Déficit en G6PD : pathologie moléculaire

ARTICLE

Le déficit en glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6PD) érythrocytaire fut identifié grâce à l'accumulation de travaux destinés à comprendre le mécanisme de l'anémie induite par l'administration de la 8 aminoquinoléine dans le traitement du paludisme.
Alors qu'au départ le déficit en G6PD était supposé être occasionné par une anomalie unique, il est bien vite apparu que la sévérité du déficit enzymatique variait d'un groupe ethnique à l'autre et que les propriétés biochimiques de l'enzyme manifestaient des différences selon le groupe ethnique où elles étaient étudiées. Depuis 1960, plus de 400 variants de G6PD, supposés être différents sur des critères biochimiques, ont été décrits. Les clonages respectifs de l'ADNc et du gène [1] ont permis une vision entièrement nouvelle de ce polymorphisme.
Cette revue résume ce qui a trait aux variations de la G6PD chez l'homme, et se focalise sur les progrès récents des connaissances acquises par l'étude du gène, en ce qui concerne plus particulièrement les aspects de génétique de population et du diagnostic des déficits. Des revues récentes, plus détaillées peuvent être consultées à propos des aspects cliniques ou autres du déficit en G6PD
[2-4].
Le monomère de G6PD est constitué de 515 acides aminés et a une masse moléculaire calculée de 59 256 d. La forme enzymatique active est un homodimère liant fortement du NADP.
La transformation des monomères inactifs en enzyme dimérique actif ne peut survenir en l'absence de NADP [5]. La liaison du NADP semble être impliquée à la fois comme élément de structure et comme un des substrats de la réaction catalysée.
La G6PD catalyse la première réaction de la voie des hexoses monophosphate (VHM). Elle oxyde le glucose-6-phosphate en 6 phosphogluconolactone, par couplage avec la réduction du NADP en NADPH, voir figure.
Le VHM est la seule source de NADP pour les globules rouges et elle fournit aussi le ribose nécessaire à la voie de recyclage de la synthèse des nucléotides. Le rôle principal de la VHM semble être de participer à la protection des globules rouges contre les dégradations oxydatives. La glutathion peroxydase (GSH Px) réduit les peroxydes dans les globules rouges. Le glutathion réduit (GSH) sert de substrat de cette enzyme et, comme le NADPH est le coenzyme nécessaire à la réduction du glutathion oxydé et des groupements thiols oxydés des protéines, c'est un substrat essentiel des séquences de réaction qui composent le système de défense des érythrocytes contre les peroxydes.
La catalase a la propriété de se lier très fortement au NADPH [6] et sa forme inactive, le composé II, est réactivée par le NADPH. On voit que l'activité de la VHM permet l'élimination des peroxydes non seulement par le maintien de l'activité de la GSH Px, mais aussi en activant la catalase [6].
Le K_m de la liaison G6PD-NADP est très bas, de l'ordre de 2 à 4 µM, et l'enzyme est fortement inhibée, de façon compétitive par le NADPH.
Dans les globules rouges, c'est donc le rapport de concentration [NADPH]/[NADP] qui contrôle l'activité enzymatique G6PD de façon automatique.

Les mutations

La caractérisation biochimique avait abouti à la description d'au moins 451 variants, supposés distincts. Deux cent quatre-vingt-dix-neuf d'entre eux avaient été analysés selon les méthodes recommandées par un groupe d'experts OMS [7] et avaient été considérés, au moins par les responsables de leur description, comme différents des autres variants décrits dans les publications.
En partant de la constatation que la plupart des mutants avaient des propriétés électrophorétiques et/ou cinétiques anormales, la prédiction pouvait être faite que les mutations géniques seraient observées dans les séquences codantes. Ce fut en effet le cas.

Répartition et nature des mutations

Au moment d'écrire cette revue, 65 mutations, seules ou combinées, de la G6PD ont été caractérisées (tableau). Toutes, sauf une, sont associées à un déficit enzymatique. La variété des mutations observées est moins grande que ce qui a pu être décrit pour d'autres gènes.
Il semble qu'un déficit complet en G6PD est létal. C'est pourquoi la plupart des mutations sont ponctuelles et entraînent une substitution.
Les délétions, dont trois sont connues, sont des multiples de trois nucléotides, ce qui ne produit pas de décalage de lecture. Une mutation d'épissage et une mutation produisant un codon d'arrêt sont connues ; la dernière à l'état hétérozygote chez une femme.
La distribution des mutations dans la séquence de l'ADNc ne se fait pas au hasard. Les mutations ponctuelles qui aboutissent à la synthèse de variants de classe I, ceux qui ont pour phénotype une anémie hémolytique chronique non sphérocytaire, sont retrouvées dans deux zones codantes, l'une est située dans la séquence codant pour le domaine putatif de liaison du NADP et l'autre dans celle de liaison du glucose-6-phosphate.
Les séquences 163 à 257 et 363 à 447 de la protéine sont impliquées dans respectivement 8 et 18 des 29 mutations ponctuelles qui sont associées à la production d'un variant de classe I (tableau).
Ce qui fait que 87 % de ces mutations sont présentes dans deux domaines qui ne représentent que 28 % du monomère polypeptidique.
Il est bien peu probable que la concentration des mutations dans ces deux zones qui occasionnent une hémolyse chronique soit due à une coïncidence. Le site de liaison du glucose-6-phosphate a été localisé à la lysine 205 qui interagit de façon compétitive avec le pyridoxal phosphate et le glucose-6-phosphate [8].
L'examen des variants qui ont une très faible affinité pour le NADP suggère que les lysine 386 et arginine 387 pourraient être le site de liaison pour un groupement phosphate du NADP [9]. Les mutants de classe I sont concentrés autour de ces deux sites.

Fréquence des mutations dans diverses populations

La fréquence du déficit en G6PD varie largement d'une population à l'autre. Chez les Noirs américains, la fréquence génique en question est de 0,10 à 0,11 [10].
Chez les juifs d'origine kurde [11], le déficit dit méditerranéen (563 T) atteint une fréquence de 0,70, ce qui occasionne vraisemblablement l'incidence la plus élevée qui puisse être observée dans toutes les populations.
En Grèce, par dépistage néonatal chez près de 1 200 000 individus, une fréquence génique de 0,045 a été observée [12]. Des fréquences élevées ont été également rapportées en Orient [13].
La capacité croissante à transposer les données précédentes en terme de mutations du gène G6PD a permis de mieux mesurer la complexité de certaines situations et d'en simplifier d'autres.
La forme G6PD A^- qui était supposée être une mutation singulière, homogène, est en fait le résultat cumulé de plusieurs mutations ponctuelles survenues sur un gène G6PD A⁺ (376 G). Dans la plupart des cas la seconde mutation est 202 A mais peut être aussi 968 C et 680 T (tableau). La mutation 202 A, créée par mutagenèse dirigée, ne peut à elle seule altérer le phénotype ; pour cela elle requiert la présence de la mutation 376 G, elle-même neutre lorsqu'elle est isolée [14]. Il est donc possible que les mutations nt 202, 680 et 968, n'auraient procuré aucun avantage sélectif vis-à-vis du paludisme si elles n'étaient apparues sur un gène G6PD avec la mutation 376 G. Il existe cependant deux mutations, 542 T et 1159 T, qui induisent un phénotype déficitaire en présence et en l'absence de la mutation 376 G.
Certaines mutations ont une dispersion géographique large. Par exemple, les G6PD A^- 202 A/376 G Méditerranéenne 563 T et Union 1360 T. Il faut alors se poser la question de savoir si elles représentent la survenue de mutations récurrentes à un site hypermutable du gène, ou s'il s'agit d'un événement mutationnel unique et dont la dispersion témoigne des mouvements de population. L'outil qui permet de résoudre cette question est l'existence de combinatoires de polymorphismes (haplotypes) sans traduction clinique.
La G6PD A⁺ est le prototype de ces polymorphismes, découvert depuis longtemps. On sait maintenant que cette mutation est A * G nt 376 de l'ADNc et est responsable de la mobilité électrophorétique accrue de l'enzyme. D'autres mutations silencieuses, car ne modifiant pas la séquence protéique, sont indiquées dans des revues [15, 16]. Ces polymorphismes ont permis de montrer que la G6PD A^- 202 A/376 G est probablement issue d'une origine unique, mais à l'opposé, que la G6PD Méditerranéenne 563 T, par exemple, est apparue de façon multiple et récurrente.
On peut utiliser ces polymorphismes silencieux pour étudier l'origine de groupes de cellules dans les domaines de l'embryologie ou en oncologie [17]. Comme le polymorphisme très commun nt 1311 est en région codante, il s'est révélé particulièrement utile à l'étude du lignage tumoral : en effet, l'isolement puis la quantification relative des allèles après RT PCR des ARN cellulaires de sujets hétérozygotes est un outil précieux dans ce domaine [18].

Le déficit en G6PD en tant que polymorphisme équilibré

L'incidence élevée du déficit en G6PD dans certaines populations suggère que ce déficit érythrocytaire confère un avantage sélectif en faveur des individus qui en sont porteurs. Il semble probable que cet avantage s'exerce comme une résistance accrue aux infestations à Plasmodium falciparum. Les arguments positifs pour cette hypothèse sont explicités dans une revue récente [19].

Diagnostic

La détection du déficit Mesure de l'activité G6PD érythrocytaire

La méthode de mesure de l'activité G6PD, relativement simple, consiste à quantifier la réduction du NADP en NADPH en présence de glucose-6-phosphate et de l'hémolysat. Au cours de la réaction, comme dans la cellule, le produit de la réaction, le 6 phosphogluconolactone, est converti en 6 phosphogluconate qui sert alors de substrat à la réaction catalysée par la 6 PGD.
En conséquence, deux moles de NADPH sont formées par une mole de glucose-6-phosphate consommée par la réaction et on voit que cette procédure analytique mesure en bloc les activités G6PD et 6PGD.
Bien que la mesure de l'activité G6PD isolée sans interférence avec un éventuel déficit en 6PGD soit mise au point depuis des années [20], cette approche n'a qu'un intérêt supplémentaire minime dans la détection du déficit en G6PD, dans la mesure où l'activité 6PGD n'est que rarement limitante, particulièrement chez les déficients en G6PD.

Chez les sujets masculins hémizygotes, même au cours d'une poussée hémolytique, comme on peut en rencontrer dans les enquêtes de populations, les méthodes de dépistage semi-quantitative ou qualitative sont parfaitement adaptées. Les tests basés sur la réduction de colorants telle que la décoloration du bleu de Crésyl brillant ont été utilisés de façon extensive. Mais ces techniques anciennes ont été quasi totalement remplacées par une étude de la fluorescence d'une tache de sang dans laquelle la génération de NADPH est détectée visuellement sous illumination UV [21].

La détection du déficit en G6PD chez les patients au cours d'une hémolyse aiguë

Si le diagnostic du déficit chez les sujets masculins en période intercritique peut être fait sans difficulté particulière, on ne peut écrire la même chose pour les patients examinés en pleine phase hémolytique et atteints d'une forme de déficit modéré (classe 3). En effet l'hémolyse porte sélectivement sur les hématies les plus âgées ; c'est ce qui se produit chez les patients qui ont un déficit du type A^-, et ceci sélectionne les hématies plus jeunes ayant une activité proche de la normale ; ainsi l'activité peut-elle être voisine de la normale chez les patients concernés.
Plusieurs approches différentes de ce problème peuvent être envisagées pour aboutir au diagnostic, malgré l'hémolyse.
La plus simple consiste à se contenter d'attendre 1 à 2 semaines, ou d'entreprendre l'étude familiale. On peut aussi appauvrir l'échantillon en réticulocytes après centrifugation. Les hématies les plus denses, bien que n'étant pas forcément les plus âgées comme cela a pu être cru, sont ainsi efficacement séparées des globules rouges très jeunes. Effectivement, des observations ont montré que même durant l'hémolyse la fraction dense des hématies a une activité G6PD déficiente [22].
Alternativement, on peut comparer l'activité G6PD à celle d'une autre enzyme érythrocytaire sensible à l'âge cellulaire comme l'hexokinase ou l'ASAT. De cette façon on a pu, par exemple, détecter les déficits A^- chez les patients drépanocytaires qui ont une population érythrocytaire dont l'âge moyen est très diminué.

La détection des hétérozygotes

La détection des hétérozygotes pour le déficit en G6PD pose des problèmes particuliers. L'inactivation du X fait que les hétérozygotes ont une double population érythrocytaire [23]. L'une des deux est faite de globules normaux, alors que l'autre est déficiente, autant que celle des sujets masculins hémizygotes pour le même type de déficit. Le plus souvent les populations des hématies normales et déficientes sont proches de 50 %. Mais chez certaines femmes hétérozygotes la plupart des hématies sont déficientes ou au contraire normales.
La mesure de l'activité rapportée par gramme d'hémoglobine donne un résultat qui reflète l'importance relative des populations d'hématies saines et déficientes chez le sujet étudié ; ce qui fait que pour certaines femmes hétérozygotes le résultat de la mesure d'activité serait normal et pour d'autres déficitaire. On voit que la mesure de l'activité enzymatique érythrocytaire ne permet pas une détection fiable de tous les hétérozygotes.
Une autre procédure, plus adaptée, consiste à déterminer l'activité enzymatique cellule par cellule comme cela est décrit dans la référence [24]. La sensibilité de cette méthode, qui permet d'identifier les hétérozygotes ayant seulement 5 à 10 % d'hématies normales ou pathologiques, n'est cependant pas assez bonne pour détecter ceux des hétérozygotes ayant encore moins de cellules, voire aucune, soit normales soit déficientes, en circulation.

Caractérisation de l'hétérozygotie par l'étude de l'ADN

La méthode la plus performante pour le diagnostic du déficit en G6PD chez les patients vus en période hémolytique ou après transfusion et chez les hétérozygotes consiste à détecter la mutation au niveau de l'ADN génomique, habituellement extrait des leucocytes circulants. Malgré les différences de méthylation qui accompagnent l'inactivation du chromosome X et contribuent à réduire la transcription du gène inactivé, la détection de la différence de séquence nucléotidique reste possible à condition de connaître la nature de la mutation recherchée.

Identification des variants de G6PD

En 1967, le comité des experts OMS formula la standardisation des méthodes de purification et de caractérisation biochimique des variants de G6PD [7], si bien que beaucoup d'investigateurs se lancèrent dans ce travail d'étude de différents variants. Au moment d'écrire cette revue, 451 variants réputés différents étaient portés à ma connaissance, alors que la notion de limitation des procédures biochimiques standard dans leurs capacités à bien différencier les variants était établie depuis longtemps ; en particulier les G6PD Cornell et Chicago avaient été montrées comme affectant deux membres d'une même grande famille [25].
Le développement des analyses fondées sur la PCR pour la détection de mutations connues de la G6PD a rendu possible et relativement aisé le diagnostic de déficit et celui de la mutation spécifique en cause. Des avantages secondaires de ces méthodes sont que l'échantillon d'ADN est plus stable que ne l'est la protéine enzymatique dans le sang, et que de plus petits volumes peuvent être suffisants pour l'analyse. On peut étudier les sites de restriction naturels [26] ou ceux créés par la technique utilisant des oligonucléotides modifiés [27, 28] mais aussi l'hybridation par des oligonucléotides spécifiques d'allèle [29]. Ces méthodes conviennent tout à fait à des applications telles que les enquêtes de population ou le traitement des prélèvements minimes de diagnostic prénatal [30]. La faiblesse de l'approche biochimique pour la caractérisation des déficits n'en est devenue que plus évidente.
Le tableau montre bien que de nombreux variants supposés distincts sur les bases de la biochimie se sont révélés identiques génétiquement.

Développements futurs

Depuis bientôt quarante ans que le déficit en G6PD a été identifié comme la cause de la réaction à la primaquine, des milliers d'articles portant sur les conséquences cliniques, la génétique de populations, les caractéristiques biochimiques et la génétique moléculaire ont été publiés. Quelles questions en rapport avec la pathologie moléculaire du déficit en G6PD doit-on encore résoudre ? Le raffinement de notre compréhension des relations entre la structure et la fonction de l'enzyme viendra de la confrontation de l'identification des multiples mutations naturelles et de leurs conséquences biochimiques. Pour aboutir dans ce domaine, il faudra obtenir la structure tridimensionnelle de l'enzyme ; plusieurs laboratoires se sont engagés dans ce projet.

REFERENCES

1. Martini G, Toniolo D, Vulliamy T, Luzzatto L, Dono R, Viglietto G, Paonessa G, D'Urso M, Persico MG. Structural analysis of the X-linked gene encoding human glucose-6-phosphate dehydrogenase. EMBO J 1986 ; 5 : 1849-55.

2. Beutler E. G6PD deficiency. Blood 1994 ; 84 : 3613-26.

3. Luzzatto L, Mehta A. Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency. In : Scriver CR, Beaudet A, Sly WS, Valle D, eds. The metabolic basis of inherited disease. New York : McGraw-Hill Information Services Co. 1990 ; 2237-65.

4. Arese P, De Flora A. Denaturation of normal and abnormal erythrocytes II. Pathophysiology of hemolysis in glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency. Semin Hematol 1990 ; 27 : 1-40.

5. Kirkman HN, Hendrickson EM. Glucose-6-phosphate dehydrogenase from human erythrocytes II. Subactive states of the enzyme from normal persons. J Biol Chem 1962 ; 237 : 2371-6.

6. Kirkman HN, Galiano S, Gaetani GF. The function of catalase-bound NADPH. J Biol Chem 1987 ; 262 : 660-6.

7. Betke, Beutler E, Brewer GJ, Kirkman HN, Luzzatto L, Motulsky AG, Ramot B, Siniscalco M. Standardization of procedures for the study of glucose-6-phosphate dehydrogenase. Report of a WHO scientific group. WHO Tech Rep Ser 1967 ; No. 366.

8. Camardella L, Caruso C, Rutigliano B, Romano M, Di Prisco G, Descalzi-Cancedda F. Human erythrocyte glucose-6-phosphate dehydrogenase : identification of a reactive lysyl residue labelled with pyridoxal 5'-phosphate. Eur J Biochem 1988 ; 171 : 485-9.

9. Hirono A, Kuhl W, Gelbart T, Forman L, Fairbanks VF, Beutler E. Identification of the binding domain for NADP⁺ of human glucose-6-phosphate dehydrogenase by sequence analysis of mutants. Proc Natl Acad Sci USA 1989 ; 86 : 10015-7.

10. Heller P, Best WR, Nelson RB, Becktel J. Clinical implications of sickle-cell trait and glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency in hospitalized black male patients. N Engl J Med 1979 ; 300 : 1001-5.

11. Oppenheim A, Jury CL, Rund D, Vulliamy TJ, Luzzatto L. G6PD Mediterranean accounts for the high prevalence of G6PD deficiency in Kurdish Jews. Hum Genet 1993 ; 91 : 293-4.

12. Missiou-Tsagaraki S. Screening for glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency as a preventive measure : prevalence among 1 286 000 Greek newborn infants. J Pediatr 1991 ; 119 : 293-9.

13. Panich V. G6PD variants in southern Asian populations. In : Yoshida A, Beutler E, eds. Glucose-6-phosphate dehydrogenase. Orlando, FL : Academic Press, Inc 1986 ; 195-241.

14. Town M, Bautista JM, Mason PJ, Luzzatto L. Both mutations in G6PD A^- are necessary to produce the G6PD deficient phenotype. Hum Mol Genet 1992 ; 1 : 171-4.

15. Vulliamy TJ, Othman A, Town M, Nathwani A, Falusi AG, Mason PJ, Luzzatto L. Polymorphic sites in the African population detected by sequence analysis of the glucose-6-phosphate dehydrogenase gene outline the evolution of the variant A and A^-. Proc Natl Acad Sci USA 1991 ; 88 : 8568-71.

16. Kay AC, Kuhl W, Prchal JT, Beutler E. The origin of G6PD polymorphisms in Afro-Americans. Am J Hum Genet 1992 ; 50 : 394-8.

17. Fialkow PJ. The origin and development of human tumors studied with cell markers. N Engl J Med 1974 ; 291 : 26-35.

18. Curnutte JT, Hopkins PJ, Kuhl W, Beutler E. Studying X-inactivation. Lancet 1992 ; 339 : 749.

19. Greene LS. G6PD deficiency as protection against falciparum malaria : an epidemiologic critique of population and experimental studies. Yearbook of Physical Anthropology 1993 ; 36 Suppl. 17 : 153-78.

20. Beutler E. Red cell metabolism : a manual of biochemical methods. New York, NY : Grune & Stratton, Inc. 1984.

21. Beutler E, Blume KG, Kaplan JC, Löhr GW, Ramot B, Valentine WN. International committee for standardization in haematology : recommended screening test for glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) deficiency. Br J Haematol 1979 ; 43 : 465-76.

22. Ringelhahn B. A simple laboratory procedure for the recognition of A^- (African type) G6PD deficiency in acute haemolytic crisis. Clin Chim Acta 1972 ; 36 : 272-4.

23. Beutler E, Yeh M, Fairbanks VF. The normal human female as a mosaic of X-chromosome activity : studies using the gene for G6PD deficiency as a marker. Proc Natl Acad Sci USA 1962 ; 48 :9-16.

24. Fairbanks VF, Fernandez MN. The identification of metabolic errors associated with hemolytic anemia. JAMA 1969 ; 208 : 316-20.

25. Fairbanks VF, Nepo AG, Beutler E, Dickson ER, Honig G. Glucose-6-phosphate dehydrogenase variants : reexamination of G6PD Chicago and Cornell and a new variant (G6PD Pea Ridge) resembling G6PD Chicago. Blood 1980 ; 55 : 216-20.

26. Hirono A, Beutler E. Molecular cloning and nucleotide sequence of cDNA for human glucose-6-phosphate dehydrogenase variant A^-. Proc Natl Acad Sci USA 1988 ; 85 : 3951-4.

27. Kurdi-Haidar B, Mason PJ, Benrebi A, Ankra-Badu G, Al-Ali A, Oppenheim A, Luzzatto L. Origin and spread of the glucose-6-phosphate dehydrogenase variant (G6PD-Mediterranean) in the Middle East. Am J Hum Genet 1990 ; 47 : 1013-9.

28. Chang JG, Chiou SS, Pemg LL, Chen TC, Lui TC, Lee LS, Chen PH, Tang TK. Molecular characterization of glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) deficiency by natural and amplification created restriction sites : five mutations account for most G6PD deficiency case in Taiwan. Blood 1992 ; 80 : 1079-82.

29. Hsia YE, Miyakawa F, Baltazar J, Ching NSP, Yuen J, Westwood B, Beutler E. Frequency of glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) mutations in Chinese, Filipinos, and Laotians from Hawaii. Hum Genet 1993 ; 92 : 470-6.

30. Beutler E, Kuhl W, Fox M, Tabsh K, Crandall BF. Prenatal diagnosis of glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) deficiency. Acta Haematol (Basel) 1992 ; 87 : 103-4.