Apoptose induite par les agents antitumoraux

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Au cours des dernières décennies, la pharmacologie antitumorale s'est essentiellement attachée à trois objectifs: découvrir de nouveaux médicaments anticancéreux, définir les cibles des agents antitumoraux et caractériser les mécanismes de résistance, notamment ceux qui sont susceptibles de diminuer l'amplitude de l'interaction de l'agent antitumoral avec sa ou ses cible(s). Ces trois axes de recherche ont été fortement influencés par le dogme généralement accepté selon lequel la cytotoxicité était essentiellement conditionnée par le niveau et/ou la pérennité des lésions induites par l'agent antitumoral. Pourtant, de nombreuses données expérimentales suggèrent qu'un niveau de lésions supposé similaire (ce niveau peut être précisément évalué dans le cas des sels de platine par la mesure des adduits formés et pour les rayonnements ionisants par la mesure des cassures double brin) induit dans différentes populations cellulaires des effets aussi différents qu'une mort rapide, une mort différée, un effet cytostatique transitoire, l'absence d'effet, voire un effet mitogène (à doses faibles) (figure 1). Ces observations démontrent que des lésions induites par les médicaments anticancéreux ou par les rayonnements ionisants ne sont pas systématiquement converties en cytotoxicité et que l'engagement vers la mort cellulaire est un phénomène régulé. Cette interprétation a conduit les investigateurs à caractériser: 1)les modalités de la mort cellulaire induite par les agents antitumoraux; 2)les protéines impliquées dans la régulation de ces phénomènes et 3)la nature des signaux intracellulaires activés lors de ces processus.

Les différentes modalités de mort cellulaire induite par les agents antitumoraux

Les agents antitumoraux induisent plusieurs modalités de mort cellulaire: la mort par nécrose, la mort reproductive différée et la mort par apoptose. En réalité, cette distinction est relativement arbitraire dans la mesure où il semble exister un continuum dans ces différentes modalités de mort cellulaire, par exemple une mort par nécrose peut survenir dans la phase terminale d'un phénomène d'apoptose; de même, une mort reproductive peut s'accompagner de certaines caractéristiques de l'apoptose. Toutefois, ces trois modalités de mort cellulaire présentent certaines caractéristiques propres.

La mort par nécrose

La mort par nécrose se définit comme un processus rapide au cours duquel, sous l'effet d'un effecteur cytotoxique puissant, l'intégrité membranaire est rompue, la cellule se disloque et son contenu est libéré dans le milieu extracellulaire. La libération des enzymes intracellulaires dans l'environnement induit un phénomène inflammatoire. La mort par nécrose est observée in vitro après exposition à de très fortes concentrations d'agent cytotoxique. In vivo, le fait que la réduction tumorale chimio- ou radio-induite ne s'accompagne qu'exceptionnellement de manifestations inflammatoires laisse supposer que la mort par nécrose n'est pas une modalité fréquente de mort induite par les agents antitumoraux.

La mort reproductive différée ou mort postmitotique

La mort reproductive différée est une modalité de mort cellulaire initialement caractérisée dans les cellules exposées aux rayonnements ionisants à des doses modérées[1]. Ce processus est particulier du fait que la mort cellulaire survient après au moins une mitose complète. Dans cette modalité de réponse, les cellules peuvent effectuer plusieurs cycles complets (jusqu'à une vingtaine) avant de mourir. Très souvent, la mort est précédée d'altérations du cycle cellulaire avec ralentissement progressif des transitions G1-S, blocage en M et apparition de cellules géantes avec un taux d'ADN supérieur à 4n, qui correspondent à des mitoses abortives (duplication sans cytodiérèse). Cette modalité de mort cellulaire est également observée dans les cellules exposées à des agents antitumoraux utilisés à faible dose[2]. Dans cette modalité de mort cellulaire, les étapes ultimes conduisant à la désintégration cellulaire restent à caractériser; le plus souvent la mort est de type nécrotique mais il n'est pas rare d'observer, comme dans l'apoptose, une fragmentation oligonucléosomale de l'ADN[3].

La mort par apoptose

La plupart des agents antitumoraux peuvent induire un phénomène d'apoptose. Historiquement, le cisplatine a été le premier agent identifié comme inducteur d'apoptose[4]. Très rapidement, les investigateurs ont montré que les rayonnements ionisants, les radiations ultraviollettes, les médicaments anticancéreux étaient susceptibles d'induire ce phénomène[5]. Parmi les médicaments anticancéreux les plus actifs, on note les poisons de la topo-isomérase II (étoposide, téniposide, amsacrine, mitoxantrone), les poisons de la topo-isoméraseI (camptothécine), l'aracytine, les anthracyclines (dans une gamme étroite de concentration), les antimétabolites (méthotrexate) et les poisons des tubulines (alcaloïdes de la Vinca et taxanes).

L'apoptose induite par les agents antitumoraux est caractérisée par des modifications morphologiques telles que diminution de la taille de la cellule, condensation et fragmentation de la chromatine, présence de corps apoptotiques ainsi que des événements biochimiques tels que la fragmentation oligonucléosomale de l'ADN visualisée en électrophorèse en gel d'agarose sous forme «d'échelle» (correspondant à des fragments dont la taille est un multiple de 180 paires de bases). De ce point de vue, il apparaît que l'apoptose induite par les agents antitumoraux ne semble pas très différente de celle induite dans d'autres circonstances d'agression telles que la privation en sérum, le choc thermique ou l'agression oxydative. Après l'exposition à l'agent antitumoral, on note généralement une fragmentation oligonucléosomale de l'ADN dans un délai variable (de 3 à 72 heures). Longtemps considérée comme un critère spécifique du phénomène d'apoptose, la fragmentation oligonucléosomale de l'ADN n'est pas un événement hautement spécifique car elle peut être présente lors de la mort par nécrose; elle peut être remplacée par la génération de fragments de plus grande taille visualisés en électrophorèse en champ inversé pulsé[6]. De plus, la caractérisation de phénomènes biochimiques plus précoces (voir plus loin) fait de plus en plus considérer la fragmentation de l'ADN comme un événement distal voire non spécifique, les endonucléases n'intervenant que pour achever une étape déjà avancée dans le phénomène d'apoptose chimio-induite. Enfin, il convient de souligner que, pour un modèle cellulaire donné, la cinétique du processus est non seulement fonction de la dose mais aussi de l'agent (rapide pour les poisons des topo-isomérases, lent pour les poisons des tubulines).

L'apoptose induite par les agents antitumoraux implique d'autres événements biochimiques et, notamment, l'activation de protéases qui semblent jouer un rôle essentiel dans le déroulement du phénomène. L'implication des protéases dans l'apoptose a fait l'objet de nombreux travaux. Par exemple, l'activation de protéases de la famille ICE (interleukin1b converting enzyme) a été impliquée dans l'apoptose via Fas/APO-1. Ces protéines présentent des homologies avec la protéine ced-3 qui joue un rôle important dans la morphogenèse du nématode Caenorhabditis elegans[7]. Dans le cas de l'apoptose chimio-induite, l'activation de certains membres de cette famille de cystéine protéases a été démontrée, notamment la protéase CPP32 dans l'apoptose induite par l'étoposide[8], le cisplatine et l'aracytine[9]. Dans le processus d'apoptose, le rôle exact de ces protéases reste à élucider. En effet, la stimulation de l'activité protéolytique au cours du phénomène d'apoptose a été longtemps considérée comme un événement distal car survenant en parallèle avec la fragmentation de l'ADN. En réalité, il apparaît aujourd'hui que l'activation de certaines protéases représente des événements coordonnés intervenant précocement dans la transduction du signal induit par l'agent effecteur.

Enfin, il convient de signaler que, parmi les événements précoces de l'apoptose chimio-induite, il existe des modifications majeures de la distribution des phospholipides membranaires avec en particulier la présence de phosphatidylsérine dans le feuillet externe de la membrane plasmique, alors que cet aminophospholipide est normalement presque exclusivement contenu dans le feuillet interne[10]. Ce phénomène n'est pas sans rappeler la translocation de la phosphatidylsérine lors de l'activation plaquettaire ou lors du vieillissement érythrocytaire. La présence de phosphatidylsérine sur le feuillet externe de la membrane des cellules apoptotiques représente un signal de reconnaissance pour les macrophages impliqués dans la phagocytose de ces cellules[11]. Cela explique sans doute la raison pour laquelle l'apoptose chimio-induite est un phénomène difficile à mettre en évidence in vivo.

Grâce au développement des techniques précises de caractérisation morphologique et biochimique du phénomène d'apoptose ainsi que l'introduction de techniques quantitatives, il est rapidement apparu que: 1)certains modèles cellulaires étaient totalement inaptes à développer ce phénomène quelles que soient les doses utilisées et donc, a priori, quel que soit le niveau des lésions générées; 2)pour les cellules aptes à activer un phénomène d'apoptose, l'amplitude et la cinétique du phénomène étaient différentes en fonction de l'origine histogénétique. Ainsi, les cellules hématopoïétiques (physiologiques ou néoplasiques) et les cellules endothéliales exposées à un agent antitumoral présentent généralement une réponse apoptotique de plus grande amplitude que les cellules dérivées de carcinome, lesquelles sont plus inductibles que les fibroblastes. Il est intéressant de constater que cette hiérarchie correspond à la physiologie dans la mesure où l'apoptose est une modalité courante de l'élimination des cellules hématopoïétiques physiologiques, alors que ce phénomène n'est pas la règle pour les épithéliums (hormis la composante entérocytaire de l'épithélium digestif) et est encore moins répandu pour les cellules mésenchymateuses.

Dans les cellules leucémiques, nous avons constaté que des poisons de la topo-isomérase II nucléaire tels que la daunorubicine [12] et la mitoxantrone[13] ainsi que les rayonnements ionisants[14] étaient inaptes à induire un phénomène d'apoptose dans les cellules de phénotype immature exprimant l'antigène de différenciation précoce CD34 alors que ces agents induisent un phénomène d'apoptose dans les cellules de phénotype plus mature n'exprimant pas CD34. Dans le cas de la mitoxantrone, nous avons pu vérifier que la génération des complexes clivables était similaire dans les cellules CD34+ et CD34-, suggérant que l'interaction mitoxantrone-topo-isomérase II était équivalente dans les deux types cellulaires. De même, dans le cas des rayonnements ionisants, le niveau des lésions de l'ADN, évalué par la mesure des cassures double brin, était similaire. Ces observations suggèrent que des événements postérieurs à la constitution des lésions influencent la nature de la réponse cellulaire à certains médicaments anticancéreux et aux rayonnements ionisants.

Régulation de l'apoptose induite par les agents antitumoraux

Il apparaît de plus en plus clairement que l'apoptose induite par les agents antitumoraux est régulée par de nombreux paramètres représentant ainsi autant de facteurs susceptibles de diminuer significativement l'efficacité de nombreux agents utilisés dans le traitement des cellules cancéreuses. Au moins cinq classes d'intervenants sont impliquées dans la régulation de l'apoptose: certains oncogènes, des gènes suppresseurs de tumeur, l'activité de certaines protéine kinases, des facteurs de croissance et l'équilibre oxydatif.

Parmi les oncogènes, il convient d'envisager le rôle de Bcl-2: le gène bcl-2 appartient à une famille de gènes présentant des homologies de structure et de fonction. Le produit de certains de ces gènes présente des propriétés antiapoptotiques (Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1 et A1) tandis que d'autres ont une fonction pro-apoptotique (Bax, Bcl-xS, Bad et Bak). Ces protéines interagissent en formant des dimères dont la composition conditionne l'amplitude de l'apoptose. Ainsi, par exemple, Bax exerce sa fonction pro-apoptotique en inhibant l'effet de Bcl-2 après interaction directe avec ce dernier[15]. Ces observations pourraient expliquer les résultats d'études cliniques montrant la valeur prédictive négative de Bcl-2 en terme de réponse dans le traitement des leucémies aiguës. Toutefois, l'implication de Bcl-2 dans la chimiorésistance est loin d'être évidente. Ainsi, la surexpression de Bcl-2 retarde l'apoptose chimio-induite mais ne modifie pas l'effet cytotoxique mesuré en test clonogénique. Pour notre part, nous avons observé que la surexpression de Bcl-2 retarde mais n'inhibe pas l'apoptose induite par la daunorubicine [16]. Ces observations suggèrent que Bcl-2 bloque seulement certaines voies de signalisation conduisant à l'apoptose. L'oncogène abl est également impliqué dans la régulation de l'apoptose. Le produit du protooncogène c-abl est une protéine dont l'activité biologique est liée à son activité tyrosine kinase. Dans les cellules non transformées, l'activité de cette protéine est activement contre-régulée. Les formes transformantes de c-abl sont v-abl et bcr-abl. Les produits de ces oncogènes sont autophosphorylés et expriment une puissante activité tyrosine kinase qui rend probablement compte de leur pouvoir transformant. Concernant v-abl, ses propriétés anti-apoptotiques sont discutées et son rôle dans l'apoptose chimio-induite n'a pas encore été évalué. Par contre, le rôle de bcr-abl est clairement démontré. En effet, l'expression de bcr-abl bloque l'apoptose induite par la plupart des agents antitumoraux et les rayonnements ionisants[17]. Cet effet peut rendre compte de l'incapacité des chimiothérapies à éradiquer le clone leucémique dans la leucémie myéloïde chronique. L'effet antiapoptotique de bcr/abl peut être inhibé par des vecteurs antisens bcr-abl ou par des inhibiteurs d'activité tyrosine kinase tels que les tyrphostines.

Parmi les gènes suppresseurs de tumeur, p53 apparaît jouer un rôle critique bien que complexe. En effet, lors d'une agression de la cellule par des agents endommageant l'ADN, la protéine p53 agit comme un facteur transcriptionnel en bloquant le cycle cellulaire en G1. Ce blocage, via la protéine p21WAF1,CIP 1, pourrait permettre à la cellule de réparer les dommages de l'ADN avant la phase de réplication[18]. Dans ce sens, p53 apparaît comme une protéine «protectrice» vis-à-vis des agents antitumoraux. Dans les cellules n'exprimant pas une p53 fonctionnelle (mutation ou délétion du gène p53) exposées à ces mêmes agents, la transition G1-S s'effectue normalement; toutefois, ces cellules sont capables de se bloquer durablement lors de la transition G2-M. Ce blocage prémitotique représente un second point de contrôle très efficace, permettant à la cellule de réparer et, en fonction de la qualité de réparation, de reprendre éventuellement une croissance normale. Dans cette perspective, la perte de la fonction de p53 apparaît plutôt comme un paramètre de chimio/radiorésistance. De fait, une étude récente réalisée à partir de la série des 60lignées du NCI exprimant soit une p53 normale soit une p53 mutée, montre une très bonne corrélation entre un statut normal de p53, l'activation de p21, le blocage en G1 et un profil de chimio/radiosensibilité ainsi que la corrélation inverse: p53 mutée, absence de blocage en G1, blocage prémitotique et profil de résistance[19]. Ainsi, la perte de la fonction de p53 apparaît plutôt comme un facteur défavorable vis-à-vis de l'efficacité des agents cytotoxiques, hormis pour les taxanes où elle semble faciliter l'effet cytotoxique[20].

Parmi les protéine kinases, outre le cas particulier déjà évoqué de bcr-abl, il convient d'envisager le rôle de la protéine kinaseC. La plupart des données expérimentales démontrant le rôle de la protéine kinase C dans l'apoptose proviennent des études réalisées avec les esters de phorbol qui miment l'effet de l'agoniste naturel de la protéine kinase C, le diacylglycérol. De ce point de vue, il est important de rappeler que cette approche méthodologique souffre de certaines limites puisque, si les esters de phorbol n'activent pas d'autres protéine kinases connues, ils induisent une multitude d'autres effets biologiques potentiellement importants pour l'apoptose (par exemple, effet sur le pH intracellulaire, induction de certains oncogènes, modification de l'équilibre oxydatif); de plus, comme le diacylglycérol, ils n'activent pas certaines isoformes de protéine kinase C (isoformes dites «atypiques»). À ces restrictions près, il apparaît que les esters de phorbol bloquent l'apoptose induite par la plupart des agents antitumoraux, suggérant que la protéine kinase C joue le rôle de «verrou» dans ce processus. Ce résultat n'est pas sans évoquer des travaux anciens suggérant que la chimiosensibilité était influencée par le niveau d'activité de la protéine kinase C. Toutefois, de nombreuses inconnues demeurent quant au(x) mécanisme(s) impliqué(s) dans l'effet protecteur de la protéine kinase C. Ainsi, il reste à déterminer quelles sont les isoformes impliquées dans ce phénomène et à quel niveau du processus intervient la protéine kinase C.

L'implication de la protéine kinase C dans le contrôle de l'apoptose induite par les agents antitumoraux a fait évoquer le rôle de certains facteurs de croissance, notamment ceux qui sont connus pour activer cette enzyme. Ainsi, il a été montré que le bFGF (basic fibroblast growth factor) inhibe l'apoptose induite par les rayonnements ionisants dans les cellules endothéliales, ce mécanisme étant dépendant de la protéine kinase C[21]. Ce résultat est à rapprocher de l'effet protecteur de l'IL3 vis-à-vis de l'apoptose radio-induite dans les cellules hématopoïétiques. Il est probable que ces résultats seront étendus à d'autres facteurs de croissance (GM-CSF, IGF1) compte tenu de leur capacité à bloquer l'apoptose induite par d'autres effecteurs. Ces observations sont importantes dans la mesure où elles suggèrent que la production autocrine et/ou paracrine de certains facteurs de croissance interfère avec la cytotoxicité des agents antitumoraux. Dans cette perspective, il n'est pas sans intérêt de rappeler que dans les leucémies aiguës myéloïdes, l'autonomie de croissance des cellules leucémiques in vitro (potentiellement liée à des boucles autocrines de CSF) représente un facteur péjoratif de réponse thérapeutique. Enfin, des protéine phosphatases peuvent être impliquées. Ainsi, l'acide okadaïque (inhibiteur de protéine phosphatase de type1 et 2A) bloque l'apoptose induite par les rayonnements ionisants et le cisplatine[22].

Le rôle de l'équilibre oxydatif dans le processus d'apoptose a été largement démontré[23]. Certains agents antitumoraux sont susceptibles d'induire un stress oxydatif, soit en générant eux-mêmes des radicaux oxygénés (anthracyclines, étoposide, rayonnements ionisants), soit en diminuant le taux intracellulaire de glutathion (alkylants, sels de platine). De façon générale, les anti-oxydants (N-acétylcystéine ou thiocarbamates) inhibent l'apoptose induite par les agents antitumoraux, suggérant que le stress oxydatif généré par ces agents joue un rôle important dans l'activation de ce processus. Dès lors, on conçoit que toute amplification des défenses oxydatives telle que l'élévation du taux intracellulaire de thiols, la surexpression de certaines réductases telles que la thiorédoxine, l'augmentation de l'activité d'enzymes de détoxication (catalase, dismutase), diminue la réponse apoptotique. Il reste à définir les mécanismes par lesquels les radicaux oxygénés activent l'apoptose.

Signaux intracellulaires potentiellement impliqués dans l'apoptose induite par les agents antitumoraux

L'ensemble de ces observations suggèrent que l'apoptose induite par les agents antitumoraux est un phénomène hautement régulé. Cette constatation a encouragé les investigateurs à tenter de caractériser les voies de signalisation impliquées dans ce phénomène et de déterminer à quel niveau les facteurs régulateurs évoqués ci-dessus interviennent.

Parmi les voies de signalisation qui conduisent à la mort par apoptose, la voie dite «sphingomyéline-céramide» est importante à envisager. Cette voie, initialement caractérisée dans l'apoptose induite par le TNFa , consiste en la stimulation d'une activité sphingomyélinase responsable de l'hydrolyse de la sphingomyéline (SPM) et de la génération concomitante de céramide[24]. Dans les mêmes cellules, des céramides rendus perméants ou le céramide naturel, généré par l'exposition des cellules à une sphingomyélinase bactérienne, induisent l'apoptose. Cette observation suggère fortement que le céramide endogène issu de l'hydrolyse de la sphingomyéline sous l'effet de l'agoniste est bien le médiateur de l'apoptose. Cette voie de signalisation apoptotique semble être empruntée par les rayonnements ionisants. Pour notre part, nous avons montré que la daunorubicine était capable d'activer cette voie de signalisation dans les cellules leucémiques[25]. L'originalité de cette observation réside dans le fait que, jusqu'à ce jour, le mécanisme de cytotoxicité des anthracyclines était lié à l'interaction avec l'ADN et, notamment, avec la topo-isomérase II nucléaire. Il reste toutefois à démontrer si cette voie de signalisation est activée indépendamment de l'interaction avec cette enzyme ou, au contraire, constitue une réponse aux lésions provoquées sur l'ADN.

Les cibles du céramide sont multiples[24]. En effet, le céramide active une sérine thréonine protéine kinase (ceramide-activated protein kinase ou CAPK) dont le rôle reste discuté. Ainsi, pour certains auteurs, l'activation de CAPK n'est probablement pas impliquée dans l'effet apoptotique du céramide; par contre, elle pourrait rendre compte de l'effet prolifératif induit par le céramide observé dans certains systèmes cellulaires tels que les fibroblastes ou les cellules musculaires lisses. Le céramide active aussi une protéine phosphatase de la famille PP2A (ceramide-activated protein phosphatase ou CAPP) inhibée par l'acide okadaïque et dont la fonction reste à élucider. Le céramide active certains facteurs transcriptionnels tels que AP-1 et NF-k B dont le rôle pourrait être critique dans la régulation du phénomène d'apoptose. Ainsi, l'inhibition d'AP-1 par la curcumine ou par des oligonucléotides antisens pour c-jun bloque l'apoptose induite par le céramide[26]. Le rôle de NF-kB est encore incertain, quoique certaines études plaident en faveur de sa fonction anti-apoptotique[27]. Enfin et surtout, des travaux récents impliquent une voie probablement critique dans l'apoptose induite par le céramide: les JNK (c-jun N-terminal kinase)/SAPK (stress-activated protein kinase)[28]. Le céramide active ces kinases dans des systèmes cellulaires tels que la lignée U937 et les cellules endothéliales bovines, où il induit sans équivoque un phénomène d'apoptose. Cette cascade implique l'activation séquentielle de MEKK1, SEK1, SAPK et c-jun[28]. L'utilisation d'un mutant dominant négatif de SEK1 bloque l'apoptose induite par le céramide. La voie JNK/SAPK est d'autant plus importante à considérer que plusieurs études ont montré que des agents antitumoraux (rayonnements ionisants, mitomycine et aracytine) activaient cette voie par l'intermédiaire du protooncogène c-abl[29]. Dans la mesure où ces agents peuvent également activer la génération de céramide, il n'est pas exclu que le produit de c-abl soit une cible du céramide et que toute altération de sa fonction (par exemple son activation constitutive dans les cellules de leucémies myéloïdes chroniques) représente un facteur limitant du processus de cytotoxicité.

L'intérêt de ce domaine d'investigation réside dans le fait que la voie sphingomyéline-céramide apparaît comme éminemment régulée aussi bien en amont qu'en aval de la génération de céramide. En amont, la génération de céramide apparaît régulée à la fois par le substrat disponible (le taux de sphingomyéline hydrolysable) et par l'amplitude de la stimulation de l'activité sphingomyélinase. Ainsi, nous avons montré dans certaines cellules résistantes que l'incapacité à générer du céramide en présence de l'agoniste était en rapport avec un déficit du pool hydrolysable de sphingomyéline [30]. Par ailleurs, la stimulation de l'activité sphingomyélinase sous l'effet de la daunorubicine est contre-régulée par l'activité de la protéine kinase C. En aval, l'effet apoptotique du céramide est bloqué par plusieurs facteurs tels que la surexpression de Bcl-2[31], la stimulation de l'activité de la protéine kinase C par le diacylglycérol [32], et les anti-oxydants.

Signaux intracellulaires potentiellement impliqués dans la régulation négative de l'apoptose

La caractérisation des voies de signalisation apoptotique activées par les agents antitumoraux est rendue encore plus complexe par l'existence démontrée ou supposée de voies de régulation négative. Ce domaine est encore mal connu mais pourtant essentiel dans la compréhension, au niveau moléculaire, de certains phénotypes de résistance. Nous envisagerons le rôle potentiel de trois classes d'intervenants : le diacylglycérol, certains membres de la famille des MAPK (mitogen activated protein kinase) et la phosphatidylinositol 3'-kinase (PI3K).

Rôle du diacylglycérol

Des observations décrites au paragraphe précédent, il ressort que le diacylglycérol joue un rôle central dans le contrôle négatif de l'apoptose chimio/radio-induite via le céramide: en amont de sa génération (par blocage de l'activité SPMase) et en aval (en bloquant l'effet apoptotique du céramide). À cet égard, il convient de rappeler que la plupart des agents antitumoraux susceptibles d'activer la voie sphingomyéline-céramide sont également capables d'activer en parallèle la production de diacylglycérol. Par exemple, la daunorubicine et les rayonnements sont aptes à induire de façon dose-dépendante la production de diacylglycérol par l'hydrolyse de la phosphatidylcholine (PC) [par activation d'une phospholipase C spécifique des PC (PC-PLC)] et par l'hydrolyse des phosphatidylinositols [par activation d'une phospholipase spécifique des PI (PI-PLC)]. Ainsi, pour ces agents antitumoraux, il est possible que la réponse cellulaire soit la résultante entre une voie délétère passant par le céramide et une voie de protection passant par le diacylglycérol, l'équilibre de ces deux voies conditionnant l'amplitude de l'effet cytotoxique. Cette interprétation ouvre de nombreuses perspectives de manipulations pharmacologiques visant à amplifier la production de céramide et/ou à diminuer la libération de diacylglycérol en utilisant des inhibiteurs des phospholipases concernées (PC-PLC et PI-PLC).

Rôle des MAP kinases

Une autre voie mitogène classique, susceptible de conférer un signal de survie, est la voie dite des MAP kinases. Cette voie consiste en une cascade d'événements impliquant successivement l'activation de Raf-1, MEK1 et ERK. Il a été montré dans d'autres circonstances (privation en nerve growth factor de cellules neuronales) qu'il existait un équilibre entre la fonction anti-apoptotique de ERK et la fonction pro-apoptotique de JNK-p38[33]. Dans le domaine de l'apoptose induite par les agents antitumoraux, il est également possible que la voie des MAP kinases joue un rôle similaire de protection. En effet, l'implication de cette voie pourrait rendre compte de la protection de l'apoptose chimio-induite par certains facteurs de croissance (ceux-ci empruntent couramment une voie impliquant séquentiellement Grb2, Sos, Ras, Raf-1, ERK), par Bcl-2 (il interagit directement avec Raf), ainsi que par le diacylglycérol puisque ce médiateur peut activer la voie MAPK au niveau de Raf via la protéine kinase C (en particulier son isoforme d). Si l'hypothèse est exacte, l'activation des protéines consituant cette cascade par des effecteurs cytotoxiques tels que la doxorubixine (Raf-1), la daunorubicine (ERK) et le céramide (Ras, Raf-1) pourrait s'intégrer dans le cadre d'une réponse de protection.

Rôle de la phosphatidylinositol 3'-kinase (PI3K)

Cette enzyme est impliquée dans les signaux mitogènes et de survie ; sa fonction antiapoptotique a été documentée dans l'apoptose induite par la privation en facteur de croissance[34]. L'activation de PI3K pourrait avoir deux conséquences concourantes: l'activation de Ras (et donc l'activation de la voie MAPK) et l'activation d'une isoforme de protéine kinase C, la PKCz impliquée aussi dans la survie et la réponse mitogène[35]. Dans cette perspective, il est intéressant de mentionner que PI3K est activée par la protéine BCR-ABL dont nous avons déjà largement rapporté l'effet anti-apoptotique. Comme pour la voie des MAPkinases, l'activation de PI3K par la doxorubicine (T.Tritton, communication personnelle) ou l'activation de PKCz par le céramide[36] pourrait s'intégrer dans le cadre d'une réponse de protection.

En définitive, il semble que les agents antitumoraux activent de façon parallèle des signaux potentiellement cytotoxiques (ex.: le céramide) et des signaux qui pourraient participer au blocage de l'induction du processus apoptotique (figure 2). La voie des MAP kinases pourrait jouer un rôle central dans cette réponse de protection. Dès lors, on conçoit que le blocage de cette voie (ex.: inhibiteurs de l'isoprénylation de Ras) pourrait favoriser l'effet apoptotique induit par les agents antitumoraux.

Rôle de l'apoptose dans la chimiosensibilité et la chimiorésistance des cellules tumorales

Depuis la mise en évidence du phénomène d'apoptose induit par les agents antitumoraux, deux questions pourtant essentielles restent encore posées: 1)L'apoptose joue-t-elle un rôle central dans le mécanisme de cytotoxicité? 2)La résistance à l'apoptose joue-t-elle un rôle dans la résistance aux agents antitumoraux? La réponse à ces deux questions liées n'est sans doute pas univoque et doit prendre en compte la nature de l'agent antitumoral et des modèles cellulaires considérés. Ainsi, à titre d'exemple, nous envisagerons l'implication de la réponse apoptotique des cellules myéloïdes leucémiques dans le mécanisme de cytotoxicité et de résistance vis-à-vis de la daunorubicine. Dans les cellules HL-60 ou U937, l'exposition courte (1heure) à la daunorubicine, utilisée à une dose correspondante au pic de concentration après administration bolus chez les patients leucémiques (0,2-1mM), induit une mort par apoptose détectable dès 4heures. Ce phénomène survient simultanément dans toutes les cellules indépendamment de leur distribution dans le cycle et conduit à l'élimination de la totalité de la population en 24heures («mort interphasique rapide»)[12]. L'apoptose apparaît ainsi comme une réponse cellulaire drastique, irréversible, ne laissant à la cellule aucune possibilité de réparation et donc de survie. À l'inverse, dans d'autres cellules leucémiques telles que les cellules KG1, TF-1 ou HEL traitées dans les mêmes conditions, la daunorubicine induit un effet cytostatique transitoire en rapport avec un blocage G2-M (correspondant probablement à une étape de réparation) suivi d'une réexpansion après un délai prolongé. Ainsi, l'absence de réponse apoptotique semble avoir pour conséquence de permettre à la cellule de «gérer» les lésions générées par la daunorubicine avec blocage de la mitose, réparation et survie. De fait, ces cellules sont jusqu'à dix fois plus résistantes que les cellules HL-60 ou U937. Si le lien entre réponse apoptotique et sensibilité est évident, l'interprétation exacte de ces observations reste difficile. En effet, deux hypothèses très distinctes peuvent être avancées: 1)la résistance à l'apoptose n'est que le reflet d'un niveau moins élevé de lésions; 2)la résistance à l'apoptose est en rapport avec le blocage du programme de mort cellulaire en dépit d'un niveau élevé de lésions. Nous envisagerons successivement ces deux hypothèses, chacune d'entre elles ouvrant des perspectives pharmacologiques radicalement différentes.

La résistance à l'apoptose dans certaines cellules leucémiques peut être en rapport avec la diminution de l'interaction de la daunorubicine avec sa ou ses cible(s) reconnue(s). En effet, la daunorubicine agit par plusieurs mécanismes incluant l'interaction directe avec les membranes, la génération de radicaux libres en rapport avec la peroxydation des lipides et l'altération du métabolisme oxydatif mitochondrial, l'intercalation dans l'ADN et surtout l'interaction avec la topo-isomérase II. On conçoit donc que des anomalies de transport, une augmentation des défenses anti-oxydatives, des modifications qualitatives et/ou quantitatives de la topo-isomérase II puissent avoir pour conséquence une diminution des lésions induites par la daunorubicine. L'extrême complexité de son mécanisme d'action et la diversité des mécanismes de résistance rendent pratiquement impossible la mesure de l'ensemble des interactions daunorubicine-cibles. Il est donc possible que la daunorubicine génère dans ces cellules un moindre niveau de lésions. De fait, les cellules KG1, TF-1 et HEL présentent des altérations du transport transmembranaire de la daunorubicine en rapport avec la surexpression de la P-glycoprotéine (P-gp)[37], des modifications du transport intracellulaire de la daunorubicine[38], un taux intracellulaire de glutathion particulièrement élevé (résultats non publiés) ainsi qu'une capacité particulière à réparer les coupures liées à la topo-isoméraseII[39]. Ainsi, la résistance à l'apoptose n'est peut-être qu'un paramètre anecdotique, simple conséquence de mécanismes de résistance situés en amont ou au niveau de l'interaction agent cible. Si tel est le cas, on conçoit que la restauration du phénomène d'apoptose passe essentiellement par la levée de ces mécanismes de résistance. En faveur de cette hypothèse plaide un travail antérieur montrant que le co-traitement par un antagoniste de la P-gp (le vérapamil) et d'un inhibiteur de la synthèse de glutathion (buthionine sulfoximine) restaure une réponse apoptotique à la daunorubicine dans les cellules KG1[12].

Une autre interprétation est de considérer que la résistance à l'apoptose n'est pas en rapport avec une diminution des lésions mais avec le blocage des signaux apoptotiques. En faveur de cette hypothèse plaide la résistance à l'apoptose de ces cellules après exposition à des effecteurs cytotoxiques aussi différents que la daunorubicine, les rayonnements ionisants et le TNFa. Si tel est le cas, on conçoit que la restauration du phénomène d'apoptose dans les cellules résistantes passe par de nouvelles stratégies de manipulations pharmacologiques visant à réprimer dans les cellules résistantes les facteurs qui bloquent les voies de signalisation conduisant à l'apoptose.

CONCLUSION

L'apoptose induite par les agents antitumoraux met en jeu un réseau d'événements coordonnés et hautement contrôlés par un ensemble complexe constitué par le taux de précurseurs lipidiques hydrolysables, l'activité et l'inductibilité de phospholipases critiques, le taux et la nature des médiateurs lipidiques libérés, l'activité de sérine thréonine et tyrosine kinases, l'expression et l'activité de certains oncogènes, l'activation de protéases, le statut de l'équilibre oxydatif et l'activité de facteurs transcriptionnels. Bien que la caractérisation des voies de signalisation activées par les agents antitumoraux soit encore largement incomplète, il apparaît que ces agents induisent en parallèle la génération de médiateurs apoptotiques et de médiateurs potentiellement impliqués dans la survie. Les interactions entre ces deux types de signalisation pourraient conditionner la nature de la réponse cellulaire. Cet équilibre peut être défavorablement modifié par des facteurs propres à la cellule et/ou par des signaux environnementaux. Ce constat ouvre de larges champs d'investigation qui pourraient aboutir à définir des agents pharmacologiques capables de faciliter, en réponse aux lésions, l'activation d'un programme de mort cellulaire.

Remerciements

Ce travail est financé en partie par l'INSERM, l'ARC (contrat 6749), le Centre Claudius Régaud, la Région Midi-Pyrénées, la Fondation contre la Leucémie, et la Ligue contre le Cancer.

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