Cellules souches hématopoïétiques intraembryonnaires chez la souris : encore plus tôt

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L'émergence des cellules souches hématopoïétiques chez l'embryon est un thème d'actualité, depuis la démonstration relativement récente que certaines des règles qui président à cet événement chez l'embryon des vertébrés sont très générales et, en particulier, sont valables chez les mammifères [1, 2]. On sait depuis longtemps qu'il existe chez l'adulte un réservoir de cellules souches hématopoïétiques qui se répartit entre les organes hématopoïétiques, et que, au cours de la vie embryonnaire, ces cellules prennent naissance ailleurs que dans les ébauches qui donnent le composant stromal des organes hématopoïétiques de l'adulte. L'organisme embryonnaire très jeune répond à la nécessité urgente de pourvoir à ses premiers échanges respiratoires par la production d'une génération primitive de globules rouges caractérisés par leur différenciation synchrone, leur assortiment particulier d'hémoglobines et un site spécifique d'hématopoïèse, l'îlot ventral chez les amphibiens, le sac vitellin chez les poissons et les amniotes. Ce site primitif promeut à la fois l'émergence de progéniteurs, mais aussi leur expansion, leur détermination et la différenciation de leur descendance. Le sac vitellin diffère donc des organes hématopoïétiques définitifs dont les ébauches sont colonisées par des cellules souches hématopoïétiques extrinsèques. Des greffes orthotopiques de territoires marqués chez le jeune embryon d'oiseau et d'amphibien ont permis d'établir que ces cellules ne participent pas à la formation du système sanguin définitif et s'éteignent relativement vite [1-3]. Elles sont remplacées par des cellules d'origine intraembryonnaire, qui se déterminent, au moins en partie, dans la région de l'aorte [4, 5]. L'émergence de ces cellules souches hématopoïétiques intraembryonnaires a lieu à un stade précoce du développement, qui suit cependant l'émergence et la différenciation des cellules sanguines extra-embryonnaires.

L'embryon de mammifère n'est pas (ou peu) accessible à l'expérimentation pendant les phases de la morphogenèse et de l'organogenèse. Aussi des tactiques différentes, inspirées des tests appliqués à l'étude du système hématopoïétique adulte, mais adaptées à l'identification des très petites populations cellulaires concernées, ont-elles été nécessaires pour explorer cette question. Des cellules souches hématopoïétiques intraembryonnaires ont ainsi pu être mises en évidence chez la souris [6, 7]. Dans une première phase de ces expériences, ces cellules souches hématopoïétiques ont été détectées relativement « tard », aux stades de 15 à 40 somites (8,5-11 jours de gestation = jours post-coïtum), dans la splanchnopleure paraaortique (P-Sp) (figure 1) [6-8], alors que la circulation entre le sac vitellin et l'embryon est déjà fonctionnelle. Il était donc impossible d'affirmer que les cellules détectées avaient été originellement produites dans l'un ou l'autre compartiment.

Nous avons transposé cette démonstration, à la phase précirculatoire du développement, c'est-à-dire pendant la fin de gastrulation, alors que les somites sont en train de se segmenter. (L'achèvement du réseau endothélial et l'établissement de la circulation ont lieu chez la souris au stade de 8 paires de somites à 8,5 jours post-coïtum,figure 1). Le système de culture cellulaire en deux temps (expansion/différenciation), qui avait permis de détecter des progéniteurs multipotentiels à partir du stade de 15 somites (8,5 jours post-coïtum) s'est révélé inefficace dans le cas des embryons plus jeunes. Mais si les tissus à tester sont précultivés, en préservant leur arrangement tridimensionnel (culture organotypique) puis dissociés et soumis à la culture cellulaire en deux temps (figure 2), il devient possible de mettre en évidence des progéniteurs pluripotentiels dans certains d'entre eux [9]. Les différents compartiments de l'embryon (figure 1) ne manifestent pas les mêmes potentialités dans ces conditions : à partir du sac vitellin, nous obtenons seulement des cellules myéloïdes (globules rouges et macrophages), alors que la splanchnopleure intraembryonnaire (Sp ; figure 1), c'est-à-dire le feuillet mésodermique interne accompagné de l'endoderme, donne naissance à des dérivés myéloïdes mais aussi lymphoïdes dans les conditions appropriées pour la différenciation de chaque lignage. C'est seulement après le stade de 10 somites que les précurseurs lymphoïdes commencent à être détectés dans le sac vitellin. Cette apparition retardée indique donc le passage probable des précurseurs intraembryonnaires, via la circulation, vers le sac vitellin.

La signification de ces expériences nous paraît être la suivante : aucune des cellules du mésoderme splanchnopleural de l'embryon proprement dit n'a encore une détermination hématopoïétique avant le stade de 10 paires de somites. Si on préserve les interactions entre les feuillets endodermique et mésodermique, ainsi que les interactions entre les cellules mésodermiques elles-mêmes, ce que réalise la culture organotypique, ces cellules se déterminent ; en d'autres termes, des cellules mésodermiques acquièrent le statut de progéniteurs capables de se différencier dans la voie hématopoïétique. La séparation expérimentale des deux compartiments à la période précirculatoire apporte la démonstration cruciale qu'il y a bien chez la souris des cellules souches hématopoïétiques intraembryonnaires qui relaient les progéniteurs précoces du sac vitellin (que nous prenons soin de nommer progéniteurs et non cellules souches hématopoïétiques). Seules les cellules intraembryonnaires apparaissent totipotentes, et encore verrons-nous plus loin qu'elles ne sont pas dotées de toutes les attributions de la cellule souche hématopoïétique telle qu'elle est définie chez l'adulte.

En parallèle à ce travail dans lequel l'expression de marqueurs a été évaluée après leur émergence in vitro, nous avons également cherché à révéler l'apparition et l'évolution, sur des cellules fraîchement dissociées, d'une panoplie de marqueurs de surface et d'activités géniques spécifiques de cellules hématopoïétiques [10]. Certaines de ces cellules à vocation hématopoïétique peuvent être diagnostiquées grâce à la présence, à leur surface, du récepteur à activité tyrosine kinase c-kit et de l'antigène AA4.1. Ce dernier est présent sur une sous-population de cellules du foie foetal qui comprend, outre les précurseurs lymphoïdes B, les progéniteurs dotés du potentiel de reconstitution à long terme. AA4.1 se restreint à la lignée lymphoïde B pendant l'ontogenèse [11] et est remplacé, sur les cellules souches, par l'antigène Sca-1. Entre 8,5 et 11 jours post-coïtum l'expression de AA4.1 se renforce progressivement, plus rapidement dans la splanchnopleure paraaortique et l'AGM (aorte-gonade-mesonephros) que dans le sac vitellin ou le sang. Ces patrons d'expression coïncident parfaitement avec nos données expérimentales. Il est probable que les progéniteurs détectés dans le sac vitellin continuent à émigrer à partir de l'embryon par voie sanguine. Ainsi, les cellules AA4.1⁺, c-kit⁺ de la circulation intra- et extraembryonnaire (c'est-à-dire du sac vitellin) doivent être libérées par la splanchnopleure paraaortique puis l'AGM. Au niveau génique, l'expression de la recombinase RAG1, propre au lignage lymphocytaire, apparaît en premier lieu dans la splanchnopleure paraaortique à 9,5 jours post-coïtum et dans le sac vitellin 12 à 24 heures plus tard [10], confirmant donc l'ordre établi par les approches expérimentales.

Les données d'une autre équipe complètent et renforcent les nôtres, car leurs expériences, qui portent sur des stades plus tardifs (après 30 paires de somites), et reposent sur la mise en évidence du potentiel de reconstitution in vivo des cellules hématopoïétiques d'origine intraembryonnaire, montrent une évolution de ce potentiel au cours du temps pendant la courte période du développement considéré, c'est-à-dire 8,5 à 11,5 jours post-coïtum. Les tests, classiques, consistent à injecter les cellules dissociées à des souris adultes irradiées. Suivant le délai accordé à la reconstitution, les repères observés sont les CFU-S₁₁(colony-forming-units in the spleen) (progéniteurs à l'origine de colonies observées dans la rate après 11jours) ou les LTR-HSC (long term repopulating hematopoietic stem cells) (précurseurs trouvés dans la rate ou la moelle osseuse 3 à 6 mois après la reconstitution, considérés comme le signe du renouvellement à long terme). Dans leurs premiers travaux [7], ces auteurs décelaient les CFU-S dans la même région que nous (désignée AGM par ces auteurs: figure 1), mais seulement à partir du stade de 31-33 somites, c'est-à-dire à 10 jours post-coïtum. Le terme d'AGM pour aorte-gonades-mesonephros connote la présence d'ébauches qui n'étaient pas encore apparues aux stades précédents. La reconstitution à long terme n'avait été obtenue que dans un nombre de cas médiocre. Comme nous, Dzierzak et al. ont amélioré leurs résultats de manière spectaculaire en soumettant l'AGM à une culture organotypique avant de la dissocier et d'injecter les cellules aux animaux à reconstituer [12]. Dans ces conditions, les CFU-S₁₁ se développent régulièrement dans la rate à partir des cellules de l'AGM de 32-33 paires de somites (10 jours post-coïtum), beaucoup moins fréquemment à partir des cellules du sac vitellin et pas du tout à partir de celles du foie du même âge. L'activité LTR-HSC, décelée 8 mois après la reconstitution, se manifeste dans 89% des cas (24/27) avec l'AGM de 35 à 38 paires de somites (10 jours post-coïtum), et jamais avec le sac vitellin, le foie ou le reste du corps de l'embryon. L'AGM apparaît donc bien comme la région qui initie la production des cellules souches hématopoïétiques définitives et probablement même la région seule responsable de cette production, en tous cas à ce stade du développement.

La conclusion essentielle, qui résulte de la mise en oeuvre de tests différents, est donc la suivante : le groupe d'Elaine Dzierzak démontre que le potentiel de reconstitution à long terme, que l'on considère comme le signe de la présence de cellules souches hématopoïétiques autorenouvelables, apparaît dans l'embryon et non dans le sac vitellin ; nous apportons l'argument crucial qui permet d'écarter l'ensemencement préalable de l'embryon par des cellules du sac vitellin, puisque le sac vitellin séparé de l'embryon avant l'établissement de la circulation ne produit que des précurseurs aux potentialités myéloïdes mais non lymphoïdes, alors que l'embryon privé de sac vitellin développe, lui, l'ensemble de ces potentialités, comme nous l'avons expliqué plus haut. Des artifices expérimentaux ont permis dans les deux séries de travaux de surmonter l'obstacle dû à la très petite taille des populations cellulaires concernées ; de plus l'introduction d'un épisode de culture in toto a permis dans les deux cas de reculer la date du développement à partir de laquelle l'émergence des progéniteurs a pu être démontrée. Il est clair que la culture organotypique préserve des interactions cellulaires nécessaires à la détermination des progéniteurs, et permet leur accumulation in situ, puisque l'émigration vers les ébauches à coloniser est supprimée.

Plusieurs points d'interrogation se profilent à la suite de ces avancées. L'un concerne la relation de développement entre les populations successives de précurseurs révélées par ces expériences, dans le sac vitellin, la splanchnopleure paraaortique et l'AGM (figure 1). Il est clair que les précurseurs apparus dans le sac vitellin à 7 jours post-coïtum s'engagent entièrement dans la différenciation érythroïde primitive et sont suivis par une génération distincte qui se détermine dans la splanchnopleure et dont le potentiel de différenciation et de maintenance est plus étendu. En revanche, la relation entre précurseurs de la splanchnopleure paraaortique et ceux de l'AGM est inconnue et pourrait s'expliquer de deux façons. Selon la première hypothèse, les progéniteurs de l'AGM pourraient être indépendants de ceux de la splanchnopleure paraaortique, résultant d'un processus de détermination à partir de mésoderme resté totipotent dans cette région de l'embryon ; la détermination de cellules mésodermiques vers la voie hématopoïétique se poursuivrait donc un certain temps pendant la vie embryonnaire, peut-être même à des époques plus tardives que celles qui ont été explorées. Selon la deuxième hypothèse, les précurseurs de l'AGM pourraient, au contraire, être issus de la réplication de ceux de la splanchnopleure paraaortique. Cette question n'est pas purement théorique, puisque les précurseurs détectables dans ces deux structures, qui pourtant dérivent l'une de l'autre, n'ont pas le même potentiel, seuls les progéniteurs de l'AGM étant des LTR-HSC. En effet Dzierzak et al. ne trouvent pas de LTR-HSC avant le stade de 32-33 somites, ce que confirment nos propres essais comparatifs sur la splanchnopleure paraaortique testée dans le modèle des souris adultes irradiées. De plus, les capacités de différenciation des cellules souches hématopoïétiques changent tout au long du développement embryonnaire et foetal, comme l'attestent non seulement leurs capacités d'autorenouvellement plus ou moins étendues, mais aussi les commutations moléculaires caractéristiques dans différentes lignées (hémoglobines, choix des séquences réarrangées dans les lymphocytes T, par exemple) [13-14]. Ces commutations pourraient être sous-tendues par l'émergence de générations successives, distinctes les unes des autres, où s'activeraient des gènes distincts. Elles pourraient au contraire résulter soit de changements au cours de mitoses successives, soit de changements dans le micro-environnement auquel sont confrontés les progéniteurs lors de leur évolution ultérieure.

Dans la première hypothèse (émergence de générations successives), se dégage l'idée que les progéniteurs de la splanchnopleure présents à 8-10 jours post-coïtum constitueraient une population différente de celle de l'AGM, qui elles seules, seraient responsables de la colonisation du foie foetal, mais peut-être également de la rate et de la moelle osseuse. En effet, l'analyse du potentiel de différenciation des cellules circulantes montre que les progéniteurs multipotents atteignent une fréquence maximale à 12 jours post- coïtum, puis chutent de façon dramatique pour être remplacés, de façon quasi complète, à 14 jours post-coïtum, par des précurseurs commis [11]. La rate et la moelle osseuse doivent donc être colonisées bien avant 14 jours post-coïtum, ce qui rend possible une colonisation de ces ébauches par des progéniteurs de l'AGM. Dans la deuxième hypothèse (filiation entre les différentes générations), l'absence du potentiel de reconstitution à long terme des cellules de la splanchnopleure paraaortique s'expliquerait par leur incapacité à se développer directement dans le micro-environnement de la moelle osseuse adulte. À l'appui de cette interprétation, viennent les récentes reconstitutions de souriceaux nouveau-nés dont le système hématopoïétique a été déprimé par le traitement de la mère au busulfan [15]. Dans ce nouveau système, la reconstitution à long terme peut être obtenue à partir du sac vitellin d'embryons de 9 jours post-coïtum [16]. Dans le test classique, ce tissu n'est capable de LTR qu'à partir de 11 jours post-coïtum [15]. Encore une fois, nous estimons probable que les LTR-HSC détectées dans le sac vitellin tirent leur origine du compartiment intraembryonnaire, c'est-à-dire à ce stade de développement de la splanchnopleure paraaortique. Cela dit, cette inadaptation à l'implantation et/ou au renouvellement à long terme dans la moelle osseuse adulte des progéniteurs de l'embryon de moins de 10 jours post coïtum doit résulter, elle aussi, d'une différence des qualités intrinsèques de ces progéniteurs.

Le deuxième point d'interrogation est celui de l'hémangioblaste, précurseur commun hypothétique des lignages hématopoïétique et endothélial. Les premiers arguments concrets en faveur de son existence ont été avancés. Tout d'abord des souris portant une mutation inactivante du gène flk-1, qui code pour un des récepteurs au VEGF (VEGF-R2), ont été créées [17]. Les embryons homozygotes flk1^-/- meurent à 8 jours post coïtum, avec une déficience profonde de leur réseau endothélial et de leur hématopoïèse, double défaut qui pouvait indiquer soit une racine commune aux deux lignages, soit une déficience de l'hématopoïèse secondaire au déficit endothélial. Cette deuxième possibilité est en partie écartée du fait qu'aucune cellule hématopoïétique flk1^-/- n'est présente chez les chimères flk1^-/- , flk1^+/+, en dépit de la présence des cellules endothéliales du partenaire « sauvage » (et bien entendu des cellules hématopoïétiques du partenaire sauvage). Cependant, certains dérivés hématopoïétiques ont pu être obtenus à partir de cellules ES flk^-/^-.

D'autre part, chez l'embryon de poulet, des cellules triées à partir du jeune blastodisque pour l'expression de VEGF-R2 (dit Quek 1), ensemencées dans un milieu semi-solide sans ajout de facteurs de croissance, donnent naissance à des colonies hématopoïétiques-clonales [18]. Mais si du VEGF est introduit dans le milieu de culture, des colonies endothéliales apparaissent, le nombre des colonies hématopoïétiques diminuant à leur profit.

Les cellules VEGF-R2⁺ ont donc la capacité à se différencier dans les deux lignages. Par ailleurs, si on introduit, dans le milieu originel - sans facteur de croissance - le récepteur VEGF-R2 sous forme soluble, le nombre des colonies hématopoïétiques est significativement diminué sans compensation par une augmentation du nombre des colonies endothéliales [18]. Selon l'interprétation proposée par les auteurs, le VEGF-R2 soluble agirait en captant un ligand autre que le VEGF ; ce ligand serait celui qui détourne le progéniteur commun - l'hémangioblaste - vers la voie hématopoïétique. Ce ligand hypothétique pourrait être un ligand déjà connu ou encore à identifier.

Le fait qu'aucune colonie mixte ne se développe jamais semble à l'encontre de l'hypothèse de l'hémangioblaste. Il est donc intéressant de constater que l'hématopoïèse intraaortique illustre in vivo l'impossibilité de la co-existence entre cellules-filles de l'hémangioblaste, endothéliales et hématopoïétiques : des cellules bourgeonnent à partir du plancher dans la lumière du vaisseau, avec un aspect absolument stéréotypé, chez l'oiseau [19-20], chez la souris [21] et chez l'homme [22]. Caractérisant les affinités immunocytologiques de ces bourgeonnements chez le poulet, nous observons que le marquage endothélial par l'anticorps dirigé contre VEGF-R2 disparaît à leur niveau et est remplacé par l'expression de l'antigène CD45 ; le plancher de l'aorte embryonnaire est alors une mosaïque composée de cellules à phénotype endothélial et de cellules à phénotype hématopoïétique (Jaffredo et Dieterlen-Lièvre, en préparation). De plus la détermination des lignages cellulaires à l'aide d'un gène rapporteur transduit par un vecteur rétroviral ne révèle jamais de clones bipotents.

CONCLUSION

REFERENCES

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