Apport de la FISH dans l'étude des remaniements acquis des chromosomes 5 et 7

ARTICLE

En 1974, Van den Berghe et al. [1] rapportaient un tableau hématologique particulier associant une délétion partielle du bras long du chromosome 5 et une anémie réfractaire macrocytaire avec dysplasie mégacaryocytaire chez des patients âgés, le plus souvent de sexe féminin. Ce "syndrome 5q -", très étudié et considéré comme de bon pronostic, se caractérise par une délétion de taille variable, mais incluant au minimum une disparition de la bande 5q31 considérée comme le segment critique nécessaire et suffisant pour l'apparition du syndrome [2, 3]. Assez vite cependant, la délétion 5q a été observée dans des contextes voisins mais différents : syndromes myélodysplasiques (SMD) secondaires, leucémies aiguës de novo ou secondaires (LAM) [4-7]. Dans les cas de SMD/LAM secondaires, la del(5q) est souvent associée à d'autres anomalies chromosomiques, en particulier du chromosome 7. Cette association a été observée par Rowley et al. [8] dès 1977 dans les hémopathies compliquant les traitements de la maladie de Hodgkin et des lymphomes malins, et par Mitelman et al. [9] dans les suites d'exposition professionnelle ou accidentelle à certains agents génotoxiques. Ces données ont été confirmées par d'autres groupes [10, 11]. L'observation d'une délétion 5q associée à une translocation révélée par FISH (fluorescence in situ par hybridation) nous a amenés à reprendre systématiquement par cette technique plusieurs cas de délétion (5q), avec ou sans "syndrome 5q -".

Nos observations se fondent sur une série de 147 SMD/LAM étudiés de janvier 1994 à janvier 1997, parmi lesquels nous avons choisi 11 patients caractérisés en cytogénétique conventionnelle (bandes R) par une délétion 5q (10 cas) ou une anomalie combinant une délétion et une translocation (1 cas). Selon les critères de la classification FAB [12], cette série se compose de 2 AR, 1 AREB, 2 AREB en transformation (AREB-T), 1 M6 post AREB-T, 4 M2 et 1 M7. Ces cas ont été réexaminés systématiquement en FISH.

Les études cytogénétiques ont été réalisées sur des prélèvements de moelle et/ou de sang après culture de 24 et 48 heures ; certaines cultures ont été synchronisées au FUDR [13], et les préparations conventionnelles ont été analysées en bandes R [14]. Les résultats sont exprimés selon les règles de nomenclature de l'ISCN 1995 [15].

Les études en FISH ont été réalisées sur des lames conservées à - 25 °C, prétraitées par la RNAse (1 mg/ml) pendant 45 minutes. L'ADN chromosomique est dénaturé dans du formamide à 70 % en 2 x SSC, pH 7,3 à 70 °C pendant 3 minutes. Nous avons systématiquement utilisé des sondes WCP5 et WCP7 (whole chromosome painting). La peinture en double couleur a été réalisée à l'aide de sondes marquées à la biotine et à la digoxigénine (Cambio, Cambridge, UK : 1066-5B, 7B. Oncor, Gaitersburg, MD : Coatosome 2-DG5, 5-DG5, 7-DG5). Ces sondes WCP ont été parfois combinées avec des sondes centromériques a-satellite (Oncor: a-satellite D1Z7/D5Z2/ D19Z3-B5, D2Z-DG5, D3Z-B5, D4Z1-B5, D7Z1-DG5). Les sondes sont dénaturées selon les instructions du fabriquant, mélangées, déposées sur les lames et l'hybridation est faite à 37 °C pendant 16-24 heures.

Les sondes marquées à la digoxigénine et à la biotine sont révélées par immunofluorescence et respectivement visualisées par de la fluorescéine (signal vert) et du Texas Red (signal rouge). Les lames sont montées dans du milieu contenant du DAPI (1124-C1, Cambio, UK) et un agent anti-fading (Vectashield, H 1000 ; Vector Laboratories, UK). Les lames sont lues et analysées à l'aide d'un microscope Leica DMRB en épi fluorescence équipé d'une roue de filtre motorisée (Ludl Electronic Products Model 23E-6102A, USA) et d'un jeu de filtres de Pinkel (Chroma, USA). La capture des images est réalisée à l'aide d'une caméra refroidie Hamamatsu C5985 avec driver C6391, couplée au logiciel ISIS 3 de Meta-Systems (Altusheim, Germany). Certaines lames ont été rehybridées deux ou trois fois avec des sondes différentes, selon une technique déjà décrite [16], pour pouvoir préciser l'origine de certains chromosomes remaniés, de translocations complexes et/ou pour caractériser des aberrations multiples. Pour quelques cas, les sondes a-satellite ont permis de préciser l'origine du centromère d'un chromosome dérivé d'une translocation.

Deux types de situations : délétions simples du chromosome 5 et anomalies complexes

Dans cette série de 11 patients avec des anomalies 5q, l'hybridation in situ confirme deux catégories de cas : ceux qui ont une délétion simple du chromosome 5, les deux 7 étant normaux (4 cas, patients 1 à 4) et ceux qui se révèlent avoir en réalité des anomalies complexes (7 cas, patients 5 à 11), avec au moins un chromosome 5 porteur d'anomalies complexes, associant (6 cas) ou non (1 cas) des anomalies d'un ou des deux chromosomes 7. Les données sont regroupées dans les tableaux I à III : le tableau I résume les données hématologiques ; les tableaux II et III regroupent et comparent les résultats obtenus par la cytogénétique conventionnelle (bandes RHG) et par la FISH (WCP5, WCP 7 et d'autres sondes parfois utilisées pour déterminer le chromosome partenaire impliqué dans des réarrangements complexes), les différences apparaissant en caractères gras.

Dans le groupe avec délétion simple (tableau II), la FISH confirme l'interprétation du caryotype en bandes R.

Dans le groupe avec anomalies complexes (tableau III, cas 5 à 11), l'analyse en FISH modifie et corrige l'interprétation faite par les bandes et révèle pour les chromosomes 5 et 7 des délétions et des translocations.

I - Les délétions peuvent s'accompagner de translocations identifiables seulement par la FISH : cinq translocations ont été ainsi reconnues chez trois patients : une t(5;14) prise pour une del(5)(q13.2q34) chez le patient 5 (figures 1a et 1b),

- une t(2;5) prise pour une del(5) (q12q35), une t(5;7) prise pour une del(7)(q21) et une t(5;?)(?q;?) inclassable chez le patient 9,

- une t(2;7) non détectée chez le patient 11.

II - Les chromosomes 5 et 7 sont impliqués dans une translocation commune quatre fois  :

t(5;7)(q12;q ?) pour le patient 7, t(5;7)(q ?;q11) pour le patient 9, t(4;5;7;13) pour le patient 10, t(5;7)(q10;q10) pour le patient 11 (figure 2). Toutes ces translocations produisent des monosomies partielles correspondant au bras perdu de chaque chromosome impliqué.

III - La FISH a révélé sept insertions cryptiques de petits segments chromosomiques chez quatre patients :

une ins(9;7) chez le patient 6, cette ins (9;7) étant apparue après chimiothérapie. Pour le patient 8, une ins( ?;7)(p; ?) dans un chromosome non identifié de la taille d'un C. Pour le patient 9, une ins de # 5 et une ins de # 2 dans deux petits chromosomes non identifiés. Enfin chez le patient 10, une insertion complexe du # 7, # 5 et # 13 dans un der(4) et une insertion de # 7 dans un marqueur non identifié (figures 3a et 3b).

IV - Des fragmentations des chromosomes 5 and 7 ont été respectivement observées dans deux cas : les patients 9 et 10 et les patients 8 et 10 (figure 3b, patient 10).

 

Discussion

Dans sept cas, l'analyse en FISH a modifié l'interprétation antérieure obtenue par les bandes RHG. De manière inattendue, six de ces sept cas associent des délétions du 5 et/ou du 7, et des translocations de matériel issu des paires 5 et 7. Quelques études de délétions par FISH ont été réalisées concernant le 7 surtout [17, 18], mais des études systématiques des délétions 5q n'ont pas été entreprises.

En partant de nos résultats quatre remarques peuvent être faites :

1) Les délétions peuvent être accompagnées de translocations qui ne sont visibles ou identifiables que par FISH (cinq cas).

2) Dans quatre cas des translocations ont eu lieu entre 5q et le chromosome 7.

3) Des insertions cryptiques de petits segments chromosomiques sont révélées par FISH : quatre cas.

4) Ces translocations et insertions sont associées avec une "fragmentation" (un chromosome se casse en plus de deux segments) : deux cas pour le chromosome 5 et deux cas pour le chromosome 7.

À l'aide des méthodes de FISH, les translocations entre les paires 5 et 7 sont bien plus fréquentes que les bandes ne le laissent supposer. Trois de nos cas ont l'aspect de translocations "à bras entier" qui ont été décrites, avant l'ère de la FISH, par Thangavelu et al. [19]. Ainsi que le soulignent ces auteurs, ces cas peuvent être facilement confondus avec une délétion 5q habituelle si la qualité des bandes n'est qu'imparfaite. Comme l'a récemment souligné Van den Berghe [3], on ne sait pas s'il existe des anomalies moléculaires pour ces t(5;7), pas plus que pour les autres translocations à bras entiers qui surviennent séparément sur les chromosomes 5 et chromosomes 7 comme celles observées dans les leucémies secondaires : t(1;7) [20], t(5;17) et t(7;17) [21], et t(7;12) enfin [22]. Ces translocations, proches du centromère ou à bras entiers, qui produisent des monosomies partielles d'un des bras de chaque chromosome impliqué, peuvent engendrer la formation de chromosomes dicentriques, comme dans deux de nos cas : dic(5;7) pour le patient 11 et dic(2;5) pour le patient 9.

La fragmentation du chromosome 7 a déjà été observée par deux groupes étudiant des chromosomes en anneau et minutes provenant du 7 [17, 23]. Il est possible, comme le suggère un de nos cas (patient 6), que la fragmentation soit un phénomène secondaire. Les marqueurs résultant de la fragmentation ne se retrouvent pas dans toutes les métaphases et cette constatation est difficile à interpréter. La fragmentation est sans doute un phénomène assez général, qui avait été noté par Cremer [24] sur des chromosomes 1 et 7 à l'occasion d'irradiations expérimentales faites in vitro sur des cellules lymphoïdes.

Pour les chromosomes 5 et 7, l'étude comparative des cas à l'intérieur de séries a permis de définir des régions critiques impliquées dans les délétions [25-29].

Pour le chromosome 7, deux régions critiques semblent apparaître dans les délétions 7q : 7q22 and 7q32-33, qui sont le siège de gènes présumés jouer un rôle dans la leucémogenèse [29, 37, 38].

Pour le chromosome 5, la plupart des groupes qui ont étudié les délétions dans le "syndrome-5q-" en utilisant des YACS [25-27, 30] s'accordent sur le fait que la plus petite région délétée commune est située dans la bande 5q31. Les gènes contrôlant de nombreux facteurs de croissance et/ou leurs récepteurs sont localisés sur le bras long du chromosome 5 [6, 25]. L'implication d'un gène suppresseur de tumeur a été postulée mais non encore confirmée. Avec des méthodes de biologie moléculaire, il a cependant été prouvé que, dans certains cas, la séquence manquante du chromosome cytogénétiquement délété était également absente du chromosome 5 homologue [25, 31, 32]. Même si les bandes délétées sont très variables, la région télomérique n'est jamais affectée, il s'agit bien de délétions intercalaires. En effet, en employant des sondes obtenues par microdissection de la région 5q34-q35, la nature interstitielle du syndrome 5q - a été affirmée sur une série de 17 patients par Tigaud et al. [33]. Cependant les délétions 5q pourraient être plus hétérogènes que la cytogénétique conventionnelle ne le fait croire car, dans une importante étude rétrospective, Pedersen [34] suggère que des bandes autres que 5q31 jouent un rôle et que la nature précise des délétions peut être corrélée avec la nature de l'hémopathie et le pronostic. De plus, des réarrangements complexes du bras long du 5 ont été occasionnellement observés [35]. Récemment, un second locus, en 5q13.1, a été identifié et pourrait être impliqué dans les délétions et translocations du chromosome 5 dans les SMD et les LAM [36].

Des translocations terminales équilibrées du 5q donnant naissance à des gènes de fusion comme dans les t(5;12)(q35;p13) [39] ou t(3;5)(q25.1;q34) [40] ont été décrites, impliquant la région intéressée par les del(5q). Dans notre série de translocations 5q associées avec des délétions, nous avons rarement observé une translocation sans perte de matériel du chromosome 5.

Nos observations sont en partie en contradiction avec l'opposition maintenant classique faite entre les SMD/LAM secondaires avec délétions du 5 et/ou du 7 après agents alkylants et les translocations 11q23 et 21q22 associées aux traitements antérieurs par anti-topo-isomérase-II [41, 42]. Pour ceux de nos patients qui ont à la fois délétion et translocation, il est difficile de savoir si la délétion survient avant ou après la translocation ; dans un cas cependant (patient 7), la délétion précède la translocation  : un del(5q) était présent en 1994 mais en 1996, deux clones simultanés étaient observés, le premier avec une del(5q) et le second montrant la même del(5q) et un der(5) t(5;7) intéressant le second chromosome 5. Nous ignorons, dans le cas d'une délétion avec translocation concernant un seul chromosome 5, la chronologie des remaniements.

CONCLUSION

Les translocations observées par FISH dans notre série [46] sont déséquilibrées et diverses mais concernent souvent les paires 5 et 7 simultanément, ce qui confirme la sous-estimation de ces anomalies par t(5 ;7) et leur confusion avec des del(5q) sans l'utilisation de la FISH [3, 19]. Il est important de confirmer nos observations sur les délétions des chromosomes 5 et 7 fréquemment associées à des réarrangements complexes : translocations cryptiques et insertions. L'utilisation de la peinture chromosomique est essentielle lorsque une délétion 5q est observée en dehors du tableau typique décrit par Van den Berghe, en particulier lorsqu'elle est associée à des marqueurs, pour éviter de méconnaître un remaniement complexe. Ces études systématiques permettront peut-être de savoir si ces remaniements complexes sont ou ne sont pas l'évolution de vraies délétions typiques du syndrome 5q- (notre cas n° 5, qui est un exemple d'anomalie cryptique, pourrait correspondre à ce genre d'évolution cytogénétique). L'utilisation de YAC précisera les points de cassure de ces translocations, et permettra de savoir si les t(5;7) sont récurrentes et si la perte ou la conservation de certaines séquences du bras long du chromosome 5 interviennent dans l'évolution et le pronostic des hémopathies comme semble le démontrer l'étude rétrospective de Pedersen [34]. Pour caractériser certaines anomalies complexes, nous avons eu recours à des hybridations successives de la même métaphase, ce qui est long et compliqué ; il est évident que les techniques de FISH multicouleurs, récemment décrites, trouveront ici toute leur application [43-45].

Remerciements

Nous tenons à remercier A. Kerouanton, P. Roudaut et N. Gueganic pour leur excellente collaboration technique.

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