ARTICLE
Les signaux, facteurs et gènes requis pour la différenciation
et le développement des cellules souches hématopoïétiques
en lymphocytes T ne sont pas complètement élucidés.
Cela contraste avec l'abondance des données sur le développement,
la différenciation et l'activation des cellules T dans le thymus
ou en périphérie [1]. Pouvoir contrôler la production
de cellules T à partir de progéniteurs hématopoïétiques
serait un progrès d'importance pour les stratégies de thérapie
génique ciblant le système immunitaire ou pour traiter plusieurs
types de déficits immunitaires, par exemple ceux qu'entraîne
une chimiothérapie à haute dose.
Chez l'homme, les lymphocytes, comme toutes les autres cellules hématopoïétiques,
sont produits par la différenciation constante de cellules souches
hématopoïétiques et de progéniteurs exprimant
la molécule de surface CD34. Cela est attesté in vivo
chez l'homme par le succès des transplantations autologues et
allogéniques de cellules CD34+ [2]. Nous avons montré
chez la souris que la transplantation, chez des receveurs létalement
irradiés, de progéniteurs hématopoïétiques
de moelle osseuse (MO) exprimant la molécule CD34 protège
à court terme contre les conséquences de l'irradiation
et reconstitue le système lympho-hématopoïétique
à long terme. En particulier, les cellules CD34+ murines
contiennent des progéniteurs préthymiques [3]. De ce fait,
il est possible d'utiliser, chez la souris comme chez l'homme, un marqueur
unique CD34 pour isoler la majorité des progéniteurs hématopoïétiques.
À noter que, chez la souris, il existe une rare population de
cellules souches hématopoïétiques CD34-
(fréquence de 0,005 % dans la moelle osseuse) qui est relativement
dépourvue de progéniteurs clonogéniques in vitro
et qui contribue à peu près à 50 % de l'activité
de reconstitution hématopoïétique à long terme
(Morel et al., manuscrit soumis et [4]). Chez l'homme, comme
chez la souris, les cellules hématopoïétiques CD34+
sont hétérogènes, contenant des cellules ayant
des phénotypes membranaires et des fonctions très divers.
Parmi les cellules CD34+, se trouvent de véritables
cellules souches hématopoïétiques ayant la possibilité
de reconstituer le système hématopoïétique
à long terme et douées d'une capacité de prolifération
considérable (selon les estimations les plus optimistes, la proportion
de cellules souches hématopoïétiques n'excède
pas 0,05 % des cellules de moelle osseuse chez l'homme et la souris).
La majorité des cellules CD34+ est constituée
de progéniteurs moins primitifs. Ces sous-populations CD34+
peuvent être isolées par cytométrie en flux et leur
activité caractérisée dans des tests de différenciation
et de prolifération cellulaire.
Systèmes
expérimentaux d'identification des progéniteurs des lymphocytes
T
La mise au point de tests performants et reproductibles est essentielle
pour identifier les progéniteurs des lymphocytes T dans les différents
tissus hématopoïétiques.
Les progéniteurs T sont capables de se développer au
sein du micro-environnement thymique qui est propice à leur différenciation
et à leur croissance. Expérimentalement, ces conditions
favorables sont recréées en induisant la colonisation
de fragments de thymus (humain ou murin) par les progéniteurs
T. Les fragments thymiques sont rendus permissifs à la colonisation
par de nouveaux progéniteurs après déplétion
des thymocytes endogènes, obtenue après traitement par
la 2-déoxyguanosine ou après culture à basse température
et irradiation, les progéniteurs étant introduits par
micro-injection ou par contact direct. Alternativement, les thymus de
souris SCID immunodéficientes peuvent être utilisés
sans prétraitement car ils sont naturellement réceptifs
à la colonisation par de nouveaux progéniteurs [5]. Les
progéniteurs T humains peuvent se différencier dans des
fragments de thymus foetal humain [6] ou dans des fragments de thymus
de souris adultes ou foetaux [7, 8]. Les fragments thymiques ensemencés
sont cultivés in vitro en culture organotypique [9], ou
bien sont implantés sous la capsule rénale de souris immunodéficientes
SCID, ce qui permet dans les deux cas de conserver la structure tridimensionnelle
de l'organe [3, 10]. L'implantation dans les souris SCID, mise au point
par Péault et al. [6], favorise un bon développement
du thymus ectopique et une croissance généralement prolongée
pendant 6semaines, voire 15 semaines ou plus. Utilisant cette approche
(figure 1), nous avons
détecté un potentiel de repopulation thymique dans les
cellules CD34+ humaines adultes de moelle osseuse et de sang
périphérique après que la mobilisation des progéniteurs
ait été induite par un traitement par des cytokines et/ou
chimiothérapique, ainsi que dans des suspensions de foie foetal,
moelle osseuse foetale ou de sang de cordon [11-13]. De même chez
la souris, l'implantation de fragments thymiques in vivo donne
des résultats supérieurs à ceux obtenus après
culture organotypique in vitro pour la détection des progéniteurs
T. Les différences allogéniques permettent de distinguer
les cellules T endogènes de celles nouvellement produites. L'utilisation
de multiples fluorochromes permet une analyse simultanée en cytométrie
de flux des thymocytes du donneur et/ou receveur avec divers marqueurs
de différenciation T. Les thymus humains implantés dans
les souris SCID contiennent une majorité (plus de 60-70 %) de
thymocytes corticaux dérivés du donneur (CD1+
CD4+ CD8+) ainsi que des thymocytes plus différenciés
(CD4+ CD8- CD3+ ou CD4-
CD8+ CD3+). L'expression de CD3 et du récepteur
T est variable sur les thymocytes, ces antigènes pouvant être
soit très fortement exprimés soit indétectables.
Ce profil est compatible avec les événements de sélection
intrathymique que l'on observe dans un thymus normal. La culture ex
vivo des thymocytes après reconstitution permet de mettre
en évidence des sous-populations de cellules thymiques rares
telles que les cellules T gd qui dérivent aussi des progéniteurs
CD34+ [13].
Une méthode décrite pour étudier la différenciation
in vitro de cellules CD34 en lymphocytes T consiste à
cultiver les progéniteurs sur monocouche de cellules stromales
thymiques foetales en présence de cytokines telles que le ligand
de Flt3 (FL) et l'interleukine (IL)-12 [14, 15]. Dans ces cultures,
les précurseurs CD34+ acquièrent les antigènes
CD2, CD4, CD8 et réarrangent les gènes du récepteur
T mais peu de cellules coexpriment CD4 et CD8 contrairement aux systèmes
utilisant les fragments thymiques tridimensionnels. Parmi les attraits
potentiels de ce système in vitro, il y a la possibilité
de manipuler le processus de différenciation avec des réactifs
biologiques divers, d'analyser les progéniteurs au niveau clonal,
et de mesurer la fréquence des précurseurs T dans une
population donnée.
Un processus de différenciation extrathymique peut être
à l'origine de la production de lymphocytes T et il est possible
que les précurseurs de la lignée extrathymique soient
distincts de ceux de la lignée intrathymique. Chez la souris,
des cellulesT intestinales sont d'origine extrathymique et expriment
un phénotype membranaire particulier avec présence de
l'homodimère CD8aa [16]. L'importance de la voie extrathymique
pour la production de cellules T n'est pas encore clairement établie
chez l'homme, ni dans les conditions physiologiques ni dans des conditions
extrêmes telles qu'après chimiothérapie ou chez
les sujets âgés. Chez la souris, l'expression d'un transgène
codant pour l'oncostatine M exprimée sous le contrôle du
promoteur de p56lck permet d'augmenter la production extrathymique
de cellules T chez les souris athymiques ainsi que l'accroissement de
leur nombre dans les ganglions lymphatiques [17]. Ce système
de différenciation extrathymique est un outil intéressant
pour étudier la contribution des différents progéniteurs
hématopoïétiques à cette voie alternative
de production de cellulesT.
Activité
fonctionnelle de sous-populations de cellules CD34+ humaines
et murines
Les cellules CD34, malgré leur faible nombre, peuvent être
subdivisées en sous-populations d'activité hématopoïétique
variable. Des efforts considérables accomplis par de nombreux
groupes ont abouti à la caractérisation des cellules souches
hématopoïétiques chez l'homme et la souris, permettant
de les isoler grâce à leur phénotype membranaire
et d'étudier leurs propriétés biologiques [18-24].
Activité progéniteur T des cellules
souches hématopoïétiques
Des populations enrichies en cellules souches hématopoïétiques
humaines, comme les cellules de phénotype CD34+ Thy-1+
isolées à partir de suspensions de foie foetal ou de moelle
osseuse foetale, de moelle osseuse adulte ou de sang périphérique
après traitement par des cytokines [19, 21] sont capables de
se différencier en cellules T après injection directe
dans le thymus. Ceci est une preuve directe de la compétence
du micro-environnement thymique pour la différenciation des cellules
souches hématopoïétiques en cellules T et confirme
le caractère multipotentiel des cellules souches hématopoïétiques.
Expression de CD45RA sur les progéniteurs
T de la moelle osseuse humaine
L'analyse du potentiel hématopoïétique des cellules
CD34+ de la moelle osseuse humaine indique que l'activité
de repopulation thymique n'est pas toujours superposable à l'activité
de reconstitution hématopoïétique à long terme
et la capacité de différenciation en multiples lignées
hématopoïétiques (tableau
I). On trouve les progéniteurs T au sein de populations
très appauvries en activité de cellules souches hématopoïétiques
comme les cellules CD34+ Thy-1-, CD34+
CD38+, CD34+ c-kithi ou CD34+
CD45RA+[19-24].
CD45RA représente l'isoforme de poids moléculaire élevé
de CD45 et identifie très distinctement deux populations de cellules
CD34+ dans la moelle osseuse humaine permettant leur séparation
par cytométrie de flux [12]. Les cellules n'exprimant pas CD45RA
contiennent les cellules CD34+ Thy-1+ ou CD34+
CD38- qui sont enrichies en cellules souches hématopoïétiques.
Au contraire, la sous-population de cellules CD34+CD45RA+
est très appauvrie en précurseurs érythroïdes
clonogéniques, ne peut pas repeupler des fragments d'os humains
implantés dans des souris SCID et ne donne pas naissance à
des cultures in vitro à long terme [12, 24]. Malgré
cela, les cellules CD34+ CD45RA+ sont capables
de repopulation thymique et la fréquence des progéniteurs
T y est plus grande que dans les populations CD34+ CD45RA-
[12]. Qualitativement, ces deux types de progéniteurs produisent
des populations T comparables, avec une grande majorité de thymocytes
corticaux, des cellules T exprimant le récepteur ab ou gd.
Expression de l'antigène CD45RA sur les précurseurs
lymphoïdes dans la moelle osseuse de souris
Nous avons récemment montré que la molécule CD34
est exprimée sur les progéniteurs hématopoïétiques
primitifs chez la souris [3]. Dans la moelle osseuse de souris, à
peu près 25 % des cellules CD34+ co-expriment CD45RA
(épitope14,8) avec une intensité variable. Le marqueur
B220 (épitope RA3-6B2) reconnaît aussi une isoforme de
poids moléculaire élevé de CD45 mais est distinct
de CD45RA [25]. Les cellules CD34+ CD45RA+ dans
la moelle osseuse de souris, de même que les cellules humaines
de même phénotype, contiennent peu de progéniteurs
clonogéniques érythroïdes et primitifs de type CFU-GEMM.
Les cellules CD34+ CD45RA+ produisent très
peu de colonies spléniques in vivo(tableau
II), sont incapables de reconstituer la moelle à long
terme et ne protègent pas les animaux contre une irradiation
à des doses létales. Néanmoins, les cellules de
moelle osseuse murine CD34+ CD45RA+ ont un potentiel
lymphoïde. Lorsqu'elles sont cultivées en présence
de cellules stromales murines Sys-1, elles produisent des cellules B
exprimant B220 et l'IgM de surface in vitro et ce, plus rapidement
que ne le font des cellules CD34+ CD45RA- ([26]
et Galy et Morel, manuscrit en préparation). Les cellules CD34+
CD45RA+ sont capables de se différencier en cellules
T et reconstituent des lobes de thymus foetaux de souris SCID réimplantés
ectopiquement in vivo [3]. Comme le montre la figure
2, les cellules CD34+ CD45RA+ et CD34+
CD45RA- contiennent toutes deux des progéniteurs T.
Ainsi, les cellules de moelle osseuse humaine et murine qui co-expriment
les antigènes CD34 et CD45RA représentent des progéniteurs
hématopoïétiques lymphomyéloïdes distincts
des cellules souches hématopoïétiques et plus matures.
Ces résultats confirment que chez la souris et chez l'homme,
l'activité de repopulation thymique ne se superpose pas toujours
à l'activité de reconstitution hématopoïétique
à long terme. D'autre part, il est possible de distinguer par
leur phénotype les progéniteurs érythroïdes
(CD45RA-) et ceux des lignées lymphoïdes et myéloïdes,
permettant une définition phénotypique précise
du processus de différenciation hématopoïétique.
Identification
de progéniteurs de moelle osseuse humaine dont le potentiel de
différenciation est restreint aux lignées lymphoïdes
et dendritiques
Dans la moelle osseuse humaine, existe une sous-population de cellules
CD34+ CD45RA+ qui exprime CD10 mais est Lin-,
c'est-à-dire est dépourvue des antigènes spécifiques
de lignée (« Lin ») incluant CD19, CD2, CD14, CD15,
CD56 et glycophorine A. Ces cellules CD34+ Lin-
CD10+ représentent à peu près 5 % des
cellules CD34+ Lin- dans la moelle osseuse adulte.
Cette petite population est fonctionnellement et phénotypiquement
distincte des cellules souches hématopoïétiques car
elle n'exprime ni Thy-1 ni c-kit, elle exprime CD38 et CD45RA, ne peut
pas repeupler des fragments d'os humain implantés chez les souris
SCID et ne contient pas d'activité clonogénique myéloïde
ou érythroïde in vitro [27]. En revanche, les cellules
CD34+ Lin- CD10+ contiennent des progéniteurs
T. Des nombres de cellules très faibles (moins de 500 cellules)
CD34+ Lin- CD10+ peuvent repeupler
un fragment thymique pendant 8 semaines avec production d'un grand nombre
de thymocytes corticaux exprimant CD1a, CD4 et CD8. Par contre, au-delà
de 11semaines, ces thymocytes se sont différenciés, comme
en témoigne la perte de CD1 et la forte densité de l'antigène
CD3. Cette cinétique suggère que la reconstitution à
partir de progéniteurs T CD34+ Lin- CD10+
est limitée et que le potentiel prolifératif de ces progéniteurs
est inférieur à celui d'autres populations CD34+.
La culture en présence d'IL-2 révèle que la population
CD34+ Lin- CD10+ contient des progéniteurs
pour les cellules natural killer (NK). La fréquence de
précurseurs NK est plus élevée dans la population
CD34+ Lin- CD10+ que dans le reste
des CD34+ [27]. La culture sur la lignée stromale
murine Sys-1 en présence des cytokines IL-3, IL-6 et LIF montre
que la population CD34+ Lin- CD10+
contient des progéniteurs B. La différenciation en cellules
B exprimant CD10 ou CD19 s'accompagne de la perte d'expression de CD34
en culture. La production de cellules B est obtenue plus rapidement
à partir de cellules CD34+ CD10+ qu'à
partir des cellules CD34+ CD10-(figure
3). Quelles sont les relations entre les différents progéniteurs
? Nous avons montré que les cellules CD34+ CD45RA-
peuvent se différencier in vitro et acquièrent
le phénotype CD34+ CD45RA+ et en conséquence
une activité de repopulation thymique [12]. La figure
3 illustre la production in vitro de cellules CD34+
CD10+ à partir de cellules CD34+
CD45RA+ CD10- (voir encadré). Nous en déduisons
que dans la hiérarchie hématopoïétique, le
degré d'immaturité du progéniteur est inversement
corrélé au temps nécessaire à la production
des cellules lymphoïdes suivant la séquence: CD34+
CD45RA- > CD34+ CD45RA+ CD10-
> CD34+ CD45RA+ CD10+. Il est important
de remarquer que la population CD34+ CD45RA- qui
contient les cellules souches hématopoïétiques [12,
24] ne produit pas de cellules B in vitro à court terme,
mais est capable de produire des cellules B in vitro à
long terme, après 5 semaines de culture ou in vivo après
injection dans des fragments d'os implantés chez la souris SCID
[12]. Cette réponse tardive est compatible avec la présence
de cellules très primitives dans cette population.
Bien que les cellules CD34+ Lin- CD10+
soient incapables de donner naissance à des colonies myéloïdes
in vitro en culture semi-solide, elles peuvent produire des cellules
dendritiques exprimant les antigènes CD33, CD1a, CD86, CD40,
CD80 et HLA-DR [27]. Les cultures effectuées à dilution
limite et en présence de cellules stromales et de cytokines permettent
d'identifier, parmi les cellules CD34+ Lin- CD10+,
des clones de progéniteurs communs aux cellules B, NK et dendritiques.
Le potentiel T n'a pas été testé dans ces systèmes
à l'échelon pauci-cellulaire.
Ces résultats indiquent que les cellules de moelle osseuse co-exprimant
les antigènes CD34 et CD10 mais dépourvus des marqueurs
« Lin » de cellules différenciées, représentent
un progéniteur commun et restreint aux trois lignées de
lymphocytes et aux cellules dendritiques. Ce progéniteur identifié
dans la moelle osseuse adulte est également présent dans
la moelle osseuse foetale mais est pratiquement absent du sang périphérique
après «mobilisation » par cytokines et chimiothérapie.
Ces observations suggèrent des relations étroites entre
les lignées des cellules dendritiques et des lymphocytes, les
cellules dendritiques étant plus proches des lymphocytes que
des monocytes. En effet, il est possible d'observer des précurseurs
dendritiques distincts de ceux des monocytes/macrophages [28]. La filiation
étroite entre lymphocytes et cellules dendritiques est confirmée
par la caractérisation de précurseurs communs pour les
cellules T, B et dendritiques dans le thymus de souris [29]. Il reste
à démontrer si les cellules dendritiques lymphoïdes
ont des activités biologiques distinctes d'autres cellules dendritiques.
Nos résultats vont dans le sens de ceux de Gore et al.
[30] suggérant que les cellules CD34+ Lin-
CD10+ sont des «cellules souches» lymphoïdes.
En effet, nous montrons que ces cellules ont la capacité de se
différencier en cellules T, B, NK et dendritiques. Par contre,
ces cellules n'ont pas de potentiel de prolifération élevé,
le terme de progéniteur lymphoïde/dendritique est donc peut-être
plus approprié que celui de « cellule souche ».
Quelle
est la nature des pro-thymocytes ?
Le débat sur la nature des progéniteurs qui colonisent
le thymus de façon physiologique reste ouvert. Des progéniteurs
de phénotype très primitif ont été identifiés
dans le thymus foetal suggérant que des cellules souches hématopoïétiques
peuvent peut-être s'introduire physiologiquement dans le thymus
foetal humain pour produire des cellules T [31]. Néanmoins, il
y a peu d'activité cellules souches hématopoïétiques
dans le thymus. Nos résultats ainsi que ceux obtenus par Spangrude
et al. chez la souris [32] ont montré que des progéniteurs
distincts des cellules souches hématopoïétiques peuvent
repeupler le thymus et notre hypothèse est que des progéniteurs
partiellement différenciés, tels que les cellules CD34+
CD10+, peuvent émigrer hors de la moelle osseuse pour
coloniser le thymus. En effet les thymocytes immatures chez l'homme
et la souris peuvent aussi se différencier en cellules B, NK
et dendritiques [29, 33-36]. Dans le thymus foetal humain, les thymocytes
immatures expriment CD34, CD45RA, peu ou pas CD38; Thy-1 n'est pas exprimé
de même que les marqueurs associés aux cellules T tels
que CD2 ou CD5. Ce phénotype correspond à celui des cellules
CD34+ Lin- CD10+ de moelle osseuse
[27]. En ce qui concerne la moelle osseuse, puisque l'on trouve des
progéniteurs T à potentiel hématopoïétique
restreint distincts des cellules souches hématopoïétiques,
nous supposons que le processus de différenciation lymphoïde
commence avant l'entrée dans le thymus. En faveur de cette hypothèse,
des travaux récents montrent que l'on peut identifier dans le
sang périphérique des progéniteurs ayant un récepteur
pré-T [37, 38]. Les progéniteurs T poursuivant la voie
de différenciation intrathymique ne se différencient de
façon définitive probablement qu'après leur entrée
dans le thymus et cet événement est peut-être marqué
par l'acquisition du marqueur CD5 [33]. L'analyse complète du
potentiel de différenciation de la population CD34+
Lin- CD10+ nous conduit donc à spéculer
que ces cellules pourraient représenter des pro-thymocytes qui
dans des conditions physiologiques émigrent hors de la moelle
osseuse et colonisent le thymus. Bien que ces cellules ne soient pas
présentes dans le sang périphérique mobilisé
par cytokines et chimiothérapie, il est possible de les identifier
dans le sang périphérique normal, ce qui confirme qu'elles
circulent hors de la moelle osseuse à l'état physiologique
[39].
CONCLUSION
Nous avons caractérisé chez l'homme et la souris des sous-populations
de progéniteurs T, distincts des cellules souches hématopoïétiques,
qu'il est possible d'isoler grâce à leur phénotype
membranaire. Nous suggérons que, dans la moelle osseuse, une des
étapes précoces de la différenciation des cellules
souches hématopoïétiques en lymphocytes T soit marquée
par l'expression des antigènes CD45RA et CD10, stade qui s'accompagne
aussi de la perte graduelle du potentiel totipotent. Le schéma
hypothétique proposé sur la figure
4 illustre, chez l'homme, les différentes étapes
de la production de cellules T à partir de cellules souches hématopoïétiques.
L'existence de progéniteurs intermédiaires entre cellules
souches hématopoïétiques et cellules T suggère
qu'une certaine prédifférenciation lymphoïde prend
place avant la colonisation du thymus. Cette hypothèse ouvre la
voie à l'étude des gènes et facteurs impliqués
dans le processus de différenciation lymphoïde. Parmi les
candidats, citons l'IL-7 qui est une cytokine d'importance pour la production,
la survie et la croissance des cellules T et B [8] et Ikaros, un facteur
transcriptionnel impliqué dans la régulation des promoteurs
pour de nombreux gènes des cellules T. Ikaros est essentiel à
la production de toutes les lignées lymphoïdes chez la souris
[40] et est exprimé dans les cellules humaines CD34+
de moelle osseuse, particulièrement les cellules CD34+
Lin- CD10+ (Galy, manuscrit en préparation).
Grâce à ces informations, nous espérons comprendre
les mécanismes mis en jeu dans la production de cellules T. Cela
permettra de développer de nouvelles stratégies immunothérapiques,
particulièrement dans le contexte des transplantations de cellules
souches hématopoïétiques et d'une approche de thérapie
génique capable de modifier durablement les lymphocytes T et autres
cellules du système immunitaire. La cartographie des étapes
de différenciation des cellules souches hématopoïétiques
et la compréhension de la filiation des cellules lymphoïdes
et dendritiques par rapport aux cellules myéloïdes ont des
implications importantes pour comprendre la structuration du système
immunitaire et les mécanismes responsables des pathologies leucémiques.
Remerciements
Les auteurs voudraient remercier Ben Chen et Steve Szilvassy
pour avoir soutenu ce projet et Marilyn Travis et Dazhi Cen pour leur
expertise technique. Nos remerciements à Laure Coulombel pour son
aide éditoriale.
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