Les aspects cellulaires de la distribution et de la production de l'hémoglobine fœtale

ARTICLE

La production de l'hémoglobine foetale (HbF), majoritaire à la naissance, diminue rapidement durant la première année de vie pour ne persister qu'à l'état de traces chez l'adulte [1, 2]. À l'échelon cellulaire, cette production est limitée à une population restreinte de globules rouges [3, 4], les cellules F dérivées des réticulocytes F [5, 6] représentant de 1 à 7 % des globules rouges chez le sujet normal [7]. Ce pourcentage est constant pour un même individu et semble génétiquement déterminé [8]. De nombreuses recherches comportant des études de génétique familiale ont porté ces dernières années sur la localisation des déterminants impliqués dans la production de ces cellules [9]. Des résultats récents ont permis d'avancer l'hypothèse de déterminants liés au locus ß globine situé sur le chromosome 11 [10, 11] ou indépendants de ce locus, impliquant le chromosome X [12-14] et le chromosome 6 [15, 16].
Chez l'adulte, la distribution de l'HbF est hétérogène au sein des cellules F : elle est en moyenne de 4 à 5 pg par cellule, mais peut atteindre jusqu'à 25 % de l'hémoglobine totale contenue dans le globule rouge [6]. Il a été montré que la quantité d'HbF par cellule F est sans doute associée à des polymorphismes du locus ß globine, agissant par l'intermédiaire de facteurs transactivateurs [2].
Des variations de production de l'HbF surviennent dans de nombreuses circonstances physiologiques et pathologique

Tableau I

Circonstances s'accompagnant d'une augmentation de production de l'HbF

1. Génétiques

* Maladies de l'hémoglobine
- Syndromes drépanocytaires
- Thalassémies (ß et *ß)
- Hémoglobines instables
- Persistances héréditaires de l'HbF (formes pan- et hétérocellulaires)
* Maladie de Blackfan-Diamond
* Maladie de Fanconi

2. Acquises

* Érythropoïèse accrue
- Hémolyses aiguës
- Hémorragies
- Début de traitement des carences martiales
- Grossesse
* Sortie d'aplasie
- Dans les suites de greffe de moelle
- Après chimiothérapie
- Récupération d'une érythroblastopénie transitoire
* Hémopathies
- Insuffisance médullaire globale
- Leucémie myéloïde chronique
- Syndrome myélomonocytaire de l'enfant
- Syndromes préleucémiques
* Nouveau-né de mère diabétique

[17], notamment en cas de stimulation érythropoïétique [18-21]. Elles peuvent être secondaires à un accroissement du nombre de cellules F et/ou à une augmentation de la quantité d'HbF dans les cellules F qui sont des facteurs génétiquement déterminés. Dans les hémoglobinopathies majeures, où existe une composante hémolytique, le taux d'HbF dépend également d'un troisième facteur de survie sélective des cellules F par rapport aux cellules non-F. Dans la drépanocytose [5] notamment, l'effet « protecteur » de l'HbF vis-à-vis de la polymérisation de l'hémoglobine S est responsable de cette survie préférentielle des cellules F, ce qui entraîne un enrichissement progressif de ces cellules. Un phénomène comparable existe dans les ß-thalassémies [22] où un excès de chaînes gamma est le principal responsable de l'érythropoïèse inefficace et de la destruction prématurée des cellules. Une quantité suffisante de chaînes gamma, se combinant aux chaînes alpha pour produire de l'HbF, assure la protection des cellules qui en contiennent. Explorer les variations de production de l'HbF par un simple dosage dans un hémolysat n'élucide pas le mécanisme en cause, ce qui justifie les techniques de mise en évidence de l'HbF dans les hématies. Elles permettent de mesurer le nombre de cellules F et/ou de réticulocytes F, ce dernier paramètre étant un meilleur reflet de la production médullaire quand existe une composante hémolytique ; elles permettent aussi de calculer, ou mieux de mesurer, la quantité d'HbF dans ces cellules.
Les techniques décrites sont différentes par leur principe, leur sensibilité et leur facilité de mise en oeuvre.

Tableau II

Principales techniques de détermination des cellules F et des réticulocytes F

1. Techniques sur lame

* Test de Kleihauer
* Immunoprécipitation péricellulaire
- Technique de Katsura modifiée par Dover et Boyer
* Immunofluorescence
- Technique de Wood (cellules F)
- Techniques de double marquage (cellules F et réticulocytes F)

2. Techniques de cytométrie en flux

3. Technique d'analyse d'image

Techniques sur lame

* La technique d'élution acide de Kleihauer est la plus ancienne [23]. La mise en évidence de l'HbF dans les globules rouges repose sur sa résistance à l'élution à pH acide. Cette technique, simple à réaliser, est couramment utilisée dans de nombreux laboratoires. Il est possible de trouver les réactifs dans le commerce (kit Fetal Hemoglobin, Sigma). On peut reprocher à cette méthode son manque de sensibilité, elle ne permet pas en effet de détecter des quantités d'HbF inférieures à 5 pg par cellule. Elle reste cependant très utile dans les situations où il existe un mélange d'hématies foetales et adultes, ce qui est le cas des transfusions foetomaternelles. Dans ce contexte, le manque de sensibilité n'est pas gênant puisque les hématies foetales que l'on cherche à mettre en évidence contiennent des quantités élevées d'HbF.

* Les autres techniques sont immunologiques ; la mise en évidence de l'HbF fait suite à une réaction avec des anticorps (Ac) anti-HbF polyclonaux ou monoclonaux.

- Dans la technique d'immunoprécipitation péricellulaire de Katsura modifiée par Dover et Boyer [24], les globules rouges sont mis au contact d'un gel d'agarose contenant des Ac anti-HbF de type précipitant. Après hémolyse, un précipité se forme dans la gélose tout autour des cellules contenant de l'HbF. L'addition de New Methylene Blue dans le milieu de réaction permet la détermination simultanée des réticulocytes F et des cellules F. La lecture se fait au microscope à fond noir. Les cellules contenant de l'HbF apparaissent entourées d'un précipité dont l'intensité et le diamètre sont fonction de la quantité d'HbF qu'elles contiennent. Le réticulum des réticulocytes apparaît coloré en orange. En pratique, cette technique est utilisée pour la détermination des réticulocytes F qui sont exprimés en pourcentage par rapport à l'ensemble des réticulocytes. La méthode est fiable et reproductible, mais exige un lecteur bien entraîné. Le seuil de détection de l'HbF est de l'ordre de 2 à 3 pg par cellule. La principale difficulté réside dans l'obtention chez le lapin d'anticorps polyclonaux précipitants, du fait de la faible antigénicité de l'HbF. Les anticorps commerciaux sont inutilisables dans cette technique, car leur concentration est trop faible, par ailleurs l'affinité et la spécificité ne sont pas reproductibles d'un lot à l'autre.

- La méthode d'immunofluorescence indirecte de Wood [7] est la technique de référence pour la détermination des cellules F. Après réalisation et fixation d'un frottis sanguin, les anticorps anti-HbF sont mis au contact des globules rouges. L'identification et la quantification des cellules F se font par reconnaissance des complexes antigène-anticorps par un anti-antiHbF marqué à la fluorescéine. La lecture est faite au microscope à fluorescence (figures 1 et 2). Les cellules F sont colorées en vert ; leur fluorescence est fonction de la quantité d'HbF qu'elles contiennent ; les cellules non-F sont noires, non colorées. La technique est sensible, le seuil de détection a été estimé à moins de 1 pg d'HbF par cellule, mais cette sensibilité même peut être un inconvénient car la fluorescence maximale est atteinte pour des taux relativement bas d'HbF par cellule. Lors de la lecture, la principale difficulté réside dans la reconnaissance des cellules faiblement fluorescentes, contenant peu d'HbF. On peut être gêné par un fond légèrement fluorescent. Les anticorps anti-HbF utilisés peuvent être de type monoclonal ou polyclonal.

- D'autres techniques voisines, d'immunofluorescence directe ou indirecte, ont été mises au point [19, 25, 26]. Les méthodes utilisant des anticorps monoclonaux sont les plus répandues car ce type d'anticorps est maintenant disponible dans le commerce (Isolab, Bioatlantic, Accurate Chemical and Scientific Corporation).

Au Laboratoire d'hématologie de l'hôpital Tenon, nous avons mis au point une technique d'immunofluorescence indirecte qui permet la détermination simultanée des cellules F et des réticulocytes F [25]. La première étape consiste à réaliser un frottis fin de sang coloré au New Methylene Blue. Les globules rouges sont séchés et fixés cinq minutes par immersion dans un mélange acétone-méthanol (9 volumes/ 1 volume) à température ambiante. Une solution de travail (150 µl) contenant l'anticorps monoclonal de souris reconnaissant la chaîne * de l'HbF, du tampon PBS (phosphate de sodium 10 mM, Nacl 150 mM, pH : 7,4) et du thiazole orange (solution stock alcoolique de thiazole orange à 0,4 µmol/l diluée au 1/10^e) est déposée à la surface du frottis (incubation deux heures à 37°). Un anticorps de lapin anti-souris F(ab')2 marqué à la fluorescéine est déposé sur le frottis (incubation deux heures à 37°). Les frottis sont lus ensuite au microscope à fluorescence. Quatre types de cellules sont identifiés (figures 3 et 4) : les réticulocytes F sont colorés en vert avec un réticulum orange, les réticulocytes non-F sont noirs avec un réticulum orange, les cellules F sont vertes et les cellules non-F sont noires. Les résultats sont exprimés, en pourcentage de cellules F par rapport à l'ensemble des globules rouges et en pourcentage de réticulocytes F par rapport à l'ensemble des réticulocytes. C'est une technique de principe simple, qui donne de bons résultats si le protocole est strictement suivi, mais qui n'est pas applicable à de grandes séries de prélèvements. Sa sensibilité est comparable à celle de la technique de Wood mais présente les mêmes difficultés de lecture.

Toutes ces techniques exigent que les cellules soient traitées dans les quelques jours (~ 5) suivant le prélèvement.

Techniques de cytométrie en flux

Plusieurs techniques ont été décrites pour la mesure des cellules F [26-28]. Elles comportent toutes une étape de fixation des globules rouges, une étape de perméabilisation des membranes qui permet à l'anticorps d'accéder à l'HbF intraérythrocytaire, et un marquage des cellules F par un anticorps monoclonal anti-HbF. Dans la seule méthode actuellement commercialisée (kit pour l'utilisation en cytométrie en flux, Bioatlantic), l'agent de fixation est le formaldéhyde et la perméabilisation se fait avec du SDS (sodium dodécylsulfate), détergent anionique. Après plusieurs lavages, on ajoute aux globules rouges ainsi traités un anticorps monoclonal de souris anti-HbF de spécificité anti-chaîne *, puis un anticorps de lapin anti-souris F(ab') 2 marqué à la fluorescéine. Les cellules marquées sont lavées et remises en suspension dans un tampon phosphate contenant du triton X-100 et évaluées au cytomètre en flux. Le résultat est lu sous forme d'un histogramme de fluorescence, l'appareil exprime un pourcentage de cellules F et une valeur moyenne de la fluorescence (figure 5). Il s'agit d'une technique un peu longue puisque, après fixation (une nuit à température ambiante), la préparation des cellules demande un minimum de quatre heures, mais elle est très sensible, reproductible, et permet le décompte rapide d'un grand nombre de cellules; son avantage, par comparaison aux techniques sur lame, est une lecture automatisée non subjective.

Il n'a pas été possible d'appliquer, jusqu'à présent, la cytométrie en flux à la détermination des réticulocytes F. Cependant une équipe de recherche américaine a mis au point une technique qui permet la détection de l'HbF dans la population des réticulocytes les plus jeunes, exprimant le récepteur à la transferrine ou CD71 [29].

Technique d'analyse d'image

Très récemment a été rapportée une technique d'analyse d'image [30] qui semble prometteuse. Elle autorise, après marquage des cellules F par immunofluorescence, la quantification précise de l'HbF dans chaque cellule et donc l'étude de sa distribution au sein de cette population. L'incubation du sang, préalablement à la réalisation du frottis, avec de l'acridine orange permet l'identification simultanée des réticulocytes F [31]. Les résultats, exprimés sous forme d'un histogramme de fluorescence, autorisent la comparaison des profils de distribution chez des patients dont les taux d'HbF sont voisins. Cette méthode serait une réelle avancée technologique par la mesure individuelle de l'HbF dans chaque cellule, alors que les techniques précédemment décrites ne permettent qu'un calcul de quantité moyenne d'HbF par cellule à partir du pourcentage de cellules F, du taux d'HbF de l'hémolysat et des données de la numération.

Applications de ces techniques et perspectives

En pratique, le choix de la technique dépendra du contexte et de la thématique à laquelle on désirera l'appliquer. Le test de Kleihauer, bien que peu sensible, garde toutes ses indications dans les laboratoires d'hématologie pour la détection des hématies foetales en cas de suspicion de transfusion foetomaternelle. Les autres techniques ont été très employées ces dernières années dans de nombreux travaux de recherche, portant notamment sur le contrôle génétique de la production de l'HbF [8-16, 32]. Ces méthodes sont largement utilisées dans les maladies de l'hémoglobine, en particulier chez les patients drépanocytaires [17, 25] traités par les modificateurs pharmacologiques de l'HbF tels que l'hydroxyurée. La mesure des cellules F et des réticulocytes F sert à évaluer la réponse au traitement [32-36]. Ces méthodes sont aussi utilisées dans les thalassémies [17, 26, 37] et les persistances héréditaires de l'HbF [17, 32]. Elles ont valeur diagnostique, dans ce dernier cas, en discriminant les formes pan- et hétérocellulaires. Elles peuvent avoir une valeur pronostique dans les hémoglobinopathies où existe une composante hémolytique. Dans l'interprétation du résultat, il faut garder à l'esprit qu'une augmentation de l'HbF dans les cellules F peut être interprétée comme une augmentation du pourcentage de cellules F, simplement par franchissement du seuil de détection [10]. Elles ne sont encore que peu appliquées à d'autres pathologies (tableau I). Mais on peut prévoir un vaste champ d'application, et il serait souhaitable qu'elles fassent partie de l'exploration des augmentations discrètes de l'HbF n'ayant pas d'explication évidente*

CONCLUSION

Remerciements

Nous tenons à remercier D. Labie pour ses conseils lors de la rédaction de ce manuscrit et G. Flandrin pour la réalisation des figures.
Ce travail a bénéficié d'un contrat de recherche du CHU Saint-Antoine (Paris VI).

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