Transplantation de cellules hématopoïétiques humaines in vivo. III - Qu’attendre du modèle de transplantation par voie intraveineuse chez les souris NOD-SCID ?

Intérêt des modèles d'étude in vivo de l'hématopoïèse humaine ?

L'analyse de la reconstitution hématopoïétique in vivo après transplantation de cellules hématopoïétiques est le seul test capable de démontrer sans ambiguïté l'existence dans le greffon de cellules totipotentes² dont l'activité persiste in vivo plusieurs mois³. Le transfert à une souris irradiée de cellules souches murines génétiquement marquées a révélé que la reconstitution à long terme est généralement oligoclonale, et que l'activité des clones peut fluctuer dans le temps [1]. Il semble aussi que les cellules primitives puissent contribuer non seulement à la reconstitution à long terme mais aussi à la reconstitution à court terme [2,3], ce qui devra être confirmé. Le comportement des cellules souches humaines après transplantation à l'homme est probablement très similaire, mais son analyse se heurte à l'absence d'un modèle expérimental. Une telle analyse pouvait apparaître comme sans grand intérêt pratique tant que les greffons (moelle ou cytaphérèse) n'étaient soumis à aucun traitement ex vivo, mais la généralisation de l'utilisation de certaines cytokines en thérapeutique, et le développement des techniques de « thérapie cellulaire », en particulier celles dont le but est d'accroître le nombre de cellules souches transplantables, rendent souhaitable l'évaluation de l'innocuité et de l'efficacité de ces approches. Aucun des tests in vitro classiques (test de colonies identifiant les CFC, culture à long terme identifiant les LTC-IC⁴) ne permet d'évaluer le compartiment des cellules souches primitives, prises au sens strict du terme, c'est-à-dire responsables de la reconstitution à long terme, ce qui justifie les efforts de mise au point d'un modèle animal.

Dans une perspective d'évaluation de protocoles précliniques, un modèle de transplantation autologue chez le primate (singe) est certainement d'évaluation à long terme plus facile, et les observations plus directement extrapolables à la situation humaine que le modèle des souris immunodéficientes, même si celui-ci est très précieux pour une approche plus fondamentale.

En effet, un obstacle immédiat à l'évaluation de la reconstitution de l'hématopoïèse humaine chez l'animal est que donneur et receveur sont de races différentes (et souvent de taille différente !). Pour tolérer une greffe xénogénique, l'animal receveur doit donc avoir un déficit immunologique profond, ce qui est réalisé soit pendant la période fœtale, soit s'il existe un déficit immunologique constitutionnel. Dans un article publié précédemment dans Hématologie, Zanjani décrit son expérience de greffe de cellules humaines à des fœtus de mouton [Hématologie, 1996 ; 2 : 487-98], réalisant chez l'animal adulte un chimérisme persistant au-delà de deux ans, avec même possibilité de greffe des cellules humaines issues du receveur primaire à un receveur secondaire. Malgré les nombreux avantages qu'offrent ces animaux (durée de vie prolongée, taille plus proche de celle de l'homme, possibilité de prélèvements itératifs), peu de laboratoires ont accès à un élevage de moutons et une alternative plus réaliste consiste à utiliser des souris porteuses d'un déficit immunitaire constitutionnel.

Les premières expériences utilisant des souris SCID⁵ et réalisées par Mosier en 1988 avaient pour but l'analyse des fonctions immunitaires humaines in vivo, après injection intrapéritonéale de cellules immunocompétentes. Il s'agissait du transfert transitoire de cellules matures fonctionnelles et non pas de l'implantation de progéniteurs actifs pendant plusieurs mois [4].

Des tentatives de greffe véritable de progéniteurs myéloïdes humains à des souris immunodéficientes ont été réalisées cette même année 1988 par deux stratégies totalement différentes : 1) le groupe de J. McCune [5] implantait des fragments de tissus lympho-hématopoïétiques fœtaux humains (thymus et foie initialement, puis os secondairement) sous la capsule rénale, dans le péritoine ou sous la peau de souris SCID. Ces tissus humains se vascularisent et on peut y analyser, plusieurs mois après, le développement des progéniteurs hématopoïétiques endogènes, ou de progéniteurs allogéniques qui peuvent y être implantés [6]. 2) Le groupe de J. Dick optait pour un protocole de transplantation classique par voie intraveineuse, avec évaluation de la prise de greffe sur la proportion de cellules humaines détectée dans la moelle des souris 4 à 5 semaines plus tard. Deux paramètres distinguent le modèle de J. Dick de celui de J. McCune : l'absence de micro-environnement humain et la nécessité d'une étape de migration. Le modèle de J. McCune a été développé par B. Péault dans un numéro antérieur [Hématologie, 1997 ; 3 : 299-307], et l'objectif de cette revue est de discuter la signification du modèle de J. Dick maintenant largement utilisé en hématologie expérimentale.

Quelles souris immunodéficientes utiliser ?

De nombreuses souches de souris dont le déficit immunitaire est soit constitutionnel soit acquis (souris knock-out ou transgéniques pour des régulateurs essentiels du développement immunitaire) acceptent les greffes de cellules humaines. Les souris CB-17 SCID [7] et les souris NIH Beige-Nude-Xid (appelées souris BNX, homozygotes pour les gènes bg, nu et Xid) se caractérisent par une absence de cellules T et B matures à laquelle s'associe une diminution des activités NK⁶ et LAK⁷ pour les souris BNX. Ces deux souches de souris ont été très utilisées jusqu'en 1995, mais tendent à être remplacées maintenant par la souche non-obese-diabetic/LtSz-SCID (appelées souris NOD-SCID), qui résulte du croisement de souris SCID et de souris de fond génétique NOD/Lt. Le déficit immunitaire des souris NOD-SCID est plus sévère que celui des SCID en raison d'une altération de l'immunité naturelle médiée par les cellules NK, le complément et les macrophages. Ce déficit immunitaire prévient le développement du diabète insulino-dépendant qui caractérise la souche NOD/Lt [8]. Les souris invalidées pour le récepteur de l'IL-7, pour Rag ou pour la b2-microglobuline sont aussi des receveurs potentiels. Mais la présence d'un déficit immunitaire sévère chez le receveur n'est pas un gage de succès, et par exemple, les souris Rag2^­/­, ou beige/SCID ne permettent pas le développement de cellules hématopoïétiques humaines [9]. Le fond génétique des souris influence aussi le profil de différenciation des cellules humaines : l'environnement bg/nu/xid, au contraire de celui des souris SCID et NOD-SCID, ne permet pas un développement efficace de la lignée lymphoïde B humaine [10].

Stratégie expérimentale et contraintes du modèle murin

La stratégie de greffe est identique quels que soient la source et le phénotype des cellules hématopoïétiques humaines : l'injection se fait par voie intraveineuse à des souris irradiées la veille à faible dose (300-400 rads) en raison de la sensibilité particulière à l'irradiation des souches SCID/NOD-SCID [11, 12]. Dans cette situation xénogénique, l'irradiation du receveur n'a pas pour but d'abroger l'hématopoïèse murine endogène, mais de réduire la cellularité médullaire pour faciliter l'implantation des cellules humaines [9]. En effet, dans les modèles murins de transplantation, donneur et receveur sont de même race et immunologiquement identiques (syngénie), et le système hématopoïétique du donneur se substitue à celui du receveur, détruit par une irradiation létale. En situation xénogénique, l'objectif est de créer un chimérisme dans les compartiments de progéniteurs immatures, mais il serait irréaliste de penser remplacer l'ensemble du système hématopoïétique du receveur (souris) par celui du donneur (homme). Non seulement la maturation terminale des cellules humaines se fait mal, mais il serait surprenant que les polynucléaires, les globules rouges et les plaquettes humaines fonctionnent correctement dans les souris immunodéficientes.

Deux autres aspects distinguent le modèle de J. Dick de celui de J. McCune : 1) La nécessité pour les cellules humaines, injectées par voie intraveineuse, de migrer jusqu'aux os et d'y coloniser les logettes hématopoïétiques. Cette étape de homing introduit un biais très important sur lequel nous reviendrons. 2) Les cellules humaines se développent dans un environnement médullaire murin, alors que dans le modèle de McCune, le tissu environnant est humain. De façon surprenante, mais cohérente avec les données in vitro, l'environnement murin in vivo n'est pas un obstacle à l'implantation d'une hématopoïèse humaine active.

Enfin, un élément fondamental de la réussite des greffes xénogéniques est la qualité de l'élevage de ces souris particulièrement fragiles, élevées et manipulées dans des conditions stériles, le meilleur critère de qualité étant la résistance des animaux à une irradiation de 4 Gys.

Phénotype et fonction des cellules hématopoïétiques humaines qui se développent dans la moellen des souris immunodéficientes

Dans les expériences initiales, faites en injectant des cellules mononucléées de moelle osseuse adulte humaine à des souris BNX, la proportion de cellules humaines n'excédait pas 1 % des cellules médullaires [11]. Depuis, plusieurs éléments essentiels ont contribué, au cours de ces dix dernières années, à l'amélioration du modèle :

1) L'utilisation de souris CB-17 SCID, puis NOD-SCID qui s'avèrent de meilleurs receveurs que les souris BNX.

2) L'administration aux souris SCID de cytokines humaines, justifiée par l'efficacité faible, voire nulle, de certaines cytokines murines sur les cellules humaines, a amélioré de façon spectaculaire le chimérisme [12]. Depuis la généralisation de l'utilisation de receveurs NOD-SCID, l'apport de cytokines n'est plus indispensable, sauf peut-être pour les transplantations secondaires [9, 13].

3) L'utilisation de cellules fœtales ou de sang de cordon [14, 15], dont tous les auteurs reconnaissent la supériorité par rapport aux cellules adultes (moelle ou cytaphérèses) confirme les observations faites in vitro. Pour cette raison nous analyserons en détail les études utilisant des cellules fœtales, et nous mentionnerons à la fin les particularités et les difficultés relatives à l'utilisation de cellules provenant de tissus adultes.

Comment estimer la prise de greffe ?

Le critère le plus communément utilisé est la proportion de cellules humaines dans la moelle extraite des quatre os longs (deux fémurs et deux tibias) des souris, déterminée soit 4 à 5 semaines (court terme) après la greffe, soit au-delà de 4 mois (long terme). Les cellules humaines sont distinguées des cellules murines par leur expression d'antigènes humains, CD45 ou HLA-I, détectée en cytométrie de flux, ou par la présence de séquences humaines dans le génome (Southern blot ou PCR⁸). Même si des cellules humaines sont souvent détectées dans la rate et le sang périphérique [9, 13, 16], seules les cellules médullaires sont prises en compte dans l'appréciation quantitative de la prise de greffe. On admet qu'il y a prise de greffe (ou que la souris est « positive ») lorsque >= 0,1 % des cellules isolées de la moelle des souris médullaires sont humaines, sur des critères immunologiques ou après analyse génomique. En dessous de cette limite de 0,1 % (qui correspond à environ 20 000 cellules humaines pour quatre os longs), la présence de cellules humaines ne peut pas être affirmée avec certitude. Le critère de positivité varie selon les laboratoires : dans notre laboratoire nous avons fixé la limite à 0,3-0,5 % de cellules CD45⁺, d'autres exigent la présence simultanée de lymphocytes B (CD34^­ CD19⁺) et de progéniteurs myéloïdes (CD34⁺CD19^­ ± présence de CFC) pour affirmer la prise de greffe, d'autres acceptent une limite de 0,1 % d'ADN humain (estimé par rapport à une gamme étalon).

Lorsqu'on injecte plus de 10 000 cellules CD34⁺ de sang de cordon (ou au moins 5 x 10⁶ cellules mononucléées), il est habituel que 100 % des souris soient « positives », cette proportion étant d'environ 50 % pour 5 000 cellules CD34⁺ injectées ; mais l'implantation de cellules humaines peut être détectée même si seulement 1 000 cellules CD34⁺ sont injectées (voir ci-dessous). En revanche, pour un même nombre de cellules injectées, provenant de la même suspension cellulaire, la proportion de cellules humaines détectée dans la moelle des receveurs peut varier de 0,5 à 80 %. Cette hétérogénéité, probablement d'origine multifactorielle et incontrôlable expérimentalement, est un des inconvénients majeurs de ce modèle in vivo (figure 1) et rend difficile toute comparaison de la fonction de reconstitution in vivo de deux greffons, jugée sur la seule proportion de cellules humaines, du moins 5 semaines après la greffe. Il semble en effet que cette variabilité soit moindre si l'analyse est faite 4 mois après la greffe [Pflumio, observations personnelles] (figure 1). Cette hétérogénéité impose non seulement d'utiliser un grand nombre d'animaux, mais aussi de développer un test plus quantitatif (voir ci-dessous).

Les cellules de moelle adulte (ou de cytaphérèse) s'implantent beaucoup moins efficacement, puisqu'il faut injecter de 100 000 à 500 000 cellules CD34⁺ de l'une ou l'autre source (ou 5 x 10⁷ cellules mononucléées) pour obtenir le développement d'une hématopoïèse humaine significative dans au moins 50 % des animaux.

Caractéristiques phénotypiques des cellules humaines

L'analyse phénotypique des tissus hématopoïétiques de souris SCID ou NOD-SCID greffées avec des cellules de sang de cordon (ou de moelle fœtale) quel qu'en soit le phénotype (mononucléées, fractions CD34⁺ ou CD34⁺CD38^­) révèle plusieurs constantes :

La plus frappante est la prédominance de la lignée lymphoïde B (tableau, figure 2). Ainsi, dans la moelle des souris, au moins 50 % des cellules humaines sont des précurseurs lymphoïdes B (CD19⁺) et toutes les étapes du développement B sont représentées, du stade proB CD34⁺CD19⁺ aux cellules B matures sIgM⁺ [13, 14, 16, 17]. Cela est vrai aussi lorsque le greffon a été préalablement déplété de toute cellule CD19⁺ et/ou CD10⁺ démontrant qu'il s'agit bien de la différenciation de progéniteurs plus immatures, et non de la survie de précurseurs B déjà engagés [13, 18]. Il faut souligner la richesse de la rate en précurseurs lymphoïdes matures (CD20⁺, CD22⁺, sIgM⁺), les précurseurs immatures (CD34⁺CD19⁺sIgM^­) étant localisés surtout dans la moelle, ce qui suggère qu'ils migrent vers les organes lymphoïdes secondaires pour compléter leur maturation [13, 19].

Contrairement à celle des précurseurs B, la différenciation terminale des précurseurs granuleux et érythroïdes est très incomplète, et le reste même après administration de cytokines humaines [20]. Ceci pourrait expliquer l'enrichissement relatif en cellules CD34⁺ dont la proportion dépasse souvent 20 %, ce qui est très supérieur aux 0,5-1 % de CD34⁺ présents dans l'inoculum (lorsqu'il s'agit de sang de cordon). Cependant, la majorité des cellules humaines CD34⁺ (80 % en moyenne) sont des précurseurs pro-B, et co-expriment les antigènes CD38, CD10 et CD19, et seule la fraction CD34⁺CD19^­ (15-20 % des CD34⁺) reflète le compartiment des progéniteurs myéloïdes précoces. Parmi ces cellules CD34⁺CD19^­, 2 à 5 % sont CD38^±/neg, et une proportion identique est Thy1⁺ (figure 3) [Pflumio, Robin, soumis]. Le phénotype de ces deux fractions suggère l'existence de progéniteurs primitifs, ce que confirment les tests fonctionnels (voir ci-dessous).

Une troisième caractéristique de ce modèle est l'absence de lymphocytes T et de cellules NK matures (tableau, figure 2). L'origine des cellules CD3⁺ détectées dans la moelle des souris BNX transplantées avec des cellules CD34⁺ de moelle humaine adulte est incertaine [21]. Cette absence de lymphocytes T ne peut être interprétée qu'après injection de cellules CD34⁺ débarrassées de tout contaminant lymphocytaire mature. En effet, l'absence de déplétion des lymphocytes T du greffon entraîne une infiltration massive des tissus murins par les lymphocytes T humains qui rend ininterprétable la prise de greffe [22 ; Tourino, Pflumio, observations non publiées]. Trois raisons peuvent expliquer cette absence de différenciation lymphocytaire T : l'implantation de progéniteurs dépourvus de potentiel lymphoïde T ou NK, l'incapacité des micro-environnements thymique et médullaire de la souris à assurer une différenciation lymphocytaire T et NK respectivement, l'incapacité des progéniteurs médullaires à migrer secondairement vers le thymus. Nous avons exclu la première hypothèse, et en partie la seconde, en démontrant que des cellules CD34⁺ humaines issues de la moelle de souris NOD-SCID pouvaient se différencier in vitro en lymphocytes CD4⁺CD8⁺ dans un système FTOC ⁹ [23, 24 et Robin, Pflumio, soumis pour publication] et en cellules NK. Si le peu d'efficacité des cytokines IL-2 et IL-15 nécessaires à la maturation NK explique l'absence de ces cellules, en revanche un défaut de migration est plus probablement responsable de l'absence de la lignée T : nous avons en effet montré que le thymus NOD-SCID embryonnaire permettait la maturation de précurseurs T humains [23], mais il est très rare d'observer spontanément, après greffe de cellules CD34⁺, une colonisation du thymus NOD-SCID murin in situ [13]. En revanche, l'injection aux souris de G-CSF¹⁰ et de SCF¹¹ après la greffe induit la production de cellules CD4⁺CD8⁺, peut-être en facilitant la « mobilisation » des progéniteurs humains [19]. Des progéniteurs humains issus de la moelle murine peuvent aussi coloniser un fragment thymique humain greffé secondairement sous la capsule rénale [16]. Ces deux études suggèrent que l'altération des processus normaux de migration explique en partie l'absence in vivo de précurseurs lymphocytaires. S'y associe la faible efficacité des processus de sélection intrathymique par les cellules stromales murines qui compromet la production de cellules T fonctionnelles in vivo. Si ces données se confirment, on peut imaginer dans l'avenir lever l'obstacle que constitue, dans ce modèle, l'absence de développement in vivo de cellules immunocompétentes en stimulant la migration cellulaire et en utilisant des souris NOD-SCID transgéniques pour les molécules HLA de classe I et II humaines.

Caractéristiques fonctionnelles des progéniteurs hématopoïétiques présents dans la moelle des souris NOD-SCID

Si la maturation hématopoïétique terminale est très incomplète, en amont, en revanche, on détecte l'ensemble des progéniteurs hématopoïétiques organisés selon la hiérarchie classique. Ainsi, les tests in vitro détectent, dans la moelle des souris NOD-SCID transplantées avec des cellules humaines, des CFC (CFU-GM¹², BFU-E¹³ et CFU-GEMM¹⁴) et des LTC-IC. Leur fréquence est de 50-60 CFU-GM et 10-20 BFU-E/5 x 10⁴ cellules humaines [16, 20], identique à celle du tissu originel. En revanche, la fréquence de CFC (1/50-100) et LTC-IC (1/300) au sein de la population de cellules CD34⁺ est anormalement basse, ce qui s'explique par l'inflation du compartiment pro-B CD34⁺CD19⁺ dans les souris NOD-SCID (voir ci-dessus). L'analyse de la fraction CD34⁺CD19^­ serait certainement un indicateur plus fiable de la reconstitution myéloïde [16, 17]. à titre indicatif, environ 40-100 000 CFC et 200-1 000 LTC-IC sont détectées dans la moelle des quatre os longs d'une souris injectée 4-6 semaines auparavant avec des cellules de sang de cordon, ce qui représente une amplification de 100 à 1 000 fois du nombre de ces cellules [13, 20]. Le rapport du nombre des CFC/nombre de LTC-IC est de 10-100, proche de ce qu'il est dans la moelle humaine normale ou le sang de cordon [17], suggérant que la transition LTC-IC-CFC s'effectue normalement dans l'environnement médullaire murin en l'absence de cytokines humaines [9]. Rappelons que ces chiffres sont sous-estimés puisque les quatre os longs analysés (deux fémurs et deux tibias) ne contiennent que 20 % du tissu médullaire total de la souris.

La seule présence de CFC et de LTC-IC 5 semaines après la greffe ne prouve cependant pas l'implantation de cellules
« souches ». Ceci requiert de démontrer 1) la multipotence à l'échelon clonal des cellules implantées, et idéalement leur capacité à reconstituer un receveur secondaire, 2) leur activité à long terme. De quels arguments expérimentaux dispose-t-on ?

1) Nos propres études nous ont permis de démontrer que la fraction CD34⁺CD19^­ humaine isolée de la moelle des souris contient des progéniteurs capables, in vitro, de différenciation T (dans un système FTOC), mais aussi NK (co-culture en présence de cellules stromales et d'IL-15). L'identification dans cette fraction de progéniteurs « myélo-lymphoïdes » (LTC-IC_ML), produisant à l'échelon individuel, des lymphocytes B et des cellules granuleuses [18], et comme nous l'avons montré récemment, de cellules capables de produire simultanément des lymphocytes T, B, NK et des cellules granuleuses [Robin, Pflumio, Coulombel, soumis] prouve la présence, dans la fraction CD34⁺ issue de la moelle des souris NOD-SCID, de cellules totipotentes. Une déduction logique de ces données est qu'il existe dans le sang de cordon des cellules souches transplantables capables de reconstituer dans un environnement murin, et en l'absence de cytokines humaines exogènes, une hiérarchie hématopoïétique complète, y compris probablement un compartiment de cellules souches totipotentes primitives.

2) L'analyse de la cinétique d'implantation des cellules humaines chez la souris apporte deux informations importantes (figure 4) : seule une toute petite fraction (0,1-1 %) des cellules injectées s'implante dans la moelle des souris [9, 20]. Dans notre expérience aussi, 24-48 heures après la greffe de 100-500 000 cellules CD34⁺, environ 500 seulement sont détectées dans la moelle des souris. En revanche, au cours des 5 semaines qui suivent la greffe, certaines de ces cellules prolifèrent de façon spectaculaire puisque le nombre de cellules CD34⁺, CD34⁺Thy-1⁺, de CFC et de LTC-IC est multiplié par 8-10, 4-5, 8-10 respectivement [20] (figure 4). Cette amplification est environ deux fois moindre lorsque des cellules de moelle adulte sont injectées. La persistance pendant plus de 4 mois (jusqu'à 24 mois dans une étude) d'un nombre élevé de progéniteurs humains en phase proliférative témoigne d'une hématopoïèse active [20]. En revanche, l'injection à des receveurs secondaires des cellules humaines isolées de la moelle des receveurs primaires est moins efficace [13, 20], ce qui va à l'encontre de ce que l'on attendrait d'une cellule primitive, mais peut-être se heurte-t-on à un problème de migration (voir ci-dessous).

Une cinétique identique se voit après injection de cellules de moelle osseuse humaine, à ceci près que l'hématopoïèse humaine semble s'épuiser au-delà de 8 semaines, ce dont témoigne la diminution du nombre des cellules nucléées, des CFC et des LTC-IC, et surtout leur quiescence [20].

Il est donc acquis qu'une fraction de progéniteurs humains très immatures colonise la moelle des souris, y prolifère et s'y différencie efficacement. Le micro-environnement murin (ou ovin) ne semble donc pas compromettre le déroulement des premières étapes de l'hématopoïèse humaine. Cela peut paraître surprenant puisque beaucoup des cytokines murines ne sont pas actives chez l'homme (IL-2, IL-3, GM-CSF, IL-6) ou le sont à des concentrations très élevées (Epo¹⁵, SCF, IL-7), ce qui suggère l'intervention d'autres molécules stromales, ou une production endogène de cytokines humaines, ce d'autant que l'administration de cytokines humaines aux souris NOD-SCID ne modifie pas de façon majeure les caractéristiques de la prise de greffe, du moins à court terme, et peut même être délétère [25]. En revanche, les cytokines faciliteraient l'activité des progéniteurs humains au-delà de 4 mois [9], et leur transplantation à des receveurs secondaires. Il faut souligner cependant que ces conclusions ne sont pas extrapolables à d'autres souches de souris, et que les greffons de tissus fœtaux sont moins dépendants de la présence d'une source de cytokines humaines que les cellules adultes.

Néanmoins, comment interpréter les résultats ci-dessus dans une perspective clinique ? 1) Quelle est la filiation entre les cellules humaines responsables de la production de cellules hématopoïétiques dans la souris, les cellules souches responsables des prises de greffe en transplantation humaine, et les LTC-IC identifiées in vitro ? 2) Y a-t-il une corrélation entre le test NOD-SCID et les résultats cliniques ? La réponse à ces questions ne pourra être obtenue que par la comparaison des propriétés biologiques et des fréquences de ces cellules et par l'analyse individuelle des clones contribuant à la reconstitution.

Caractérisation des cellules humaines à l'origine de développement d'une hématopoïèse active dans les souris NOD-SCID

La fréquence des NOD-SCID-RC/CRU dans le sang de cordon est de l'ordre de 1/0,5-1 x 10⁶ cellules mononucléées (soit 1-3 CRU par ml de sang), 1/1 000 cellules CD34⁺CD38^­ de sang de cordon [26, 27] (figure 5). La fréquence des cellules ayant une fonction identique dans la moelle osseuse (ou le sang périphérique après mobilisation) est beaucoup plus faible, 1/3 x 10⁶ cellules mononucléées et 1/150 000 cellules CD34⁺CD38^­ [27]. Un calcul approximatif permet d'estimer qu'une CRU de sang de cordon pourrait générer 2 x 10⁶ cellules CD34⁺, 32 000 CFC et 250 LTC-IC [26].

Il est frappant de constater que ces fréquences sont très inférieures (d'un facteur 10-50) à celles des LTC-IC identifiées in vitro, dans les mêmes fractions cellulaires, ce qui n'est pas le cas chez la souris où LTC-IC et CRU ont une fréquence très similaire, suggérant leur proximité dans la hiérarchie hématopoïétique (figures 6 et 7). Cette différence de fréquence entre NOD-SCID-RC et LTC-IC chez l'homme pourrait témoigner du caractère très primitif des NOD-SCID-RC et les placer hiérarchiquement en amont des LTC-IC. L'échec initial des tentatives d'infection rétrovirale de ces NOD-SCID-RC, contrastant avec le succès de l'infection des LTC-IC, arguait aussi en faveur de cette hypothèse [28]. Depuis, l'infectabilité des NOD-SCID-RC a été démontrée [29-32], et l'existence d'une corrélation entre la proportion de LTC-IC et de NOD-SCID-RC infectées [30] suggère un chevauchement entre LTC-IC et NOD-SCID-RC (figure 6). Surtout, il faut insister sur le biais introduit, dans le test in vivo, par le processus de homing, qui n'intervient pas in vitro, de même qu'il n'intervenait pas non plus dans le modèle chimérique de McCune.

Si la fraction CD34⁺CD38^­ est enrichie en NOD-SCID-RC (fréquence 1/500 à 1/1 000), il semble que ces progéniteurs soient aussi présents dans la fraction CD34⁺CD38⁺ à une fréquence certes plus faible (1/20 000), mais leur nombre, compte tenu de l'importance quantitative de cette fraction, représente 25 % du nombre total de NOD-SCID-RC [20]. Ce point reste cependant controversé [32]. Enfin, la présence de progéniteurs immatures (dont des NOD-SCID-RC et LTC-IC) dans la fraction CD34^­, reconnue initialement chez la souris [33], se confirme chez l'homme [34]. Reste à déterminer si ces progéniteurs diffèrent fonctionnellement de ceux qui expriment l'antigène CD34.

Analyse in vivo du devenir
de clones individuels

L'analyse de la potentialité et du devenir des clones individuels actifs in vivo n'est pas possible en l'absence d'un marqueur clonal. Il est possible [33], mais peu réaliste, en routine, de travailler à l'échelon unicellulaire in vivo. La seule alternative est d'infecter les NOD-SCID-RC avec un vecteur rétroviral dont le site d'intégration servira de marqueur clonal. Les progrès de la vectorologie et l'amélioration des protocoles d'infection rétrovirale font qu'il est actuellement possible d'infecter 20-30 % de cellules CD34⁺CD38^­ et plus de 50 % des CFC et LTC-IC (ou CAFC). L'utilisation de transgènes dont l'expression est détectable sur des cellules vivantes (marqueur de surface, CD2 par exemple dans notre étude, NGF-R¹⁷ [29], ou fluorescent comme la GFP¹⁸ [32]) permet de sélectionner 100 % de cellules infectées, étape nécessaire si l'objectif est de suivre de façon quantitative le devenir de clones individuels, in vitro comme in vivo. La présence, dans la moelle des souris 4 semaines et jusqu'à 7 mois après greffe, de cellules humaines transduites est démontrée à présent par de nombreuses équipes [29-32]. Toutes les lignées sont concernées dans des proportions variables, et on trouve entre 10 et 30 % de progéniteurs clonogéniques transduits y compris dans notre propre expérience [31]. Cependant, les proportions de CFC et de cellules infectées détectées dans la moelle des souris sont en général faibles comparées à celles des CFC et LTC-IC (CAFC) avant transplantation [16, 30, 32], et ce surtout lorsque des cellules CD34⁺CD38^­ sont infectées [32]. Plusieurs raisons peuvent être invoquées : l'absence d'infection efficace des NOD-SCID-RC par les rétrovirus classiques, si on admet que ces cellules sont en G0 [35], qui justifie l'essai des lentivirus [36]. Mais il faut surtout évoquer la possible modification de la migration des cellules par les cytokines utilisées pour permettre l'intégration rétrovirale [37]. S'y ajoutent les difficultés techniques d'analyse des sites d'insertion, liées au petit nombre de cellules humaines des différentes lignées produites chez la souris. Jusqu'à présent seul le groupe de J. Nolta a démontré l'origine commune de cellules CD3⁺ (lymphoïdes) et CD33⁺ (myéloïdes) isolées de la moelle de souris BNX greffées avec des cellules CD34⁺ de moelle humaine adulte [21, 38] et a estimé à 1-5 le nombre de clones contribuant au compartiment de progéniteurs clonogéniques 4-6 mois après greffe [38].

Difficultés d'interprétation particulières au modèle xénogénique :
migration cellulaire dans les souris NOD-SCID

En conclusion, on peut tirer deux types d'informations de l'étude du modèle NOD-SCID (figure 8) :

1) Il est acquis qu'existe dans les tissus hématopoïétiques humains une population de cellules capables de coloniser la moelle des souris NOD-SCID, d'y proliférer activement, et de produire des précurseurs de toutes les lignées lymphoïdes et myéloïdes, et ce pendant au moins 4 à 6 mois, du moins lorsqu'on utilise comme greffon des cellules fœtales. Indépendamment de leur signification physiologique, ces observations suggèrent que le modèle NOD-SCID peut être un outil performant pour identifier les signaux présents dans l'environnement murin et qui, in vivo, contrôlent les processus de prolifération/différenciation de ces cellules, en particulier dans la lignée lymphoïde B. Il est possible, en particulier dans le cas de la lignée lymphoïde B, que la situation xénogénique soit particulièrement favorable à une amplification cellulaire considérable, par l'absence d'action de certaines molécules inhibitrices sur les cellules humaines.

2) En revanche, il serait hasardeux d'assigner une place à ces NOD-SCID-RC au sein de la hiérarchie hématopoïétique : une question essentielle et non résolue dans ce modèle est de comprendre si la colonisation de la moelle des souris est un processus sélectif mettant en jeu des molécules de reconnaissance particulières aux cellules primitives, ou si elle se produit au hasard.

* La migration des cellules humaines injectées par voie intraveineuse peut être profondément altérée dans la souris. Dans les greffes murines syngéniques, 20 à 40 % des cellules du donneur migrent dans la moelle en quelques heures. Dans le modèle chimérique homme/souris NOD-SCID, nous n'avons aucune maîtrise des processus de migration et de colonisation de l'espace médullaire (homing). Les processus de homing commencent à être décryptés chez la souris, où ils impliquent VCAM1, les sélectines [39] et le couple SDF1/CXCR4. Dans le modèle NOD-SCID, deux études suggèrent le rôle des intégrines VLA-5 [40], et du couple SDF-1/CXCR4 [41]. Mais il n'est pas exclu que, malgré la compatibilité entre espèces des molécules de reconnaissance citées plus haut, la situation xénogénique ne limite considérablement le homing des cellules humaines, puisque moins de 1 % des cellules injectées sont détectées dans la moelle quelques heures après la greffe. Il ne faut pas exclure non plus une inadéquation du calibre des vaisseaux murins aux cellules humaines, ou un « piégeage » non spécifique des cellules humaines dans le poumon, la rate, ou le foie.

* Selon plusieurs études récentes, l'état prolifératif des cellules conditionnerait leur capacité de homing. Ainsi, après injection de cellules dans la phase G0 du cycle cellulaire, la proportion de cellules humaines détectée dans la moelle des souris est plus importante qu'après injection de cellules en phase G1 [35], et des variations identiques ont été observées dans le système murin [37]. Que ces différences résultent d'une modulation de la propriété de homing (via une modulation de l'expression des récepteurs d'adhérence en fonction du cycle cellulaire) est possible mais non démontré. En tout cas, s'il se confirme que la capacité de homing varie en fonction des phases du cycle cellulaire, cela pourrait expliquer la moindre efficacité (ou du moins la variabilité) de la prise de greffe après transfert de gènes et inciter à une certaine prudence dans l'établissement des protocoles d'expansion. Il est certain que ce champ d'investigation va s'éclaircir au cours des années qui viennent, mais à l'heure actuelle, notre absence de maîtrise des processus de migration et de colonisation incite à être prudent sur l'interprétation du modèle NOD-SCID.

2. Le terme totipotence définit ici la capacité d'une cellule à se différencier dans toutes les lignées hématopoïétiques lymphoïdes (T, B, NK) et myéloïdes (érythroïde, granuleuse, mégacaryocytaire).
3. Cette activité prolongée définit la propriété de reconstitution à long terme (> 3 mois chez la souris).
4. CFC : colony forming cell ; LTC-IC : long-term culture initiating cell.
5. SCID : severe combined immunodeficient.
6. NK : natural killer.
7. LAK : lymphocyte activated killer.
8. PCR : polymerase chain reaction.
9. FTOC : fetal thymic organotypic culture.
10. G-CSF : granulocyte colony-stimulating factor.
11. SCF : stem cell factor (ou c-kit ligand, ou steel factor).
12. CFU-GM : colony forming unit-granulocyte-macrophage.
13. BFU-E : burst forming unit-erythroid.
14. CFU-GEMM : colony forming unit-granulocyte-erythroid-macrophage-megakaryocyte.
15. Epo : érythropoïétine.
16. NOD-SCID-RC : NOD-SCID repopulating cells ; CRU : competitive repopulating unit ; SRC : SCID repopulating cell.
17. NGF-R : récepteur du NGF de faible affinité.
18. GFP : green fluorescent protein.

Une observation incontestable est que des cellules souches humaines peuvent se développer dans la moelle osseuse de souris NOD-SCID, et ce, à long terme, mais qu'il n'y a pas, actuellement, de reconstitution spontanée dans les lignées lymphoïdes T et NK. Toutefois, cette restriction de la différenciation sera probablement levée par l'addition de cytokines nécessaires et d'un greffon thymique. La principale question est celle de l'intérêt de ce modèle pour l'évaluation préclinique. Même si on ne connaît pas rééllement les populations qu'identifie le modèle NOD-SCID, il pourrait être très utile dans des études pilotes s'il s'avérait qu'existe une corrélation entre la prise de greffe dans la souris, et la prise de greffe chez l'homme ou dans un modèle de gros animal. Cela implique que l'on dispose de données comparatives entre les résultats de transplantation de cellules humaines chez la souris, chez le singe et chez l'homme, et une telle étude n'a pas encore été faite. Enfin, un domaine qui n'a pas été discuté dans cette revue (il le sera dans un numéro ultérieur), mais qui a une importance considérable est celui de la conception de modèles d'hémopathies humaines chez la souris NOD-SCID, soit par transfert de cellules leucémiques, soit par transfert de cellules souches normales transduites par un gène transformant.