Stratégies des thérapies géniques

ARTICLE

Trois maladies serviront de modèle et de fil conducteur : les hémoglobinopathies, le déficit en adénosine désaminase et la mucoviscidose, pour des raisons historiques et les enseignements qu'elles ont apportés.

Les maladies génétiques

Les hémoglobinopathies

 

Les hémoglobinopathies constituent les archétypes des trois principaux défauts géniques : 1) déficit ou absence d'expression d'un gène (alpha - ou bêta -thalassémie) ; 2) production normale d'une protéine anormale (hémoglobine S responsable de la drépanocytose) ; 3) dérépression de gènes (persistances héréditaires de l'hémoglobine foetale). Les lésions moléculaires des hémoglobinopathies affectent les différentes étapes de l'expression d'un gène, de la transcription jusqu'à la protéine.

La logique voulait que le premier gène humain cloné, celui de la globine, soit le premier utilisé dans un but thérapeutique. Beaucoup d'éléments étaient de bon augure. Le gène bêta de globine est de petite taille (2 kb). Ses séquences régulatrices ont été bien définies, grâce aux souris transgéniques, exprimant le transgène de manière élevée et spécifique dans la lignée rouge, en fin de différenciation [1]. La cible du transfert de gène, la cellule souche hématopoïétique, peut être prélevée, génétiquement modifiée ex vivo, puis greffée. Des modèles animaux naturels et transgéniques permettent de tester in vivo cette nouvelle thérapeutique [2]. Enfin, la bonne connaissance de la physiopathologie cellulaire de ces maladies permet de développer des stratégies indirectes de la thérapie génique : activation d'un gène de compensation ou réduction des conséquences délétères du gène anormal et amélioration du phénotype.

 

Thérapie génique directe

 

La thérapie génique directe par addition d'un gène (dont la mutation est responsable de la maladie) débute en 1980 par l'échec d'un coup de poker. Ajouter de l'ADN de globine bêta à des prélèvements de moelle osseuse de deux patients bêta -thalassémiques et réinjecter le tout en espérant guérir la maladie était une idée simple. Elle valut à son auteur d'être condamné pour conduite non éthique. Après ce faux départ, le succès sembla à portée de main en 1986-1988, grâce au cheval de Troie cellulaire que constitue le vecteur rétroviral porteur du gène bêta de globine permettant l'expression élevée de ce gène transferé dans des cellules MEL (Murine Erythro Leukemia) en culture [3]. Simultanément, l'efficacité thérapeutique fut prouvée in vivo grâce au transfert du gène humain dans l'oeuf fécondé de la souris. L'expression de ce gène était suffisante pour guérir définitivement la souris thalassémique [4]. La thérapie génique « germinale » ainsi réussie, le succès de la thérapie génique « somatique » paraissait proche.

Malgré cet ensemble très favorable, les hémoglobinopathies quittèrent le haut de la liste des espoirs de la thérapie génique, en raison des maigres résultats obtenus in vivo chez la souris. L'expression du transgène « somatique » de globine bêta restait modeste et limitée à un faible pourcentage de cellules, décroissant avec le temps. De nouvelles études fondamentales furent entreprises afin de surmonter trois types d'obstacles.

 

* Le vecteur viral

 

Le rétrovirus murin de Moloney (MoMLV) et ses dérivés constituent aujourd'hui les vecteurs de gènes les plus utilisés. Ce type de vecteur transfère efficacement les gènes de globine dans les cellules hématopoïétiques in vitro. Cependant, certaines séquences réduisent l'expression du gène bêta [5] ou peuvent induire une répression secondaire du transgène. En outre, les vecteurs rétroviraux s'avérèrent peu efficaces pour intégrer le transgène de globine dans les cellules souches humaines, testées in vivo, par greffe des souris immunodéficientes. Enfin, la faible capacité d'accueil du vecteur rétroviral, inférieure à 10 kb, impose de découper les séquences régulatrices de la région contrôle du locus (LCR bêta ) et de les accoler au promoteur du gène bêta , très peu exprimé en leur absence. Les études en cours ont pour but d'améliorer le vecteur et le gène d'intérêt, en particulier d'augmenter le titre viral [6], l'efficacité de transfert dans les cellules souches humaines à longue durée de repopulation in vivo (LTRA), l'expression du gène porté par un vecteur rétroviral, ainsi que la stabilité des séquences intégrées [7, 8]. L'addition de cellules stromales et de cytokines aux cellules humaines CD34⁺ permet d'obtenir une transduction rétrovirale stable dans 25 % des cellules souches humaines à longue durée de repopulation in vivo (LTRA) [9].

Les vecteurs dérivés de l'Adeno-Associated Virus (AAV), de la famille des parvovirus, sont en cours de développement pour le transfert des gènes de globine [10]. Ils peuvent infecter les cellules non en cycle, en particulier les cellules souches humaines et être intégrés dans un site préférentiel « neutre » du chromosome 19 dans différentes lignées cellulaires [11].

Si les bons résultats in vivo se font encore attendre, on voit poindre le bout du tunnel en ce qui concerne les vecteurs viraux proprement dits et la transduction de la « bonne » cellule cible.

 

 

* Les cellules souches hématopoïétiques

 

Les cellules souches hématopoïétiques à longue durée de repopulation (LTRA) in vivo, qui peuvent être prélevées, sont une très faible proportion du capital humain. Pour réduire la dilution des cellules génétiquement modifiées ex vivo puis greffées, il faudrait envisager l'ablation des cellules souches du receveur, avant l'autogreffe, ce qui n'est pas souhaitable pour les hémoglobinopathies. L'alternative serait la multiplication ex vivo de ces cellules souches ou l'adjonction d'un gène leur donnant un avantage de sélection in vivo.

Un progrès important du transfert de gène aux cellules souches humaines (LTRA) vient d'être apporté par les modèles animaux chimériques qui permettent d'étudier leur devenir à long terme et d'évaluer l'efficacité de la transduction et de l'expression du transgène dans les différentes lignées différenciées. Cette avancée capitale a montré que les résultats des cultures à « long terme », utilisées jusqu'à présent, n'étaient pas extrapolables aux cellules LTRA in vivo [12]. À partir des résultats obtenus in vivo, il devient donc possible d'améliorer les vecteurs, ainsi que l'enrichissement des cellules LTRA transduites, leur multiplication ex vivo ou in vivo, et finalement l'expression du transgène à long terme dans un modèle in vivo humanisé.

Les deux obstacles, vecteurs viraux encore imparfaits et cellules souches hématopoïétiques trop peu nombreuses ex vivo, sont communs à toutes les thérapies géniques visant la cellule souche hématopoïétique. La manière de les surmonter et les derniers résultats sont détaillés par
J.-L. Villeval et D. Duménil dans un article très récent de cette revue consacré au « transfert de gènes dans les cellules souches du tissu hématopoïétique » [13].

 

* Le niveau d'expression du transgène

 

Il s'agit également d'un problème d'intérêt général mais particulièrement épineux en ce qui concerne le gène de la globine, car c'est le gène le plus exprimé de l'organisme fournissant 23 % du poids sec du globule rouge par copie, sous forme de globine. L'ADN génomique bêta globine incluant son promoteur, spécifique de la lignée rouge, est indispensable. Les régions régulatrices de ce gène sont disséminées dans le promoteur, le gène et ses régions flanquantes, mais également à distance, en particulier dans la région de contrôle du locus (LCR : Locus Control Region) éloignée de 50 kb du gène bêta [1]. Cette région régulatrice étalée sur près de 20 kb permet l'expression du gène bêta à un niveau très élevé, spécifiquement dans la lignée érythroïde et, en général, quel que soit le site d'intégration du transgène bêta , chez la souris transgénique. Malheureusement, les vecteurs viraux utilisés jusqu'à présent ne peuvent héberger que des gènes de petite taille, ce qui nécessite de découper les sites de la LCR et d'accoler les fragments sélectionnés au transgène de globine [14]. En outre, ces séquences régulatrices ainsi que certaines parties du gène bêta placé en orientation inversée accroissent l'instabilité et les réarrangements du transgène (figure 1). La mutagenèse dirigée de ces sites permet de stabiliser le transgène sans réduire son expression in vitro dans la lignée MEL [7]. En outre, le transgène de globine n'est pas exprimé de manière égale selon le site d'intégration après transfert somatique [14]. Enfin, l'insertion d'un gène additionnel, marqueur membranaire ou gène de résistance à un agent toxique, permet la sélection des cellules transduites mais risque de réduire l'expression du transgène de globine bêta (15).

À l'heure actuelle, les trois obstacles, étroitement liés, sur lesquels bute la thérapie génique directe des hémoglobinopathies par addition du gène bêta , ne sont pas encore complètement franchis, malgré un effort soutenu depuis de nombreuses années. Par conséquent, il est impossible de prévoir quand cette approche sera un succès chez la souris bêta -thalassémique, a fortiori chez les patients. D'autres approches sont donc explorées.

 

* La recombinaison homologue

 

La méthode idéale pour corriger le gène gamma défectueux de la globine bêta et pour résoudre le problème de la régulation de ce gène est le remplacement de la séquence mutée par la séquence normale du même gène grâce à la recombinaison homologue [16]. Ainsi, un gène de globine bêta muté a pu être corrigé dans des lignées de cellules en culture [17]. Cependant, cette méthode ne pourra être appliquée que lorsque la multiplication suffisante des cellules cibles sera obtenue ex vivo, en raison de la fréquence très faible de la recombinaison au bon site et de la nécessité d'une sélection clonale des rares cellules corrigées.

 

Thérapies géniques indirectes de la bêta -thalassémie

En attendant le succès de la thérapie génique « directe » par addition ou remplacement du gène bêta , d'autres approches « indirectes » sont développées (tableau I).

 

* Correction d'un épissage anormal

 

Il devient possible de corriger la maturation anormale d'un ARN messager. C'est le cas de la mutation de l'intron I (IVS I 110) responsable d'une forme sévère de bêta -thalassémie, la plus fréquente en Méditerranée orientale. Cette mutation fait apparaître un site anormal d'épissage. Il est possible de restaurer complètement l'épissage normal grâce à un oligonucléotide antisens qui, masquant le site anormal d'épissage, permet au site normal d'être efficace à 100 % [18]. Il est théoriquement possible de transférer dans les cellules souches des patients un gène codant un ARN antisens ciblé sur la région IVS I 110 et mis sous contrôle du système d'expression de la globine, afin de synchroniser l'expression du gène thérapeutique et du gène bêta muté.

 

 

* Activation de gènes de compensation de la globine

 

Une autre approche en cours de développement est l'activation d'un gène de compensation normalement inactif comme un gène foetal ayant la même fonction qu'un gène « adulte ». C'est le cas des gènes gamma de l'hémoglobine foetale. Leur activation spontanée, génétiquement déterminée, est parfois observée. Elle atténue la sévérité des hémoglobinopathies. Leur activation pharmacologique par l'hydroxyurée réduit la sévérité clinique de la drépanocytose [19]. D'autres agents cytotoxiques ou modificateurs des gènes ou de la chromatine sont également capables d'activer in vivo les gènes gamma de l'hémoglobine foetale. Il en est de même de l'hormone érythropoïétine à doses pharmacologiques [20]. Dans le cadre de la thérapie génique des hémoglobinopathies, différentes stratégies sont théoriquement possibles pour activer des gènes normalement réprimés. Celle développée par mon équipe est le transfert du gène de l'érythropoïétine dans des cellules capable de sécréter in vivo des doses pharmacologiques d'érythropoïétine. Cette approche hormonale est développée dans un article très récent de la revue, consacré aux modèles animaux des hémoglobinopathies [2]. Elle ne sera donc pas détaillée ici. Il suffit de rappeler qu'il s'agit d'un modèle d'intérêt général permettant d'améliorer la triade gène-vecteur-cellule cible, car la simple mesure de l'hématocrite et le dosage de l'érythropoïétine permettent de tester in vivo l'efficacité d'un système de sécrétion de protéines « transgéniques ». Pour l'objectif spécifique du traitement des hémoglobinopathies, peu importe la cellule qui produit l'érythropoïétine (fibroblaste, cellule musculaire, cellule hématopoïétique) à partir du moment où la sécrétion de l'érythropoïétine transgénique est ajustée au niveau désiré [21-23]. Pour d'autres applications que les hémoglobinopathies, nos résultats préliminaires montrent qu'il sera possible d'obtenir la régulation de l'expression du transgène de l'érythropoïétine par l'hypoxie, ouvrant les nouveaux champs d'application que sont les anémies chroniques répondant à l'érythropoïétine. Enfin, il n'est pas indispensable que l'érythropoïétine transgénique soit produite par les propres cellules du patient si on peut immunoprotéger des cellules génétiquement modifiées, sécrétrices d'érythropoïétine, dans des capsules semi-perméables bien tolérées. Une lignée continue encapsulée régulant l'expression du gène de l'érythropoëétine grâce à la teneur en oxygène ou activée à la demande deviendrait un système universel et simple à implanter, réversiblement si besoin est. Cette approche sert de modèle de production in vivo à d'autres protéines transgéniques circulantes (hormones, cytokines, pro-enzymes, inhibiteurs d'enzymes, etc.). ou à action locale [24]. Il est bien sûr nécessaire que les cellules encapsulées ne soient pas responsables de réactions inflammatoires et ne relarguent pas de molécules immunogènes passant par les pores des fibres ou des capsules implantées.

 

 

* Réduction de l'expression des gènes alpha de la globine

 

La bêta -thalassémie est due au déficit de synthèse de la chaîne de globine bêta . Il est de mieux en mieux démontré que la sévérité clinique de la bêta -thalassémie est fonction de la quantité des chaînes alpha « libres », non appariées aux chaînes bêta ou gamma , qui résulte du déséquilibre de synthèse des chaînes alpha et non alpha (bêta + gamma ). Ces chaînes alpha non appariées sont instables et précipitent. Elles contiennent de l'hème et du fer qui sont de redoutables catalyseurs formant des radicaux libres de l'oxygène, très toxiques pour le globule rouge et ses précurseurs et qui sont responsables de l'hémolyse et l'érythropoïèse inefficace. L'augmentation de l'expression des gènes gamma de l'hémoglobine foetale ou la diminution de la production des chaînes alpha due à une alpha -thalassémie associée, réduit ce déséquilibre et la sévérité clinique de la bêta -thalassémie à l'état homozygote. À l'opposé, des gènes surnuméraires de globine alpha peuvent aggraver un état hétérozygote bêta -thalassémique, habituellement asymptomatique, en bêta -thalassémie de sévérité intermédiaire [25] (figure 2).

Réduire de 20 à 30 % la quantité de chaînes alpha libres transformerait une forme sévère de bêta -thalassémie en forme de sévérité intermédiaire, ne nécessitant pas de transfusions régulières. Les stratégies de transfert de gènes visant à réduire la quantité de chaînes alpha sont possibles à plusieurs niveaux. Au niveau de la transcription, l'expression des gènes alpha pourrait être réduite par l'inactivation d'un des deux gènes alpha ou de la région contrôle du locus alpha (LCR site HS-40) grâce à la recombinaison homologue ex vivo dans les cellules souches. On pourrait aussi ajouter un gène « antigène » codant une séquence d'ARN capable de former une triple hélice stable et d'inhiber une séquence activatrice du gène alpha . Au niveau post-transcriptionnel, un gène anti-ARN pourrait coder une séquence antisens inhibant la maturation de l'ARN messager alpha ou sa traduction. Il est aussi possible d'envisager la dégradation de la séquence d'ARN alpha grâce à une séquence de ribozyme ou en dirigeant l'action d'une nucléase cellulaire sur l'ARNm alpha [26]. La transcription des gènes, « antigène » ou « anti-ARN », devrait être sous la dépendance des séquences régulatrices des gènes de globine (LCR et promoteur) afin d'augmenter leur expression, leur spécificité cellulaire, et de coordonner l'expression des gènes alpha et des gènes inhibiteurs.

* Autres gènes thérapeutiques

Une autre approche, post-traductionnelle, aurait pour objectif d'augmenter la protéolyse des chaînes alpha non appariées. Un tel système protéolytique existe dans les réticulocytes des sujets hétérozygotes bêta -thalassémiques, asymptomatiques malgré la production de 50 % de chaînes alpha non appariées car elles sont bien protéolysées. Lorsque la quantité de chaînes alpha dépasse un certain seuil, comme c'est le cas chez l'homozygote bêta -thalassémique, le système de protéolyse des chaînes alpha solubles est probablement saturé et les chaînes alpha non appariées précipitent. Il serait donc possible d'améliorer la survie des globules rouges et de leurs précurseurs en ajoutant un gène de protéase capable de dégrader les chaînes alpha libres sans altérer la cellule.

Enfin, les oxydations cellulaires anormales qui, in fine, sont responsables des lésions cellulaires de la bêta -thalassémie, seraient réduites par l'addition d'un gène codant une enzyme antioxydante ou une protéine capable de neutraliser les formes oxydées de l'hème ou le fer libéré dans les précurseurs des globules rouges, responsables de l'érythropoïèse inefficace.

Telles sont les différentes stratégies potentielles de thérapie génique indirecte de la bêta -thalassémie, résumées dans le tableau I.

 

La drépanocytose

 

La thérapie génique de la drépanocytose nécessite d'inhiber le gain d'une fonction (la polymérisation) de la protéine exprimée en quantité normale. En plus des approches décrites plus haut, dont certaines sont communes aux thérapies géniques des hémoglobinopathies, deux stratégies spécifiques sont en cours de développement (tableau I).

La première approche, directe, consiste à utiliser un transgène de globine bêta codant une chaîne bêta modifiée « antidrépanocytaire » grâce à la mutagenèse dirigée des codons en position 22 et 87. Les changements d'acides aminés obtenus par transgenèse empêchent la formation d'un polymère stable [27].

La deuxième approche est indirecte. Il s'agit de réduire la concentration du 2-3 diphosphoglycérate (2-3 DPG), métabolite spécifique du globule rouge qui favorise l'état désoxygéné de l'hémoglobine, le relargage de l'oxygène dans la microcirculation et la polymérisation de l'hémoglobine S. Un mutant artificiel de l'enzyme 2-3 DPG mutase a la capacité de dégrader le 2-3 DPG [28]. Le transfert du gène de la 2-3 DPG « phosphatase », placé sous contrôle du système globine, devrait réduire la concentration de 2-3 DPG dans les globules rouges et par conséquent la polymérisation de l'hémoglobine S. Cette approche thérapeutique est en cours d'exploration (MC. Garel, communication personnelle).

 

Le déficit en adénosine désaminase (ADA)

 

Malgré sa rareté, il s'agit d'une maladie phare de la thérapie génique pour les raisons suivantes. Le premier véritable essai clinique de thérapie génique fut autorisé en septembre 1990 pour le déficit en ADA. La stratégie consistait à prélever les leucocytes du patient, à stimuler la division des lymphocytes mis en culture, à les modifier génétiquement ex vivo grâce à un vecteur rétroviral porteur du gène de l'ADA et à réinjecter les lymphocytes ainsi traités. Le traitement était répété régulièrement en raison de la durée de vie limitée de ces lymphocytes et du changement avec le temps des populations lymphocytaires circulantes. Les résultats détaillés viennent d'être publiés. Cependant, le traitement substitutif par injection de la protéine a été maintenu [29]. Cette approche, qui a une valeur historique, n'est pas un traitement radical, son effet n'est que partiel et probablement temporaire. Le traitement définitif par transfert ex vivo du gène de l'ADA dans les cellules souches hématopoïétiques (LTRA), grâce à un vecteur rétroviral et son expression pour compenser ce déficit, est en cours. Les premiers résultats à long terme, chez deux patients, sont encourageants [30].

 

La mucoviscidose

 

Contrairement aux hémoglobinopathies ou au déficit en ADA, il n'est pas possible de traiter ex vivo les cellules des glandes exocrines des patients ayant une mucoviscidose. L'accessibilité de la muqueuse des voies respiratoires en fait un modèle privilégié pour les essais de thérapie génique directe in vivo.

Deux types de vecteurs ont été particulièrement étudiés pour le transfert du gène CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator responsable de la perméabilité membranaire de l'ion chlorure régulée par l'AMPc), le vecteur adénoviral et les liposomes.

Le vecteur adénoviral, déficient pour la replication grâce à la délétion de la région E₁ est très efficace pour infecter un grand nombre de types cellulaires et pour introduire un nombre élevé de copies du vecteur (jusqu'à 500) sans que la cellule soit très altérée. La preuve du transfert et de l'expression du gène CFTR a été obtenue chez l'animal et chez les patients [31]. Des essais thérapeutiques sont en cours.

Bien que les vecteurs adénoviraux soient remarquables pour le transfert et l'expression du gène CFTR, les réactions immunologiques rendent inefficaces les réinjections des vecteurs de première génération [32], rendues nécessaires par l'absence d'intégration du vecteur dans l'ADN cellulaire et sa dilution rapide. Les liposomes ont l'avantage d'être bien tolérés, mais leur efficacité de transfert de gènes est plus faible [33, 34].

Ainsi, la naissance de la thérapie génique des maladies génétiques est encore laborieuse. Un grand nombre d'essais cliniques sont maintenant en cours. Il s'agit souvent de premiers pas, essais de tolérance, marquage cellulaire, faisabilité, sécurité. Peu d'essais cliniques ont véritablement un but thérapeutique. Les stratégies utilisées évoluent pour surmonter les obstacles mis à jour par les études in vivo afin de trouver de nouvelles voies plus efficaces, plus simples, et sûres. Elles se diversifient en fonction d'une meilleure connaissance des mécanismes physiopathologiques et des outils du transfert de gènes. Une présentation de ces outils et de ces stratégies sera ébauchée.

Les outils de la thérapie génique

Systèmes de transfert de gènes

 

L'ADN « nu » d'expression transitoire

 

L'immunisation d'animaux à partir d'ADN de plasmide porteur de gènes codant des protéines vaccinantes a été obtenue avec succès pour divers agents pathogènes viraux ou parasitaires [35]. Le principe est simple : injecter par voie intramusculaire une quantité adéquate d'ADN dont une faible partie sera transférée dans des cellules et sera exprimée sous forme de protéines antigéniques, de manière temporaire. La présentation des antigènes par des molécules du complexe d'histocompatibilité permet de remplacer l'usage de virus atténués par ce type de vaccination. Le « fusil à gène » (gene gun) bombarde l'épiderme avec des microparticules recouvertes d'ADN [36].

 

L'ADN « nu » d'expression permanente

 

L'ADN « nu » peut être transféré dans des cellules en culture grâce à des méthodes physiques comme le bombardement ou l'électroporation qui consiste à permettre l'entrée de molécules dans les cellules soumises à un choc électrique ou encore par des méthodes chimiques comme la précipitation par le phosphate de calcium. Il s'agit de la transfection du gène. Il arrive parfois que le transgène soit incorporé dans l'ADN cellulaire par un processus de recombinaison. Il est alors exprimé de manière permanente et transmis de manière clonale dans les cellules de la descendance de la cellule ayant intégré le gène d'intérêt [37]. L'utilisation d'un gène additionnel de résistance à un agent toxique ou d'un gène codant un marqueur cellulaire permet de purifier les cellules transfectées ayant intégré et exprimé le gène de sélection. On peut aussi, grâce à un processus de double sélection, isoler les cellules ayant intégré le transgène dans un endroit spécifique, soit pour inactiver un gène (knock-out), soit pour remplacer une séquence anormale par une séquence normale. Cette recombinaison homologue est possible si de part et d'autre du transgène se trouvent des séquences identiques à la région ciblée [18, 37]. On pourrait aussi envisager d'introduire, dans le promoteur d'un gène, une séquence d'inactivation ou d'activation de ce gène. Cette recombinaison homologue est possible pour des cultures de cellules primaires, prélevées à un patient, dont on peut obtenir une multiplication presque infinie [37]. C'est le cas, par exemple, des fibroblastes ou des myoblastes. En effet, l'intégration de l'ADN « nu » dans le génome est un événement rare. L'intégration ciblée est rarissime. Il faut donc avoir un grand nombre de cellules transfectées pour obtenir une cellule génétiquement modifiée d'une manière correcte. Il faut ensuite sélectionner les clones issus des cellules ayant effectué la recombinaison homologue, choisir le meilleur clone et l'utiliser dans un but thérapeutique. L'amélioration de l'intégration ciblée est d'une importance capitale. Il faut, d'une part, augmenter la fréquence de la recombinaison ciblée grâce aux méthodes dérivées des systèmes de recombinaison des micro-organismes (38) et d'autre part, simplifier les méthodes de sélection des clones cellulaires n'ayant que la recombinaison ciblée et pas d'intégration au hasard du transgène.

 

L'ADN « habillé ». Complexes macromoléculaires. Liposomes

 

Pour améliorer l'efficacité du passage de la membrane plasmique par l'ADN, toute une série de vecteurs non viraux est en cours d'étude. L'ADN étant chargé négativement ainsi que la membrane cellulaire, l'addition de charges positives sous forme, par exemple, de polylysine ou de lipides cationiques, permet, d'une part, de neutraliser les charges de l'ADN et d'augmenter, d'autre part, la liaison du complexe à la membrane. L'addition d'une protéine comme la transferrine permet le transfert du gène d'intérêt dans des vésicules d'endocytose. Pour favoriser le passage de l'ADN à travers la membrane lipidique de ces vésicules, certaines protéines d'enveloppes virales (fusiogènes) améliorent le transfert de l'ADN dans le cytosol [39, 40]. L'intégration du transgène dans l'ADN cellulaire pourrait être accrue en ajoutant les extrémités de l'Adeno-Associated Virus (AAV) favorisant l'intégration dans un site neutre du chromosome 19 [11], atténuant le risque d'activation d'un oncogène.

Une forme élaborée de complexes d'ADN est constituée par les liposomes de nouvelle génération, stabilisés, non piégés par les phagocytes ou les protéines circulantes, capables de fusionner (lipofection) avec la membrane plasmique ou les endosomes [39]. Ils sont non toxiques, permettent de transférer des gènes de grande taille et peuvent être administrés de façon répétée, localement surtout. C'est le cas par exemple du gène CFTR dans la mucoviscidose [34] et d'un gène HLA B7 dans les mélanomes [41]. Ils peuvent également être efficaces par voie systémique comme le montre le transfert du gène de la protéine P53 faisant régresser des tumeurs mammaires humaines développées chez la souris nude, prévenant la formation de métastases et les rechutes [42]. Pour améliorer l'efficacité du transfert intracytoplasmatique, la modification des lipides, l'addition de protéines virales ou le ciblage cellulaire (transferrine, ligand d'autres récepteurs, anticorps) sont en cours de développement. Pour augmenter l'intégration de l'ADN transféré dans le génome cellulaire, les séquences cibles et les protéines favorisant la recombinaison sont étudiées. Ainsi, on peut observer deux tendances des transferts d'ADN, une simplification grâce à l'ADN « nu » ou la fabrication de complexes encapsulés ou non, acquérant les qualités des vecteurs viraux, sans leurs inconvénients.

 

Vecteurs rétroviraux

 

Les vecteurs rétroviraux (ARN) sont les vecteurs les plus utilisés jusqu'ici. Ils ont de nombreux avantages. Ils permettent l'intégration de transgènes dans de nombreux types cellulaires avec une grande efficacité. Ils sont aisément produits par des lignées productrices « transcomplémentantes » ayant intégré dans des sites différents de leur génome : 1) les gènes gag, pol, env codant les protéines virales nécessaires à la formation des particules virales fonctionnelles et 2) l'ADN codant le vecteur (provecteur) capable d'être transcrit, de former l'ARN génomique qui sera intégré dans la particule du vecteur viral. Le risque d'obtenir des ARN replicatifs par recombinaison ou complémentation devient de plus en plus faible avec les nouvelles générations de cellules productrices de vecteurs. Le risque d'activation d'un oncogène au voisinage du site d'insertion dans les cellules ciblées, faible en cas d'insertion aléatoire du vecteur classique, est encore diminué par l'obtention de vecteurs auto-inactivés (figure 1). Dans ce cas, un promoteur additionnel interne permet l'expression du transgène. Les conditions d'obtention de titres élevés de particules infectantes, porteuses du transgène, progressent rapidement [6]. Il devient également possible de concentrer le surnageant des cultures de cellules productrices pour améliorer l'efficacité de l'infection et de conserver des lots importants de vecteurs fonctionnels. Enfin, le changement de protéines de l'enveloppe virale permet d'élargir la spécificité d'infection aux cellules humaines [43] (vecteurs amphotropes) et à d'autres types cellulaires. Grâce à des gènes de protéines d'enveloppe d'autres virus, VSV-G par exemple, formant des vecteurs pseudotypes [40] ou grâce à l'adjonction de séquences reconnaissant des récepteurs spécifiques. Il est possible d'étendre ou de réduire la spécificité cellulaire de la vectorisation. La fusion du gène de l'érythropoïétine au gène env code une protéine hybride dont la partie érythropoïétine sert de modèle de liaison du ciblage du vecteur aux cellules portant le récepteur correspondant [44].

Les inconvénients des vecteurs rétroviraux sont la nécessité de mettre les cellules en cycle pour obtenir l'intégration du transgène, la faible stabilité des particules rétrovirales dont la durée de vie fonctionnelle est courte dans les conditions de transfert et enfin, le risque d'insérer le transgène dans un site activant un oncogène ou inactivant un gène suppresseur de tumeur, sans que l'on connaisse aujourd'hui le danger de cette insertion. Le ciblage d'intégration sélective dans une région sûre est une stratégie nouvelle, guidée par l'intégration de rétrotransposons de levures (T_Y) dans un gène transcrit par l'ARN polymérase III comme un gène d'ARN de transfert [45].

 

Les vecteurs adénoviraux

 

Les avantages de ces vecteurs sont la très grande capacité de l'adénovirus d'infecter divers types de cellules non en cycle, en particulier épithéliales, des titres élevés, la stabilité du vecteur, un nombre élevé de copies par cellule cible qui peut être atteint sans effet toxique, l'absence d'intégration du transgène dans le génome cellulaire et de risque oncogène. In vivo, le transgène peut être exprimé pendant toute la vie d'une cellule quiescente.

Les inconvénients du vecteur adénoviral sont : 1) l'impossibilité d'intégrer le transgène dans le génome cellulaire et sa dilution lors des divisions cellulaires ; 2) l'immunogénicité des protéines virales codées par les premiers vecteurs, qui empêche les réinjections ou les réinstillations pulmonaires. Un gène codant une protéine E₃GP19K, réduisant la présentation des antigènes à la surface des cellules [46], avait été malheureusement inactivé dans les vecteurs de première génération. La délétion des antigènes viraux importants codés par le gène E2a est bénéfique [32]. Son inactivation accroît la durée d'expression du transgène et réduit les réactions inflammatoires. De même, la taille du transgène qui peut être inclus dans le vecteur doit être accrue ; 3) Le risque de recombinaison ou de complémentation n'est pas complètement nul avec les premiers vecteurs. L'utilisation de vecteurs très modifiés, ou construits à partir d'adénovirus infectant d'autres espèces que l'homme, permettront d'améliorer la sécurité du vecteur adénoviral.

 

Le vecteur Adeno-Associated Virus (AAV)

 

Ce vecteur présente l'intérêt d'avoir une très faible proportion du génome viral par rapport au gène d'intérêt qui peut y être incorporé. Il infecte les cellules préférentiellement en cycle mais aussi les cellules non en cycle dans lesquelles le gène peut être intégré. Il a un site d'intégration privilégié mais non exclusif dans une région en principe sans risque du chromosome 19. Cette propriété est le plus souvent réduite ou absente en cas de vecteur dérivé du virus AAV2. Il permet le transfert de gènes dans la cellule souche hématopoïétique humaine LTRA [47, 48].

Cependant, la capacité de l'AAV d'intégrer de l'ADN étranger est la plus faible (5 kb). Il a un inconvénient supplémentaire, celui de nécessiter un virus helper pour sa production. Cependant, l'obtention de lignées cellulaires productrices de vecteur AAV, sans l'aide de virus helper est en progression rapide. Enfin, la présence de l'ADN du vecteur dans les cellules hématopoïétiques in vitro n'est pas synonyme d'intégration et d'expression. La méthode RT-PCR montre l'expression du transgène mais ne prouve pas l'intégration du vecteur, rarement démontrée dans les études ex vivo. Cependant, des résultats préliminaires obtenus in vivo pour le gène C de la maladie de Fanconi (FAC-C) sont encourageants [47].

 

Autres vecteurs

 

D'autres vecteurs viraux sont activement recherchés pour des ciblages spécifiques de tissus (herpès par exemple), pour un transfert de gènes de plus grande taille ou pour augmenter l'efficacité de la transduction. Des combinaisons des différentes séquences de virus tentent d'associer les avantages de chaque virus d'origine. Enfin, les chromosomes artificiels dérivés des YAC (Yeast Artificial Chromosomes) ou les MAC (Mammalian Artificial Chromosomes) sont en cours de développement [50].

 

Les transgènes

 

L'expression du transgène va dépendre des différents éléments de contrôle ajoutés au gène proprement dit, dans le but d'obtenir l'expression désirée : 1) permanente, temporaire ou induite ; 2) à un niveau faible ou élevé, constant ou régulé ; 3) dans un seul type cellulaire (ciblage transcriptionnel) ou dans toutes les cellules. La construction finale peut être très élaborée. Elle est améliorée progressivement par les études d'expression dans des cellules en culture puis dans les modèles animaux.

Les éléments de contrôle peuvent être de différentes origines. Une grande panoplie de promoteurs et d'éléments de régulation sont disponibles, d'origine cellulaire ou virale. Chaque construction doit contenir le gène : ADN complémentaire qui peut être la séquence codante totale ou amputée pour permettre son incorporation dans un vecteur de faible capacité ou, au contraire, inclure l'ensemble de l'ADN génomique d'un petit gène et ses régions flanquantes. Il est encore difficile de définir une stratégie générale permettant de prévoir l'assemblage idéal, le niveau d'expression et la stabilité du transgène qui dépendent d'interférences, par exemple, entre le vecteur viral et le transgène dans un environnement donné, cellule productrice du vecteur, cellule souche ciblée où se fait l'intégration et cellule différenciée dans laquelle le gène est exprimé. Bon titre du vecteur, transfert efficace, intégration stable, expression en temps et au niveau voulus doivent intégrer un grand nombre de variables. La progression d'une thérapie génique est faite d'essais systématiques et de choix par comparaisons et éliminations successives.

Le cas le plus simple pour choisir les éléments de régulation de l'expression d'un transgène est celui d'un gène domestique faiblement exprimé à un niveau constant, dans toutes les cellules. C'est le cas du gène de l'adénosine désaminase, dont l'ADN complémentaire de la région codante est de l'ordre de 1 300 nucléotides. Ce gène est inséré selon les techniques classiques de génie génétique dans un vecteur de type rétroviral dérivé du virus de Moloney (MoMLV) dont on change certaines séquences pour pouvoir comparer les différentes propriétés du vecteur : titre de production par la lignée transcomplémentante, efficacité d'intégration, niveau et durée d'expression du transgène à long terme chez la souris, après greffe des cellules souches hématopoïétiques à l'animal irradié. Dans le cas particulier de l'ADA, une simple mutation ponctuelle appelée B₂ (+ 160 bases G * A), ou le remplacement du long terminal repeat (LTR) du virus de Moloney par celui du virus MPSV (Myeloproliferative Sarcoma Virus) augmentent l'expression du gène humain à long terme in vivo, atteignant le niveau d'expression du gène endogène de la souris [30].

Un cas plus compliqué est celui d'une protéine exprimée à une concentration élevée dans un type cellulaire spécifique, comme la bêta -globine, dont le niveau d'expression est encore trop faible pour être thérapeutique. La spécificité tissulaire et temporelle est obtenue par le promoteur du gène bêta de globine et les sites majeurs de la région contrôle du locus (LCR bêta -globine). En raison de leur dispersion, ces régions régulatrices doivent être sélectionnées, découpées et accolées au promoteur du gène afin de pouvoir empaqueter l'ensemble dans la particule rétrovirale. Le gène doit être l'ADN génomique qui est heureusement de petite taille. Les sites d'instabilité ou d'inhibition de l'expression du transgène doivent être localisés et neutralisés (figure 1) [8].

Les exemples de l'ADA et de la globine soulignent que le « patron » du couple transgène-vecteur doit être taillé sur mesure et sera fonction du gène lui-même, du vecteur qui devient vite un véritable puzzle et de la cellule cible qui fournit les machineries d'expression, en tenant compte ; 1) du lieu de destination de la protéine transgénique, sécrétée, cytosolique, incorporée dans la membrane plasmique ou dans un compartiment spécifique de la cellule ; 2) selon le type cellulaire si l'expression doit être spécifique ou non ; 3) selon l'expression temporelle de cette protéine, permanente ou temporaire ; 4) de son expression faible ou élevée, induite ou régulée par un mécanisme physiologique ou artificiel, pharmacologique ou hormonal. Il est ainsi pratiquement impossible d'étudier isolément chacune des composantes de l'ensemble vecteur-gène-cellule cible - cellule exprimant la protéine. L'étape cruciale est « in vivo veritas » grâce à un modèle animal pertinent, si possible humanisé, afin de mesurer le pourcentage des cellules transduites, le niveau d'expression du transgène et l'effet thérapeutique.

Stratégies des thérapies géniques des maladies acquises

Les visées thérapeutiques des transferts de gènes, orientées initialement vers les maladies génétiques monogéniques, se sont rapidement élargies aux maladies acquises (cancers, maladies dégénératives, infections chroniques) pour lesquelles il n'y a pas de traitement satisfaisant aujourd'hui. Le changement d'ordre de grandeur du nombre des patients ayant la même pathologie et l'intérêt croissant porté par l'industrie pharmaceutique ont modifié l'esprit de la recherche et les moyens mis en oeuvre.

Marquage cellulaire et gènes de résistance aux agents cytotoxiques

 

Le marquage, ex vivo de cellules réinjectées au patient, permet de suivre le devenir de deux types de cellules, les cellules normales comme les cellules souches hématopoïétiques humaines et les cellules malignes qui contaminent les prélèvements des autogreffes.

Le marquage des cellules souches hématopoïétiques est essentiel pour améliorer les conditionnements permettant leur mobilisation in vivo, l'enrichissement, la purification et la multiplication des cellules souches LTRA in vitro [51]. Le marquage est également important pour améliorer les procédés de transfert de gènes et leur expression. La greffe de cellules souches humaines génétiquement modifiées aux animaux tolérants, immunodéficients [12] ou après induction de la tolérance chez le foetus [52], rend possible l'évaluation, à long terme, du pourcentage de cellules souches humaines marquées et des différentes lignées hématopoïétiques qui en dérivent. Si le gène marqueur est exprimé, il devient possible de mesurer la production d'ARN messager et de protéine transgénique par rapport à la protéine endogène quand on peut les distinguer.

Après chimiothérapie intensive et autogreffe, il devient possible de déterminer l'origine d'une rechute d'une affection maligne, cellules du greffon ou de l'hôte, grâce au marquage ex vivo des cellules réinjectées [51]. Ce marquage permet d'évaluer et de faire progresser la qualité de la purge des cellules malignes et de la purification des cellules souches. La surveillance périodique du marqueur chez les patients, grâce aux méthodes très sensibles de biologie moléculaire évalue la cinétique in vivo des cellules malignes, la qualité de l'autogreffe et guide la thérapeutique avant la rechute clinique.

La sélection positive de cellules souches hématopoïétiques, après transfert d'un gène de résistance aux agents cytotoxiques dont le chef de file est le gène MDR 1 (Multidrug Resistance Gene), facilitera la chimiothérapie intensive in vivo [53]. Il en est de même pour le gène de la dihydrofolate réductase ou de la métallothionéine.

 

Amplification d'une population cellulaire

 

Le nombre des cellules souches ayant intégré le transgène ex vivo est très faible, nécessitant aujourd'hui la chimio-ablation des cellules souches du patient qui n'ont pas été prélevées pour que la proportion des cellules transduites puisse être élevée in vivo. La chimiothérapie n'étant pas souhaitable en dehors des maladies malignes, il serait très important de pouvoir augmenter le nombre des cellules souches LTRA par des manipulations ex vivo ou de leur donner un avantage sélectif in vivo. Cet objectif pourrait être atteint par le transfert d'un gène d'une protéine ou d'un récepteur d'une hormone ou d'un facteur activant la mise en cycle des cellules souches LTRA ex vivo. La multiplication des cellules souches LTRA ex vivo est un objectif essentiel pour la thérapie cellulaire et pour la thérapie génique directe de maladies monogéniques comme les hémoglobinopathies ou la maladie de Fanconi pour laquelle un gène muté (FAC-C) et bientôt FAC-A pourrait être compensé par transfert du gène normal [54].

Cette stratégie qui doit encore être concrétisée et qui est évoquée à propos des cellules hématopoïétiques est extrapolable à d'autres types de cellules souches ou de progéniteurs.

 

Gènes thérapeutiques des cancers et des leucémies

L'objectif, dans ces cas, est de détruire l'ensemble des cellules malignes. Pour y arriver, deux types de transfert de gènes sont développés : 1) Le transfert d'un gène capable de tuer la cellule anormale par suicide, ou en corrigeant le phénotype malin « immortel » et incontrôlable. Les difficultés majeures sont de cibler in vivo toutes les cellules souches malignes, de manière spécifique. 2) L'élimination immunologique des cellules malignes peut être induite, soit par la modification génétique des cellules malignes dans un but de « vaccination », soit par activation du système immunitaire grâce au transfert de gènes [55].

 

Gènes suicides

 

En décembre 1992, commença un premier essai thérapeutique antitumoral prévu pour 12 patients ayant une tumeur cérébrale [56]. La stratégie utilisée avait pour but d'introduire un gène codant une enzyme, la thymidine kinase du virus de l'herpès (HSV-TK) capable de transformer une prodrogue inactive, le ganciclovir, en un nucléotide inhibiteur de la synthèse d'ADN, responsable de la mort des cellules tumorales en cycle. Le vecteur rétroviral était produit in situ par des fibroblastes hétérologues, injectés dans la tumeur par stéréotaxie. Le tissu cérébral voisin n'était pas capable d'intégrer le vecteur rétroviral car seules les cellules en cycle peuvent le faire. Une observation intéressante révéla que pour une cellule exprimant le gène HSV-TK, environ cinq autres cellules sont détruites par un effet de voisinage. Les résultats de cette étude auraient montré un effet partiel et transitoire [56]. Les résultats détaillés ne sont pas encore publiés.

D'autres essais expérimentaux sont en cours [57, 58] (tableau II). Pour améliorer la spécificité de l'expression du gène suicide, celui-ci peut être mis sous le contrôle du promoteur d'un gène dont l'expression est spécifique de la tumeur ou activée sous l'effet de radiations ionisantes [59]. C'est le ciblage transcriptionnel. Des gènes de toxine comme celui de la chaîne A de la toxine diphtérique sous contrôle d'un gène spécifique d'une tumeur sont en cours d'étude [60].

 

Gènes suppresseurs de tumeurs et gènes anti-oncogènes

 

La transformation maligne est souvent associée à l'inactivation d'une protéine suppresseur de tumeur, comme la protéine P 53 dont le gène est muté dans 50 % des tumeurs humaines. Ce type de mutation confère à la cellule maligne un avantage de prolifération, une réduction de la correction des erreurs de l'ADN et la suppression de la mort cellulaire programmée (apoptose) déclenchée par les « stress », les altérations cellulaires sévères et par les agents antitumoraux [61]. Le transfert du gène de la protéine P53 normale et son expression dans les cellules ayant perdu la fonction de cette protéine permettent de ralentir leur prolifération, rétablissant la phase de correction des mutations de l'ADN et la mort programmée des cellules anormales ainsi que la sensibilité à certains agents antitumoraux [62]. Par analogie, d'autres gènes suppresseurs de tumeurs peuvent jouer un rôle thérapeutique majeur [61].

La stratégie des « gènes anti-oncogènes » a pour objectif de corriger un caractère pathologique dominant dû 1) à la surexpression d'un gène, normalement faiblement exprimé ; 2) à l'expression abérante d'un oncogène non exprimé normalement et 3) à une mutation faisant perdre la régulation physiologique de la propéine activée en permanence.

Différents niveaux thérapeutiques peuvent être ciblés selon les cas : inhibition de la transcription de l'oncogène, dégradation ou blocage de son ARN messager grâce à un gène codant un ARN antisens [63], ribozymes [64], synthèse d'une protéine « transdominante » inactivant l'effet de la protéine oncogénique.

Si la tumeur a une localisation unique et facilement accessible, un transfert local est possible. En cas de métastases ou de leucémies, le ciblage in vivo est nécessaire [65].

 

Ciblage in vivo des cellules tumorales

Deux types de ciblage sont en cours de développement. Une interaction spécifique entre le vecteur de gène (viral ou non viral) et la cellule cible peut être espérée si on ajoute au vecteur une molécule de reconnaissance spécifique de la cellule tumorale, de type anticorps ou ligand d'un récepteur membranaire. Si on ne peut cibler la surface de la cellule tumorale, il peut être possible, dans certains cas, d'obtenir un « ciblage transcriptionnel » lorsque la tumorégénicité est associée à l'activation d'un promoteur particulier. Le gène thérapeutique (suicide) mis sous le même contrôle sera spécifiquement exprimé dans les cellules tumorales [58, 59] et sera peu ou pas exprimé dans les autres cellules. On peut également exprimer un transgène spécifiquement dans un type cellulaire donné par des motifs reconnus par des facteurs transcriptionnels spécifiques de tissus.

Dans tous les cas, il est nécessaire que le vecteur puisse franchir les barrières naturelles vasculaires, souvent anormalement perméables dans les tumeurs et diffuser jusqu'aux cellules malignes, in vivo. La tâche est difficile, mais les progrès dans le domaine des complexes moléculaires, des liposomes, des vecteurs viraux et du ciblage transcriptionnel deviennent encourageants. L'injection IV de liposomes véhiculant le gène P53 a fait régresser des tumeurs mammaires humaines chez la souris immunodéficiente nude [42].

L'alternative est l'élimination des cellules tumorales ou leucémiques par les systèmes de défense de l'organisme affaiblis ou trompés par l'évasion immunitaire des cellules malignes.

 

Immunothérapie « génique » syndromes malins

 

L'élimination de cellules anormales par génothérapie à visée immunologique fait envisager trois types de transferts de gènes 1) favorisant la vaccination par les cellules malignes génétiquement modifiées et irradiées ; 2) activant des cellules du système immunitaire antitumoral et 3) l'immunothérapie génique « adoptive » en cas d'allogreffes [66].

Les cellules malignes génétiquement modifiées ex vivo et réinjectées dans un but de « vaccination » doivent avoir un rôle de stimulation de la réponse immune contre elles-mêmes et contre les cellules tumorales non manipulées ex vivo. Le transfert d'un gène peut améliorer la transformation, la présentation et la densité des antigènes tumoraux préexistants ou « cryptiques » [67], la reconnaissance antigénique ou la destruction des cellules malignes par les cellules cytotoxiques. Les gènes de molécules activatrices sont de divers types, interféron alpha et gamma , TNF alpha , interleukines 1,4,6,7,10,12, facteurs de stimulation MCP-1, de croissance G-CSF, GM-CSF ou un coactivateur HLA B7 [66]. Enfin, l'addition d'un gène codant une protéine antigénique non exprimée par la cellule tumorale peut avoir un effet activateur de la reconnaissance des cellules tumorales qui ne l'expriment pas et induire leur destruction, in vivo [66].

Une autre approche est la manipulation des cellules immunitaires du patient, activant des lymphocytes T ou présentatrices d'antigènes [66]. Les lymphocytes T antitumoraux, génétiquement modifiés ex vivo, produisent localement les interleukines bénéfiques ou d'autres facteurs stimulant la réponse immunitaire. Une boucle d'activation autocrine peut être induite par le transfert d'un gène codant un récepteur chimérique ayant une région GM-CSF extramembranaire et une région IL-2 intracytoplasmique [68]. Les lymphocytes T CD8⁺, activés par la reconnaissance de la cible, produisent du GM-CSF qui, de manière autocrine, amplifie l'activation des clones génétiquement modifiés. En cas d'éradication complète des cellules malignes, un gène suicide additionnel, de type thymidine kinase du virus de l'herpès, serait capable d'éliminer la population lymphocytaire cytotoxique anticellule maligne devenue inutile [69]. En cas d'allogreffe hématopoïétique, un raisonnement analogue peut être appliqué aux lymphocytes anticellules leucémiques (GVL) du donneur. Ils peuvent être génétiquement modifiés, et leur nombre amplifié ex vivo, puis injectés au patient créant une immunophérapie adoptive et contrôlable [69].

 

Maladies vasculaires et thrombose

Le transfert de gènes in vivo dans les cellules endothéliales ou les cellules musculaires lisses permet de mieux comprendre l'action des protéines qu'ils codent et d'envisager leur utilisation thérapeutique [70]. En cas d'hyperplasie de l'intima et de resténose, l'objectif est d'inhiber la prolifération des cellules musculaires lisses, la formation de thrombus, les phénomènes inflammatoires et le remodelage du vaisseau. Pour y arriver, deux stratégies sont développées. L'une a pour but d'inhiber la prolifération des cellules musculaires lisses en augmentant localement le taux d'un inhibiteur, par exemple le monoxyde d'azote NO, grâce au transfert de la NO synthase dans une proportion même faible de cellules. La formation locale de NO a également un effet inhibiteur sur l'agrégation plaquettaire et un effet vasodilatateur bénéfique [71].

L'autre stratégie est le transfert d'un gène suicide inhibant localement la prolifération des cellules musculaires lisses grâce, par exemple, au gène de la thymidine kinase de l'herpès [72] ou de la cytosine désaminase bactérienne qui convertit la 5-fluorocytosine en 5-fluorouracile toxique. Le gène RB (rétinoblastome) permet également de réduire la prolifération des cellules musculaires lisses [73].

Parmi les vecteurs en cours d'évaluation, le vecteur adénoviral occupe une place privilégiée car les cellules ciblées n'ont pas un renouvellement rapide et l'effet désiré est temporaire. Des liposomes ou des complexes moléculaires d'ADN, associés à des protéines virales, facilitant l'adhérence du vecteur et le transfert intracytoplasmique du gène, sont également efficaces in vivo. L'application locale du vecteur grâce à un hydrogel imprégnant le manchon d'angioplastie permettrait d'augmenter l'efficacité du transfert et de réduire l'essaimage du vecteur en dehors de la région d'intérêt [74].

Le ciblage des cellules endothéliales, qu'il soit membranaire ou transcriptionnel, est d'un intérêt majeur pour toutes les productions in vivo de protéines sécrétées ayant une action systémique ou plus spécifiquement vasculaire afin de rétablir l'homéostasie de la pression artérielle, des débits, de l'hémostase et de la thrombose [75].

 

Stratégies antivirales

 

Trois groupes de stratégies de transfert de gènes sont en cours de développement pour prévenir ou enrayer des infections virales : 1) vacciner par l'ADN; 2) créer une résistance des cellules à l'infection ou à la production virale ; 3) induire une immunité efficace contre le virus ou contre les cellules infectées. Les stratégies anti-VIH seront prises comme modèle [76]. Elles se heurtent à deux difficultés majeures, celle de la variabilité du virus et celle de l'absence d'un modèle animal fournissant de manière simple, rapide et peu coûteuse, des résultats extrapolables aux patients.

Vaccination par transfert de gène

Les résultats remarquables obtenus dans la prévention de l'infection de la souris par le virus influenza malgré sa dérive génétique, grâce à l'injection d'ADN codant les protéines virales [77] et les résultats expérimentaux obtenus vis-à-vis de l'hépatite B [78], de l'hépatite bovine et de l'HTLV₁ [76] font envisager de manière réaliste l'utilisation de l'ADN comme moyen d'expression transitoire de protéines virales ou parasitaires induisant une immunité humorale et cellulaire. L'ADN « nu » vaccinant est beaucoup plus stable que les protéines vaccinantes, facile à purifier et peu coûteux à produire en grande quantité. Il est promis à un grand avenir si on confirme l'absence de son intégration dans le génome de rares cellules et l'absence d'effet immunitaire in`ésirable (induction de tolérance, auto-anticorps, hyperimmunité). Une meilleure connaissance fondamentale des mécanismes du transfert de l'ADN, de l'expression transitoire des gènes, de leur activation et de leur inactivation secondaire, ainsi que l'utilisation d'ADN associé à des molécules cationiques, ou permettant un transfert aux muqueuses, devraient faire évoluer ce domaine d'application très activement développé.

La variabilité des protéines virales du VIH n'est peut être pas un problème insurmontable comme le montre la protection obtenue chez des macaques, par des vaccins viraux atténués (vaccin canarypox) codant des protéines VIH1 vis-à-vis d'une infection des singes par VIH2 dont l'homologie des gènes de structure n'est que de 40 à 60 % [79].

 

Gènes de résistance au VIH

 

Les différentes étapes du cycle viral sont prises pour cible par des agents pharmacologiques, par des oligonucléotides antisens ou ribozymes ciblant les acides nucléiques (rétrotranscription de l'ARN génomique, transcrits du provirus intégré dans le génome cellulaire ou la traduction d'ARN messager) [63]. Seuls, des transgènes thérapeutiques seront aptes à protéger les cellules d'une manière permanente.

Une voie séduisante est d'introduire des gènes codant des séquences leurres piègeant des protéines virales impliquées dans la transcription inverse, la transcription ou la maturation des ARN viraux, génomiques ou messagers. Les séquences leurres doivent être spécifiques, ne pas lier des protéines cellulaires. Par exemple, un vecteur rétroviral porteur de vingt copies de la séquence TAR, liant la protéine « Tat », confère aux lymphocytes du sang une résistance substantielle vis-à-vis de l'infection par VIH in vitro [80].

D'autres transgènes utilisés codent des protéines virales anormales, « transdominantes » (Tat, Rev, Gag, Env...), entrant en compétition avec la protéine normale ou s'associant à elle pour empêcher la maturation normale des ARN et des protéines ou pour former des particules virales instables ou non fonctionnelles [81]. D'autres approches ont pour but d'activer des gènes de défense intracellulaire, par exemple, ceux qui sont sensibles à l'interféron ou transgène produisant des anticorps intracellulaires ciblant une protéine virale [81].

Les cellules dans lesquelles le transgène doit être exprimé, de manière inductible lors de l'infection par le virus ou permanente, doivent être les cibles naturelles du VIH. Les lignées sanguines peuvent être ciblées ex vivo grâce à un vecteur viral (rétroviral, adeno-associated virus) transduisant le gène d'intérêt dans les progéniteurs et les cellules souches hématopoïétiques à longue durée de repopulation in vivo (LTRA) [82].

 

Immunothérapie « adoptive » et génique des maladies virales

 

Dans le cadre des greffes de moelle, l'activation permanente de lymphocytes cytotoxiques du donneur par transfert d'un gène permet une prévention et peut être l'éradication des cellules infectées par le cytomégalovirus [83]. Le contrôle des lymphoproliférations liées au virus d'Epstein-Barr, grâce aux lymphocytes T génétiquement modifiés, est en cours de développement [84].

Le cytomégalovirus (CMV) est associé à un état morbide sévère chez les sujets immunodéprimés, greffés ou ayant une immunodéficience acquise. Une approche thérapeutique est d'utiliser les cellules T du donneur, sensibilisées aux lignées lymphobastoïdes du donneur et d'introduire dans ces cellules T des transgènes de sélection et un gène suicide. La réinjection de la population expansée ex vivo peut avoir un intérêt prophylactique ou curatif chez les patients.

Le virus d'Epstein Barr (EBV) est lui aussi bien toléré par le sujet normal. Mais il est associé à un nombre croissant de maladies malignes avec une fréquence particulière chez les patients immunodéprimés. Les lymphocytes T anti-EBV du donneur d'une allogreffe, marqués génétiquement et injectés aux patients greffés, ont un intérêt prophylactique et curatif certain [84]. Cette approche « immuno-adoptive » est d'un intérêt général pour les maladies virales chroniques (VIH, hépatite C, etc.) pour la thérapie des cancers évoquée plus haut et pour les maladies auto-immunes afin d'éliminer les clones cellulaires activés de manière anormale.

Études cliniques

En juin 1995, près de 200 protocoles cliniques de transfert de gène étaient autorisés par les instances américaines ou en Europe. La très grande majorité des essais connus est en phase I, tolérance, sécurité et tests biologiques d'activité thérapeutique. La proportion des essais véritablement thérapeutiques en phase II est très faible. La majeure partie des essais concerne les cancers (49 %), les marquages (24 %), les maladies génétiques (19 %), le sida (7,5 %) et les maladies dégénératives (2 %).

Les protocoles, ainsi que les commentaires du RAC (Recombinant Advisory Committee), sont publiés régulièrement dans la revue Human Gene Therapy.

Les résultats cliniques des essais thérapeutiques commencent à être publiés ou sont connus grâce aux rapports de progression dans les sessions du RAC. Les publications des résultats cliniques détaillés, dans les journaux médicaux ou scientifiques, sont encore limitées aux aspects biologiques. Il ressort de ces résultats préliminaires une bonne sécurité des vecteurs et en général l'absence d'effets secondaires délétères, directement liés au transfert de gène. Les premiers résultats d'efficacité clinique obtenus par thérapie génique ex vivo pour le déficit en adénosine désaminase [29, 30] et par immunothérapie adoptive génique [51, 83, 84] sont encourageants. Il en sera de même pour les marquages cellulaires [51], la sécrétion de protéines systémiques à faible concentration et les vaccinations au sens classique ou tumoral du terme.

Bilan et perspectives

Au terme de cette analyse des stratégies des transferts de gène, à but thérapeutique ou de marquage cellulaire, se dégage une grande diversité des outils, des cibles moléculaires et cellulaires et des pathologies pouvant en bénéficier, tous les chemins de la médecine ou presque menant à la thérapie génique. Il n'y a pas encore de transfert idéal mais les systèmes actuels sont déjà opérationnels dans bien des domaines d'application, bien que le bénéfice réel du transfert du gène thérapeutique reste à être démontré.

Une bonne connaissance des mécanismes de base de l'expression des gènes, des vecteurs, de la physiopathologie moléculaire et cellulaire implique une convergence de différents domaines de savoir-faire afin de définir les stratégies les plus réalistes et construire un ensemble expérimental à trois niveaux, pour forger la triade vecteur-gène-expression cellulaire.

Le premier niveau est celui des constructions et des études cellulaires. Le deuxième niveau est celui des études in vivo utilisant un modèle animal pertinent pour la pathologie visée, humanisé si c'est possible [30]. Les allers et retours entre ces deux niveaux sont nécessaires pour atteindre l'effet thérapeutique souhaité en toute sécurité. Le troisième niveau est celui des essais humains qui ne doit pas court-circuiter les précédents.

Les objectifs sont, dans l'immédiat, d'améliorer des états pathologiques avec les méthodes opérationnelles bien qu'imparfaites et d'utiliser les marquages cellulaires dans le cadre de la recherche clinique et des premières applications élargies. Parallèlement, un travail de fond de grande amplitude progresse rapidement vers des méthodes plus radicales et sans risque.

Quelle sera la place des transferts de gènes dans l'arsenal thérapeutique ? Beaucoup pensent encore qu'il s'agit d'un mythe, d'une perspective à long terme qui sera réservée à de rares patients, dans des centres de haute technicité, très coûteux. Ce jugement est conforté par les échecs d'« essais thérapeutiques » qui, le plus souvent, n'en étaient pas, l'effet boomerang des annonces médiatiques disproportionnées avec les résultats et l'occultation des obstacles restant à franchir.

D'autres observent que les quinze dernières années ont engendré un mouvement scientifique d'une puissance inégalée en thérapeutique, initié par la recherche publique et amplifié par l'industrie pharmaceutique. Les optimistes estiment que dans quinze ans une part importante des dépenses de médicaments sera consacrée aux transferts de gènes car nous entrons dans la phase des essais cliniques réalistes et des applications étendues.

La mise en oeuvre de la thérapie génique sera-t-elle analogue dans le domaine thérapeutique, à l'irruption de la biologie moléculaire dans le domaine du diagnostic ? Il y a quinze ans, aucun laboratoire hospitalier ne la pratiquait. Aujourd'hui, ceux qui ne l'utilisent pas sont handicapés dans bien des domaines. En cette période charnière qu'abordent les transferts de gènes thérapeutiques, riche en critiques souvent justifiées [85], il importe de garder à l'esprit qu'il ne s'agit pas d'une thérapeutique tout ou rien, mais d'une méthodologie naissante, rapidement évolutive, qui atteindra l'état adulte dans vingt ans, après un enrichissement progressif de la « vectorologie », gène après gène et maladie après maladie. Gardons les bons caps et souquons fermement *

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