pré-colony forming cells
(pré-CFU), high proliferative potential cells (HPP), human
competitive repopulating unit (CRU). Ce dernier test de repopulation
compétitive est basé sur la technique suivante : des progéniteurs
hématopoïétiques marqués sont mélangés
à différentes dilutions avec une population de progéniteurs
non marqués syngéniques. Ces cellules sont injectées
à des animaux receveurs irradiés de façon sublétale.
En comptant le nombre de receveurs ayant une reconstitution lympho-myéloïde
marquée, on peut calculer, en appliquant la loi de Poisson, le
nombre de competitive repopulating units (CRU). Ces CRU, comme
les LTCIC, présentent une grande hétérogénéité
phénotypique. Il est possible de les expandre en utilisant des
facteurs de croissance (C. Eaves). Tous ces tests fonctionnels, à
l'exception des CFC, sont difficilement transférables d'un laboratoire
à l'autre, aux États-Unis comme en Europe. Par ailleurs,
leur réalisation est trop longue pour qu'ils puissent être
utilisés en routine. Le même commentaire a été
fait en ce qui concerne les analyses phénotypiques complexes des
sous-populations de progéniteurs CD34+.
Mobilisation
des cellules souches hématopoïétiques vers le sang
périphérique
Molécules intervenant dans l'adhésion
et dans la mobilité des progéniteurs
- VLA4, VLA5, c-kit
P. Simmons et T. Papayannopoulou ont précisé
le rôle majeur des molécules VLA4 et VLA5 dans la mobilisation
et le homing des progéniteurs hématopoïétiques.
P. Simmons (Adélaïde) a montré que l'on pouvait mettre
en évidence une diminution de l'expression de certaines molécules
d'adhésion sur les cellules CD34+ mobilisées
dans le sang périphérique par rapport à leurs équivalents
médullaires, en particulier de VLA4 et VLA5, mais aussi du récepteur
c-kit au stem cell factor (SCF). L'amplitude de ces variations
d'expression varie selon les protocoles de mobilisation utilisés.
À l'inverse, l'expression des molécules VLA2 et de certaines
b-intégrines n'est pas modifiée.
Il a, par ailleurs, été démontré que chez
les souris déficientes en c-kit (knock-out) il n'y a pas
de mobilisation des progéniteurs hématopoïétiques
dans le sang périphérique sous l'action du G-CSF et que
le SCF diminue l'adhésion des progéniteurs CD34+
aux HUVEC (human umbilical vessel endothelial cells). P. Simmons
a retrouvé une corrélation entre la diminution de l'expression
du c-kit et la quantité des progéniteurs CD34+
recueillis après stimulation par G-CSF et SCF.
Le système VLA4/VCAM1 semble jouer un rôle important dans
le homing. Des souris traitées par un anticorps anti-VLA4
ou anti-VCAM 1 présentent une diminution d'environ 50 % des capacités
de homing vers la moelle osseuse des cellules souches réinjectées.
Inversement, ces mêmes anticorps augmentent la mobilisation des
cellules souches dans le sang périphérique. Cette observation
n'est pas retrouvée pour VLA5.
P. Simmons et J.P. Levesque ont proposé un modèle. Les
facteurs de croissance tels que le G-CSF ou le SCF, mais aussi l'IL-3,
augmentent de façon transitoire l'adhésion des progéniteurs
CD34+ à la fibronectine. Cette augmentation de l'adhésion
se fait par l'intermédiaire des molécules VLA4 et VLA5.
Cette liaison des cellules CD34+ à la fibronectine provoquerait
leur migration vers les parois vasculaires. Parallèlement, le G-CSF
par son action ostéoclastogénique augmenterait la quantité
de calcium extracellulaire. Sous l'action du calcium, une réduction
de l'affinité pour la fibronectine (plus que de l'expression) des
molécules VLA4 et VLA5 se produirait alors, entraînant une
diminution de l'adhésion des progéniteurs à la fibronectine.
Ces différents mécanismes favoriseraient le passage des
cellules souches dans le flux sanguin.
- Interleukine-8
W. Fibbe, de l'université de Leiden,
a résumé ses travaux sur l'interleukine-8 (IL-8). L'IL-8
stimule l'angiogenèse, le chimiotactisme et l'exsudation plasmatique.
Chez l'animal, l'IL-8 entraîne une mobilisation rapide des progéniteurs
dans le sang périphérique. La cinétique de mobilisation
comporte deux temps : 5 minutes après l'injection survient une
profonde neutropénie ; puis, 15 à 30 minutes plus tard,
une circulation importante de progéniteurs est observée
(test CFU). L'IL-8 agirait par l'intermédiaire de métalloprotéinases.
L'une d'entre elles semble particulièrement importante, la gélatinase
B. W. Fibbe a démontré que le taux de gélatinase
B suivait de façon parallèle la mobilisation des progéniteurs
CD34+ dans le sang périphérique.
- FLT3 ligand
Le ligand de FLT3 (FLT3-L) semble posséder
des propriétés intéressantes dans la régulation
de la mobilisation des progéniteurs hématopoïétiques.
D. Williams (Immunex) a présenté une revue générale
sur cette molécule. Le gène codant pour FLT3-L est situé
sur le chromosome 19 (19q13.3) chez l'homme et le chromosome 7 chez la
souris. Les souris déficientes en FLT3-L n'ont pas de phénotype
particulier. Le récepteur du FLT3-L a une expression limitée
aux cellules CD34+. Enfin, la concentration plasmatique du
FLT3-L, contrairement à celle du SCF, est fortement augmentée
dans les aplasies médullaires. De nombreux travaux récents,
présentés au cours du dernier congrès de l'American
Society of Hematology (ASH 95), ont montré que l'injection de FLT3-L
entraîne une augmentation transitoire des globules blancs, mais
aussi des progéniteurs, et qu'une synergie d'action existe avec
le G-CSF et le GM-CSF. Signalons enfin que le FLT3-L stimule de préférence
la mobilisation des cellules « primitives » CD34+/38-.
D. Williams a également mentionné l'intérêt
du FLT3-L (en combinaison avec le GM-CSF, l'IL-4 et le TNFalpha) dans
l'obtention in vitro de cellules dendritiques à partir de
progéniteurs CD34+. Un effet anti-tumoral du FLT3-L
a été démontré chez la souris et des rejets
de tumeur ont été décrits après traitement
par FLT3-L. Le rôle du FLT3-L dans l'expansion des cellules dendritiques
avait déjà été signalé par S. Siena
(Milan).
Comment amplifier la mobilisation et la collection
des cellules souches du sang périphérique ?
L'augmentation de la quantité de progéniteurs collectés
présenterait l'intérêt : 1) de diminuer le nombre
de cytaphérèses ; 2) d'améliorer les rendements de
recueil chez les patients lourdement prétraités (nombreux
cycles de chimiothérapie, radiothérapie) ; 3) d'augmenter
la quantité des progéniteurs CD34+ recueillis
en vue de manipulations ex vivo (sélection, expansion, transfert
de gène).
Dans ce but, AMGEN a présenté deux études testant
l'association de SCF et de G-CSF. La plus intéressante a été
effectuée chez des patientes suivies pour cancer du sein. Il s'agissait
d'une étude de dose-réponse, faisant varier les doses de
SCF de 5 à 25 mug/kg. Cent vingt-six patientes ont été
randomisées. La dose optimale de SCF, en association avec 10 mug/kg/jour
de G-CSF, est de 20 mug/kg/jour pendant sept jours. Cette association
augmente le nombre de progéniteurs collectés de deux à
quatre fois. Pour diminuer sa toxicité, le SCF a toujours été
injecté avec un antihistaminique (80 % des patientes ont néanmoins
eu des réactions aux sites d'injection). Il n'a pas été
précisé s'il existait des différences fonctionnelles
ou phénotypiques entre les progéniteurs recueillis par G-CSF
seul et par G-CSF + SCF.
Existe-t-il un contrôle génétique
de la mobilisation des progéniteurs hématopoïétiques
du sang périphérique ?
L'une des présentations les plus intéressantes du symposium
fut celle de A. Roberts (Melbourne) sur la recherche de gènes régulant
la mobilisation des progéniteurs du sang périphérique
induite par le G-CSF. Chez les sujets sains (en particulier les donneurs
allogéniques), nous savons qu'il existe des variations individuelles
majeures dans l'efficacité de cette mobilisation. Chez environ
10 % des donneurs, il n'y a pas de mobilisation suffisante des progéniteurs.
A. Roberts a décidé d'explorer ces variations de mobilisation
dans un modèle murin. Dans un premier temps, il observe que le
niveau de mobilisation est variable selon les souches de souris : les
souris DBA2 « mobilisent » mieux que les souris SJL, qui, elles-mêmes,
répondent mieux que les souris B6. En utilisant ensuite des croisements
F1 entre non-répondeurs et répondeurs intermédiaires,
puis des croisements F2 entre différents F1, il peut mettre en
évidence par SSLP (single sequence length polymorphism)
des régions qui seraient impliquées fortement dans la réponse
au G-CSF. Quatre régions semblent essentielles, situées
respectivement sur les chromosomes 3 et chromosomes 9. Ces travaux, bien
que préliminaires, sont très intéressants car ils
pourraient permettre d'isoler les gènes régulant la mobilisation
des cellules souches et peut-être de mieux comprendre les mécanismes
de celle-ci.
Contamination
des produits de cytaphérèse par les cellules tumorales
Ce sujet a fait l'objet de nombreuses communications. Dans le domaine
des tumeurs solides, nous retiendrons les deux présentations d'A.
Ross et de T. Moss. Ces deux intervenants ont fait le point sur la contamination
tumorale des produits de cytaphérèse dans les cancers, en
particulier les cancers du sein et les neuroblastomes. Comme cela avait
déjà été observé, la contamination
par les cellules tumorales des produits de cytaphérèse peut
être observée, sans qu'il y ait d'envahissement médullaire
détectable. Dans le cancer du sein, plus de 2 020 leucaphérèses
ont été analysées chez 800 patientes présentant
des cancers de stade II, III ou IV : 168 (8 %) contenaient des cellules
tumorales, ce qui correspond à 118 patientes (13 %). Ce pourcentage
de contamination tumorale est fonction du stade du cancer, pouvant aller
jusqu'à 22 % dans les stades IV. Il est aussi fonction du moment
où sont réalisées les cytaphérèses.
Dans le neuroblastome, 172 leucaphérèses ont été
analysées chez 59 patients : 11 % étaient contaminées
(20 % des patients). La contamination tumorale étant d'autant plus
importante que le patient est prélevé après peu de
cycles de chimiothérapie.
Un travail publié par Brugger dans Blood en 1994 avait
montré, dans les cancers du poumon et de l'ovaire, que la mobilisation
des progéniteurs dans le sang périphérique pouvait
être associée à une augmentation de la circulation
des cellules tumorales. Cependant, il n'est toujours pas certain que l'emploi
d'un facteur de croissance (type G-CSF) favorise la re-circulation des
cellules tumorales. Une étude comparative entre différents
régimes de mobilisation (chimiothérapie + G-CSF contre G-CSF
seul, par exemple) est nécessaire.
A. Ross a rappelé que, dans l'expérience de E.J. Shpall
(Denver), la contamination tumorale des progéniteurs réinjectés
pourrait être un paramètre influençant la survie et
même être un facteur pronostique indépendant. Lors
de l'ASH 95, E.J. Shpall a en effet rapporté son expérience
de sélection positive CD34+ dans le cancer du sein :
la survie sans maladie et même la survie globale étaient
supérieures chez les patientes dont le greffon avait été
correctement purgé par la sélection positive des progéniteurs
CD34+. Cependant, cette étude ne portait que sur peu
de patientes et une étude plus vaste semble nécessaire.
A. Ross a rappelé que, dans son expérience, les cellules
tumorales résiduelles conservaient leur clonogénicité.
Dans les hémopathies, R. Owen (Leeds) a analysé la contamination
tumorale chez 57 patients (148 leucaphérèses) atteints de
myélome (n = 30), lymphome folliculaire (n = 13), leucémie
aiguë lymphoblastique (n = 7), leucémie aiguë myéloblastique
(n = 4) et leucémie lymphoïde chronique (n = 3). Les produits
de cytaphérèse étaient contaminés chez 33
% des patients ayant un myélome et chez 54 % des patients ayant
un lymphome folliculaire. Après sélection positive des progéniteurs
CD34+, la contamination tumorale persistait dans quatre des
neuf cas informatifs étudiés, démontrant un effet
purge incomplet.
Techniques
de sélection et de purge
Les différentes compagnies possédant un système
de sélection ont présenté leurs résultats
:
* A. Tsukamoto a présenté la méthodologie développée
par Systemix qui utilise le tri cellulaire et qui a pour but de sélectionner
une sous-population de progéniteurs CD34+, Thy1+,
lin-. Il a été montré, chez les sujets
atteints de myélome, que l'on ne pouvait mettre en évidence
de contamination tumorale dans cette sous-population. Neuf patients atteints
de myélome ont été inclus dans une étude de
phase II (double greffe : Melphalan® 200 mg/m2
puis Melphalan® 140 mg/m2) et des résultats
ont été présentés pour trois patients. La
pureté finale en cellules de ce phénotype varie de 81 à
96 %. Le délai de reconstitution granulocytaire n'est que de seize
jours, ce qui est surprenant pour une population reconnue comme relativement
« peu différenciée ».
* J. Bender a présenté le système Isolex 300 i (Baxter),
qui utilise une méthode immunomagnétique associée
à un système de libération des cellules par un peptide
compétiteur. Ce système permet d'obtenir une très
bonne pureté en progéniteurs CD34+ (médiane
86 %), avec un rendement de 55 %.
* A. Dynal a présenté son système de sélection,
basé sur une méthode immunomagnétique utilisant le
Detachbeads (une solution d'anticorps polyclonal ayant une affinité
particulière pour le fragment FAB de l'anticorps 561 anti-CD34).
* I. Mac Niece a présenté les données préliminaires
du système Amcell Miltenyi. Ce système est une méthode
d'immunosélection utilisant des microbilles fer-dextran liées
à un anticorps monoclonal dirigé soit contre l'antigène
CD34 soit contre des cellules T. Cette méthode semble intéressante
avec une pureté de 95 % et un rendement important de 78 %. Le complexe
anticorps-billes reste présent à la surface des cellules
sélectionnées réinjectées in vivo.
* S. Heimfeld a présenté le système développé
par CellPro, système d'immunosélection par immunoabsorption.
Actuellement, 2 500 patients ont été traités dans
le monde, dont plus de 1 500 avec des cellules souches périphériques,
dans plus de 200 centres. La reconstitution hématopoïétique,
tant myéloïde que lymphoïde, a toujours été
satisfaisante.
* Enfin, J. Lebrowski a présenté la stratégie d'immunothérapie
cellulaire développée par AIS, qui consiste, après
déplétion par un cocktail d'anticorps et culture en présence
d'IL4 + GM-CSF, à obtenir des cellules dendritiques à partir
d'un prélèvement de cellules souches du sang périphérique.
Cette population enrichie en cellules dendritiques est utilisée
comme cellules présentant l'antigène après addition
de peptides, en particulier de peptides de mélanome type Mart 1.
La co-culture de ces cellules présentant l'antigène et de
cellules T CD8+ purifiées permet d'obtenir des clones
à activité cytotoxique spécifique contre les cellules
de mélanome. Les cellules sont capables de lyser des mélanocytes
HLA-A2 Mart 1+ et les cellules tumorales autologues, mais n'ont
pas d'activité cytotoxique allogénique.
Au total, ces systèmes de sélection sont associés
à une déplétion en cellules tumorales ou en cellules
T de l'ordre de 3 à
5 log. Aucune étude comparant ces différents systèmes
n'est actuellement disponible. Cependant, les produits restent encore
contaminés en cellules tumorales résiduelles. C'est pourquoi
certains auteurs et compagnies préconisent d'adjoindre à
cette période de sélection positive une étape de
sélection négative. Il faut enfin insister sur le fait qu'il
n'existe actuellement aucune démonstration formelle par une étude
randomisée de l'effet bénéfique de la purge sur la
survie sans maladie ou sur la survie globale.
Expansion
ex vivo
des progéniteurs hématopoïétiques
- Dans ce domaine, les mêmes questions sont toujours posées
:
- Dans quel(s) but(s) expandre les progéniteurs ex vivo
?
- * pour diminuer la durée de la période d'aplasie ?
- * pour réduire le nombre des cytaphérèses ?
- * pour réduire la contamination tumorale ?
- * pour obtenir un greffon suffisant à partir du sang de cordon
?
- Quelle est la meilleure combinaison de cytokines ?
-
- Est-il nécessaire de sélectionner préalablement
les progéniteurs CD34+ ?
- Doit-on utiliser un système statique (poches perméables
au gaz) ou un système dynamique bioréacteur avec un stroma
?
- L'équipe du MD Anderson a rappelé son expérience
avec le système Aastrom déjà présenté
à l'ASH 95. Ce système utilise un bioréacteur.
Dix patients ont été inclus dans l'étude. Les cellules
mononucléées ont été mises en culture dans
le bioréacteur avec une perfusion continue de PIXY-321 (molécule
hybride IL-3/GM-CSF), d'érythropoïétine et d'hydrocortisone
pendant douze jours. Une expansion (3 fois en nombre de cellules mononucléées
; 4,6 fois en CFU-GM ; 1,3 fois en LTCIC) a été obtenue.
Ces cellules ont été réinjectées avec un
greffon médullaire après un conditionnement myéloablatif.
Il semble exister un petit effet sur la reconstitution plaquettaire
en comparaison avec un groupe historique de 29 patients.
-
- Baxter et Amcell utilisent un système statique avec des poches
perméables et différentes combinaisons de cytokines, PIXY-321
pour Baxter, SCF + MGDF + G-CSF pour Amgen.
- CellPro a présenté des données intéressantes
utilisant une combinaison de différents récepteurs agonistes
des facteurs de croissance (les synthokines). L'expansion des cellules
sélectionnées CD34+ avec cette combinaison
semble au moins équivalente à celle obtenue avec l'association
SCF + IL-3 + IL-6 + G-CSF.
-
- Au total, ce symposium a permis de faire le point sur tous les aspects
de l'utilisation des cellules souches du sang périphérique.
Il semble maintenant acquis que ces cellules souches possèdent
des capacités de reconstitution identiques à celles des
cellules souches médullaires. Les trois sujets de développement
futur restent :
- 1) les techniques de purge et le rôle des cellules tumorales
résiduelles sur la survie sans maladie ;
- 2) les techniques d'expansion ex vivo, dans le but d'obtenir
une plus grande quantité de progéniteurs immatures, mais
peut-être aussi des cellules plus différenciées
qui peuvent également participer à la réduction
de la durée d'aplasie ;
- 3) enfin, l'emploi de ces cellules souches en thérapie génique
et en immunothérapie *
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