Caractérisation de mutations spontanées du gène du facteur VII de la coagulation induisant des anomalies de sécrétion, une instabilité et une dégradation intracellulaire

 

Le séquençage de la partie codante et des jonctions introns-exons de patients porteurs d'un déficit constitutionnel hémorragique quantitatif en facteur VII (FVII) a mis en évidence trois mutations homozygotes : dans l'exon 8, mutation C/T en position 10 648, dans l'exon 5, mutations G/T en position 7 824 et A/G en position 7 834, entraînant respectivement les substitutions Ala²⁴⁴Val, Gly⁹⁷Cys et Gln¹⁰⁰Arg. La transfection transitoire dans des cellules COS-1 du gène du FVII ainsi muté diminue de respectivement 80, 93 et 83 % la sécrétion des FVII²⁴⁴Val, VII⁹⁷Cys et VII¹⁰⁰Arg mais aussi leur taux intracellulaire (40, 62 et 46 %). Le polymorphisme Arg³⁵³Gln, dont la fréquence allélique est de 10 % dans la population générale, réduit les taux plasmatiques et la sécrétion du FVII de 25 % sans modifier sa synthèse intracellulaire [1].

Les ADN du FVII normal et du FVII²⁴⁴Val sont transcrits et traduits avec une efficacité similaire. L'immunoprécipitation du FVII confirme la réduction intracellulaire du FVII²⁴⁴Val, probablement par dégradation car aucune accumulation n'est détectable. La substitution, par mutagenèse dirigée, du résidu Ala²⁴⁴ par un groupement phénol diminue les taux de FVII intracellulaire et réduit la sécrétion à l'état de traces. Ceci suggère un rôle crucial de la taille de la chaîne latérale du résidu Ala²⁴⁴ pour le maintien de la conformation de la molécule et sa stabilité [2].

Étudiée en immunofluorescence sur des lignées cellulaires CHO DUBX-B11, la localisation du FVII non muté et du FVIICys⁹⁷ est périnucléaire et golgienne alors que celle du FVIIArg¹⁰⁰ est plus diffuse du fait soit d'un temps de transit plus long soit d'une rétention dans le réticulum endoplasmique, ce que confirme un marquage métabolique suivi d'immunoprécipitation du FVII. L'utilisation d'inhibiteurs de dégradation lysosomiale, d'ALLN, de lactacystine ou de bréfeldine A démontre que les taux réduits de FVIICys⁹⁷ intracellulaire résultent d'une dégradation intracellulaire par une cystéine protéase, protéasome indépendante, survenant avant la translocation au Golgi. En revanche, l'anomalie de sécrétion du FVIIArg¹⁰⁰ est secondaire à une anomalie de repliement de la molécule et de la formation de ponts disulfures intramoléculaires : en effet, en conditions réductrices, la différence de mobilité électrophorétique entre le FVIIArg¹⁰⁰ et le FVII normal disparaît [3].

Un déficit constitutionnel quantitatif en FVII peut donc résulter de mécanismes aussi variés qu'une anomalie isolée de sécrétion, une instabilité, une anomalie de formation des ponts disulfures ou la dégradation de la protéine par une cystéine protéase avant la translocation dans l'appareil de Golgi.

Publications associées à la thèse :

1. Hunault M, Arbini A, Lopaciuk S, Carew J, Bauer K. The Arg353Gln polymorphism reduces the level of coagulation factor VII : in vivo and in vitro studies. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1997 ; 17 : 2825-9.

2. Hunault M, Arbini A, Carew J, Bauer K. Mechanism underlying factor VII deficiency in Jewish population with the Ala244Val mutation. Br J Haematol 1999 (in press).

3. Hunault M, Arbini A, Carew J, Mannucci P, Bauer K. Characterization of two naturally occuring mutations in the second EGF-like domain of factor VII. Blood 1999 (in press).