ARTICLE
L'hématopoïèse chez l'homme adulte a lieu dans
des sites médullaires précis : les os plats (pelvis,
sternum, côtes, crâne) et les vertèbres. Ces sites,
en particulier les crêtes iliaques, peuvent être facilement
analysés à partir de biopsies osseuses ; sous anesthésie
locale, de petits cylindres d'os et de moelle sont prélevés
à l'aide d'un trocart. Les fragments sont inclus en paraffine ou
en résine, décalcifiés et fixés, puis découpés
en lamelles plus ou moins fines avant d'être colorés par
des méthodes classiques d'histologie.
L'étude des biopsies médullaires montre que les cellules
hématopoïétiques se localisent dans des logettes situées
entre les trabécules osseux (figure
1). Ces logettes contiennent également des structures facilement
identifiables, d'une part, de grosses cellules chargées de graisses,
les adipocytes, et, d'autre part, un réseau vasculaire fait d'artérioles,
de capillaires de sinus et de veinules. Les sinus sont à la fois
les structures les plus facilement identifiables (les grands sinus pouvant
atteindre jusqu'à 50 mum de diamètre) et les éléments
spécifiques à la moelle du réseau vasculaire. Les
cellules les plus évidentes des structures vasculaires sont les
cellules endothéliales qui limitent la lumière vasculaire.
Certaines structures vasculaires comportent également d'autres
cellules ; c'est le cas en particulier des artères et des
artérioles qui, dans la moelle comme dans les autres tissus, présentent
une tunica media, faite de cellules vasculaires musculaires lisses, et
une tunica externa ou adventice, faite de cellules conjonctives. Les cellules
de la media sont situées du côté abluminal des cellules
endothéliales : on peut dire dans ce sens que ce sont les
cellules abluminales des artères et des artérioles. Nous
verrons plus loin que les cellules abluminales existent à tous
les niveaux de l'arbre vasculaire médullaire, capillaires, sinus
et veinules.
On convient d'appeler micro-environnement médullaire l'ensemble
des cellules médullaires non hématopoïétiques.
Il s'agit donc essentiellement des cellules du réseau vasculaire,
cellules endothéliales et cellules abluminales, et des adipocytes.
On associe à ces deux composantes médullaires des cellules
recouvrant les trabécules osseux, cellules dites endostéales.
Cette définition purement morphologique était acquise dès
les années 60 et on trouve dans l'"Atlas" de Rolf Burckhardt
[1] de nombreuses illustrations du micro-environnement, incluant des cellules
plus rares, "réticulaires" ou "histiocytaires", situées
dans les logettes et mises en évidence par des analyses minutieuses
après multiples colorations. Le travail de nombreux chercheurs,
parce qu'il a montré l'activité des cellules du micro-environnement
dans l'organisation médullaire, va conférer à ces
cellules un rôle critique dans le développement de l'hématopoïèse.
Les
premières études du rôle fonctionnel des cellules
du micro-environnement
Des travaux expérimentaux chez l'animal vont, dans les années
60 et 70, fournir les premières données suggérant
que les cellules du micro-environnement ont un rôle fonctionnel.
Friedenstein [2], par culture de moelle de lapin, observe le développement
de colonies "fibroblastiques". Ces colonies fibroblastiques sont implantées
sous la capsule rénale ; après quelques semaines
les animaux sont sacrifiés. Un tiers des colonies donnent, comme
attendu, naissance à du tissu fibreux. Cependant, dans les deux
autres tiers, il y a formation d'os ou d'os et de moelle osseuse. Les
analyses de chimères chromosomiques révèlent que
les cellules sanguines de la moelle osseuse proviennent de l'animal
hôte ; il y a donc bien ensemencement, par des précurseurs
hématopoïétiques circulants du receveur, de certains
des nodules fibroblastiques du donneur, impliquant l'existence d'un
signal émis par les cellules fibroblastiques en direction des
cellules hématopoïétiques.
Wolf et Trentin [3] étudient le développement des cellules
formant des nodules spléniques (CFU-s) après greffe de
moelle syngénique à des animaux irradiés à
dose létale. Ils observent que les nodules à 8 jours sont,
pour la plupart, constitués de cellules de la seule lignée
érythroblastique. En revanche, à 12 jours, les nodules,
plus volumineux, contiennent également des cellules granulocytaires
neutrophiles et, plus rarement, des mégacaryocytes et des éosinophiles.
L'hypothèse est alors faite d'un micro-environnement splénique
favorable au développement de l'érythropoïèse.
Cette hypothèse est étayée par d'autres observations.
L'observation de biopsies médullaires prélevées
8 jours après greffe révèle la présence
de nodules, de petite taille, équivalents médullaires
des CFU spléniques ; ces nodules sont faits de granulocytes
neutrophiles. La transfusion de globules rouges aux souris greffées
empêche la différenciation des cellules de nodules spléniques
précoces : chez les souris polyglobuliques, les nodules
à 8 jours sont faits de cellules blastiques qui, après
injection d'érythropoïétine, deviendront érythroblastes ;
il n'y a donc pas, en l'absence d'érythropoïétine,
changement de voie de différenciation mais blocage de la différenciation.
Enfin, l'implantation de fragments médullaires sous la capsule
splénique permet d'observer chez les animaux irradiés
et greffés que les nodules spléniques des zones de jonction
sont faits d'érythroblastes dans le tissu splénique et
de granulocytes neutrophiles dans le tissu médullaire. Cet ensemble
d'expériences suggère que le micro-environnement splénique
diffère du médullaire, le premier en favorisant l'érythropoïèse,
le second la granulopoïèse.
Ces premières observations ont permis l'émergence du
concept de "micro-environnement inductif pour l'hématopoïèse"*.
Cependant, en l'absence d'un modèle in vitro, il était
impossible d'approfondir le modèle en identifiant les cellules
et les molécules critiques de la médiation entre micro-environnement
et cellules hématopoïétiques. C'est le mérite
de Mike Dexter d'avoir apporté un système de culture qui
permette cet approfondissement.
* Le modèle "inductif" a été
opposé au modèle "stochastique" développé
dans les années 60 par Siminovitch, Till et Mc Culloch. Cette
opposition, très théorique, reposant à la fois
sur l'interprétation mathématique de certains résultats
et sur le poids donné à certaines expériences par
rapport à d'autres, nous paraît mériter une longue
discussion dépassant le cadre de cette revue.
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Le
modèle des cultures de moelle au long cours
En 1976, Dexter, Allen et Lajtha [4] décrivent un système
de culture de moelle murine qui permet la production pendant plusieurs
mois de CFU, à condition que se développe une couche adhérente
de cellules dites "stromales". En 1977, Dexter et Moore [5] montrent que
ce système de culture permet de dupliquer in vitro les anomalies
retrouvées in vivo chez des souris mutantes présentant
une anémie macrocytaire. En effet les couches adhérentes
de souris W/Wv (guéries par transfusion de cellules
souches de souris +/+ et donc déficientes en cellules souches)
sont capables, après ensemencement avec de la moelle de souris
+/+, d'assurer la production continue de progéniteurs granulomonocytaires.
En revanche, les couches adhérentes de moelle de souris Sl/Sld
(guéries après implantation chirurgicale de tissu splénique
de souris +/+, ce qui indique une déficience du micro-environnement),
après ensemencement avec des cellules hématopoïétiques
de moelle de souris +/+, ne peuvent assurer la production de progéniteurs,
ce qui confirme l'anomalie des cellules du micro-environnement. Ces deux
travaux, publiés à un an d'intervalle, vont faire la fortune
du sytème de culture au long cours.
De 1979 à 1981, plusieurs équipes, dont celle de Henry
Kaplan [6], vont décrire des systèmes de culture adaptés
à l'homme, où il y a coexistence entre cellules du micro-environnement
et cellules hématopoïétiques. Les systèmes de
culture vont faire progresser notre connaissance de la hiérarchie
des précurseurs primitifs de l'hématopoïèse,
rendre possible une description précise des cellules du micro-environnement
et permettre d'identifier, voire de découvrir, les médiateurs
critiques de contrôle d'une population par l'autre.
Le maintien de l'hématopoïèse
Dans le système murin, les CFU et les progéniteurs granulomonocytaires
peuvent être récoltés dans le surnageant de culture
pendant plusieurs mois, ce qui indique la survie d'une population primitive
de cellules souches hématopoïétiques. Cette population
se localise dans la couche adhérente puisque c'est seulement dans
cette couche qu'on trouve des CFU dont la capacité d'autorenouvellement
n'est pas réduite [7] et des cellules à capacité
de repopulation compétitive tardive pour la lignée érythroblastique
[8].
Dans le système humain, la récolte de progéniteurs
granulomonocytaires n'est possible que pendant quelques semaines. Les
progéniteurs les plus immatures sont adhérents [9], donnant
naissance à des colonies de grande taille et susceptibles d'entrer
dans la phase Go du cycle cellulaire à distance des renouvellements
du milieu [10].
La relative brièveté de production des progéniteurs
dans les cultures de moelle humaine, par rapport aux cultures de moelle
murine, a fait douter de la survie dans les cultures humaines de précurseurs
vraiment primitifs. En fait, depuis une décennie, des expériences
remarquablement convergentes effectuées en systèmes murin
et humain montrent que, dans les deux cas, il y a survie prolongée
d'une population très immature.
L'équipe de Rob Ploemacher a défini une population murine
de cellules plus primitives que les CFU-s, dites pré-CFU-s [11].
Les pré-CFU-s présentent une capacité de repeuplement
de la moelle de receveurs primaires, identifiée par l'apparition
de CFU-s chez des receveurs secondaires injectés par les cellules
médullaires des receveurs primaires. Le niveau d'immaturité
des pré-CFU-s ainsi défini est probablement comparable à
celui des cellules capables d'assurer la repopulation d'animaux après
plusieurs mois lorsqu'elles sont mises en compétition avec une
population de cellules "compromise" par une première greffe [12].
Ploemacher et al. ont, par ailleurs, étudié le délai
d'apparition de colonies hématopoïétiques faites de
"cellules pavimenteuses" (d'où le terme cobblestone area forming-cells
qualifiant les cellules clonogéniques) après culture de
précurseurs hématopoïétiques sur des couches
stromales irradiées [13]. Les cellules de ces colonies sont situées
sous les cellules stromales, ce qui témoigne à la fois de
leur capacité d'adhésion au stroma et de migration sous
la couche stromale. Certaines colonies apparaissent (puis disparaissent)
après quelques jours, d'autres après plusieurs semaines,
ce qui indique très vraisemblablement une grande variabilité
de temps d'entrée en cycle des cellules à l'origine des
colonies. Fait essentiel, cette même équipe a montré
l'existence d'une relation entre le niveau de maturité des cellules
primitives (ainsi qu'évalué in vivo) et le délai
d'apparition des colonies (ainsi qu'évalué in vitro).
Il existe une corrélation hautement significative, d'une part,
entre le nombre de pré-CFU-s d'un échantillon et le nombre
de colonies de cellule pavimenteuses apparaissant après 28 jours
de culture et, d'autre part, entre le nombre de CFU-s et le nombre de
colonies apparaissant après 10 jours de culture. Les pré-CFU-s
retiennent peu le colorant supravital rhodamine 123 et ne produisent,
après ensemencement avec des couches stromales, des progéniteurs
en nombre significatif qu'après plusieurs semaines. Au contraire,
les cellules très brillantes après coloration par la rhodamine
123 ne produisent des progéniteurs que pendant les premières
semaines de coculture. Ces données ont été confirmées
et complétées par différents travaux de l'équipe
de Connie Eaves montrant que les cellules clonogéniques, détectées
après quatre semaines de culture en condition de dilution limite
(long-term culture initiating cells ou LTC-IC) et dont la progénie
est myéloïde, présentaient des caractéristiques
similaires à celles des cellules assurant la repopulation compétitive
à long terme [14] ; par ailleurs, après une semaine
de culture supplémentaire, en milieu différent du milieu
initial par l'absence de sérum de cheval et d'hydrocortisone et
l'addition de beta mercapto-éthanol, la progénie des LTC-IC
devient mixte à la fois myéloïde et lymphoïde
B, ce qui confirme la multipotentialité des cellules clonogéniques
[14]. Enfin si, dans l'ensemble, les cellules à capacité
de repopulation compétitive diminuent à 10 % du taux initial
au cours des quatre premières semaines de culture, certains clones
sont capables de proliférer, assurant la repopulation lymphoïde
et myéloïde de plusieurs animaux receveurs irradiés
à dose létale, ce qui confirme à nouveau la multipotentialité
et donc le caractère très primitif de certaines cellules
en culture [15].
Cet ensemble de données suggère fortement qu'un système
de culture in vitro peut fournir des informations sur la hiérarchie
des cellules souches murines ainsi qu'évaluée par différents
tests de repopulation. Ces données montrent également que
le micro-environnement permet la survie, voire la prolifération,
de précurseurs à différents niveaux de maturité,
détectés grâce à leur capacité à
former des colonies myéloïdes et/ou lymphoïdes B à
moyen et à long terme. Le micro-environnement prévient donc
l'apoptose et fournit au moment adéquat (vraisemblablement en harmonie
avec l'horloge interne de la cellule primitive) les signaux de prolifération
et de différenciation.
Les expériences chez l'homme donnent des résultats comparables.
Dans un premier temps, différentes équipes ont mis en évidence
une population de cellules plus immatures que les progéniteurs,
qualifiées par Robert Andrews de pré-CFU [16]. Des échantillons
médullaires dépourvus de progéniteurs par traitement
par anticorps cytotoxiques en présence de complément ou
par traitement par drogues cytotoxiques sont capables, après ensemencement
sur couche adhérente irradiée, de générer
pendant plusieurs semaines des progéniteurs. Les pré-CFU
présentent un phénotype immature (cellules CD34+,
CD33-, HLA-DR faible et CD38-). Dans un deuxième
temps, des cultures en condition de dilution limite [16] de cellules à
différents niveaux de maturité ont permis leur détection,
après des temps de culture d'autant plus longs que la cellule est
plus immature, et la quantification des différentes sous-populations.
C'est ainsi qu'on a mis en évidence, chez l'homme comme chez la
souris, les LTC-IC, leur détection s'effectuant chez l'homme à
la cinquième semaine [17]. Des données récentes [18]
suggèrent que les LTC-IC détectées encore plus tard,
après huit à dix semaines de culture, constitueraient une
population encore plus immature dont les cellules entrent tardivement
en cycle (et n'intègrent donc pas des rétrovirus administrés
avant mise en culture) mais sont capables de fournir, grâce à
leur grande capacité proliférative, des colonies de grande
taille.
Cet ensemble de données montre que, chez l'homme comme chez la
souris, la mise en évidence des précurseurs les plus primitifs
implique la coculture avec les cellules du micro-environnement. Il révèle
également que, en présence du micro-environnement, les précurseurs
peuvent être maintenus en état de "quiescence active" par
le biais de différents médiateurs, cytokines ou peptides
inhibiteurs ou molécules d'adhésion s'opposant à
une division active, mais aussi facteurs de croissance et molécules
d'adhésion favorisant la prolifération et différenciation.
Il y a vraisemblablement équilibre entre ces différents
facteurs, équilibre modulable par le renouvellement du milieu comme
l'ont montré Cashman et al. dès 1985 [10] et par
l'évolution même de la couche adhérente où
les cellules du micro-environnement sont modifiées au fur et à
mesure du développement de l'hématopoïèse. Nous
reviendrons plus loin sur le rôle des différents médiateurs.
La caractérisation des cellules du micro-environnement
Étant donné que, en l'absence de développement
d'une couche adhérente, il n'y a pas maintien de l'hématopoïèse,
il est apparu important de connaître la nature des cellules adhérentes.
L'analyse morphologique de couche adhérente de culture de moelle
humaine révèle trois types cellulaires : le premier
consiste en de petites cellules rondes de 10 à 15 mum de diamètre
groupées en amas superficiels (les cellules sont alors réfringentes)
ou dans l'épaisseur de la couche (les cellules forment alors des
zones pavimenteuses comme indiqué plus haut), le deuxième
comprend des cellules ovoïdes, de 20 à 25 mum dans leur plus
grande largeur, non réfringentes et le plus souvent isolées,
et le troisième est formé de cellules étalées,
difficiles à observer en raison de leurs larges pseudopodes (se
recouvrant les uns les autres). Les cellules rondes sont les cellules
hématopoïétiques, le plus souvent granulocytaires ou
monocytaires, plus rarement lymphocytaires. Les cellules ovoïdes
sont des macrophages semblables aux macrophages résidents des tissus.
Les cellules allongées sont les cellules dites stromales. On convient
d'appeler cellules du micro-environnement les cellules stromales et les
macrophages, en raison du rôle joué par les deux types cellulaires
dans le maintien de l'hématopoïèse. Dans les conditions
de culture standard, de la deuxième à la septième
semaine, le rapport macrophage/cellule stromale est d'environ 1/3.
Les cellules stromales présentent peu de glycoprotéines
membranaires informatives. L'absence d'expression de CD45 et de CD34 suggère
que ces cellules ne sont pas d'origine hématopoïétique
ou endothéliale. La présence des métalloprotéases,
CD10 et CD13, suggère des fonctions enzymatiques qui peuvent réguler
l'expression de certaines cytokines. La présence de nombreuses
molécules d'adhésion du groupe des intégrines beta1
(CD29, CD49a et d), de la famille des immunoglobulines (CD54, CD106) ou
du récepteur de l'acide hyaluronique (CD44) suggère l'implication
de ces cellules dans les liaisons de cellule à cellule, homo ou
hétérotypiques, ou de cellule à matrice extracellulaire.
C'est l'analyse du spectre d'expression des molécules de la matrice
extracellulaire et des molécules du cytosquelette qui permet d'appréhender
l'origine et la voie de différenciation cellulaire. Les cellules
stromales sont des cellules de nature conjonctive qui suivent une voie
de différenciation vasculaire musculaire lisse [19]. Ces cellules
expriment en effet un large spectre de glycoprotéines adhésives
(fibronectine EDa+, laminines beta1 et beta2, collagènes
I, III, IV, tropoélastine, tenascine, thrombospondine) et de glycosaminoglycanes
(héparane, chondroïtine et dermatane sulfates, acide hyaluronique).
Au fur et à mesure de leur prolifération puis de leur vieillissement
en culture, les gènes de nombreuses molécules spécifiques
des cellules vasculaires musculaires lisses sont induits, selon une séquence
reproduisant celle observée durant la vie fœtale et dans l'enfance,
par les cellules vasculaires musculaires lisses [20] : actine alpha
à spécificité musculaire lisse (alphaSM), calponine,
métavinculine, caldesmone de haut poids moléculaire, SM22alpha,
et enfin chaînes lourdes de la myosine musculaire lisse. À
leur stade de différenciation terminale, les cellules stromales
présentent un phénotype proche de celui des cellules musculaires
lisses de l'intima aortique (telles que retrouvées dans les lésions
athéromateuses) ; ces cellules subendothéliales de
l'intima diffèrent des cellules de la media par de nombreux caractères,
résultant soit d'un développement oligoclonal local d'un
lignage musculaire lisse particulier, soit de la "modulation" phénotypique
après migration de cellules de la media [21].
Cette voie de différenciation vasculaire musculaire lisse des
cellules stromales peut surprendre à double titre : elle ne
rend pas compte de l'hétérogénéité
du micro-environnement in vivo et ne paraît répondre
à aucune fonction physiologique. Cette apparente incohérence
s'élucide à la lumière du concept de cellule souche
mésenchymateuse. Les travaux de plusieurs équipes, Maureen
Owen [22], Arnold Caplan [23], Darwin Prokop [24], pour ne citer que quelques
noms, ont suggéré l'existence d'une cellule multipotente
du tissu conjonctif susceptible de se différencier selon différentes
voies, fibroblasto-adipocytaire, chondro-ostéocytaire, vasculaire
musculaire lisse/péricytaire, voire myoblastique, selon les conditions
locales ou les conditions de culture. On peut faire l'hypothèse
que des cellules mésenchymateuses relativement immatures, inoculées
en petit nombre en début de culture, vont, pour la plupart, suivre
une voie de différenciation vasculaire musculaire lisse en raison
des conditions mêmes de la culture. Rappelons que le milieu de culture
au long cours contient beaucoup de sérum de deux origines (sérum
de veau fœtal et sérum de cheval) et du cortisol. Le sérum
de cheval est particulièrement riche en cytokines et contient également
de la fibronectine soluble. Les cellules sont donc cultivées en
présence d'un ensemble de facteurs qui peut favoriser la voie de
différenciation vasculaire musculaire lisse. Il est très
vraisemblable que le milieu reproduise un micro-environnement in vivo
qui, dans la moelle comme dans l'intima aortique, serait favorable au
développement d'un lignage musculaire lisse particulier. Nous reviendrons
sur ce point plus loin.
Ce même concept de cellule souche mésenchymateuse peut
expliquer l'existence d'autres voies de différenciation. Les adipocytes
sont présents, en quantité variable d'une culture à
l'autre, et la présence d'ostéoblastes a été
signalée. Les médiateurs influençant la différenciation
vers les différentes lignées conjonctives sont mal connus
et, par conséquent, mal contrôlés d'une culture à
l'autre. La notion de cellule souche mésenchymateuse implique une
plasticité cellulaire qui peut expliquer les différences
observées d'une culture à l'autre, rendant ainsi compte
d'une relative hétérogénéité cellulaire.
Les cellules stromales à différenciation musculaire lisse
peuvent être également appelées myofibroblastes. Ce
terme a été avancé par Guilio Gabbiani [25] et s'applique
à de nombreux stromas in vivo, tissu de cicatrisation, stroma
de tumeur solide, cellules de Itoh hépatiques, cellules mésangiales
rénales, ou in vitro. Ce terme indique l'acquisition par
les "fibroblastes" de caractères musculaires lisses, variables
selon les conditions in vivo ou in vitro, ce qui est à
nouveau conforme à la notion de cellule souche mésenchymateuse.
L'analyse de couches adhérentes de cultures au long cours de
moelle murine [26] révèle, comme pour la moelle humaine,
l'existence de macrophages et de myofibroblastes. Elle révèle
également la présence de cellules endothéliales.
Cette troisième composante est rarement présente à
un niveau significatif en culture de moelle humaine. Si certains travaux
expérimentaux suggèrent que les cellules endothéliales
pourraient être en filiation avec la cellule souche mésenchymateuse,
d'autres données (transplantation de cellules chez l'embryon d'oiseau)
paraissent indiquer une origine distincte, et éventuellement commune
avec celle des lignages hématopoïéiques.
La quasi-absence de cellules endothéliales dans les cultures
au long cours humaines paraît en première analyse compatible
avec la différenciation musculaire lisse des cellules stromales.
Il a été en effet montré que les cellules musculaires
lisses inhibent, par la sécrétion de TGF beta1 (transforming
growth factor) activé par différents mécanismes
(acidification, plasmine), la croissance de cellules endothéliales
cocultivées. En fait, de nombreuses observations plus récentes
[27] montrent des relations complexes entre les deux types cellulaires
rendant compatible leur coexistence, à partir de progéniteurs
distincts ou, peut-être, d'une cellule mésenchymateuse commune,
dans certains types de cultures, dont les cultures au long cours de moelle
murine.
Le rôle des différentes populations
du micro-environnement dans le soutien de l'hématopoïèse
Trentin, poussant à l'extrême son modèle, avait
assigné deux types cellulaires spléniques distincts au développement
de l'érythropoïèse et de la granulopoïèse
[28]. Le premier était constitué de cellules "réticulaires",
intimement associées au développement de nodules érythroblastiques
et ressemblant aux macrophages ; dans ces conditions, se trouvait
reconstitué dans un autre contexte l'îlot érythroblastique
de Bessis. Le second comprenait des cellules "stellaires" associées
aux nodules granulocytaires qui, par la proximité de fibres de
collagène, paraissaient être de nature conjonctive.
Allen et Dexter ont filmé, en 1991, l'évolution des cultures
de moelle murine au long cours, produisant une vidéo remarquable
qui montre le rôle de deux types cellulaires dans l'évolution
de l'hématopoïèse. Des cellules recouvrantes (cellules
"couverture") paraissent impliquées dans le développement
d'îlots granulocytaires (et d'îlots érythroblastiques
lorsque de l'érythropoïétine est ajoutée au
milieu de culture). Les macrophages paraissent jouer un rôle critique
dans la résorption de l'îlot érythroblastique.
Une autre approche pour l'étude des relations fonctionnelles
entre différents composantes du micro-environnement et compartiments
de l'hématopoïèse consiste à modifier les conditions
de culture pour moduler la composition des couches adhérentes ou
à développer des lignées, représentatives
d'une composante, secondairement ensemencées par des cellules hématopoïétiques.
Ces différentes approches ont montré que les macrophages
pouvaient entraver le développement de la granulopoïèse
par modification du réseau extracellulaire de fibronectine [29]
ou par production de régulateurs négatifs, alors que les
cellules stromales à différenciation musculaire lisse permettaient
à elles seules le développement de la myélopoïèse
ou de la lymphopoïèse B à partir de précurseurs
immatures [30]. Ce développement peut nécessiter ou non
l'addition de cytokines selon la méthode de purification du stroma,
ce qui souligne l'importance d'un conditionnement du stroma par des facteurs
qui restent à élucider.
Le développement depuis 1994 [31] de méthodes d'isolement
et de culture des cellules endothéliales médullaires humaines
a révélé que ces cellules pouvaient favoriser la
mégacaryopoïèse, ce qui confirme des données
obtenues avec la moelle murine.
Il convient, pour l'instant, de rester prudent sur le rôle spécifique
des populations du micro-environnement médullaire. Des observations
récentes révèlent une remarquable hétérogénéité
du stroma murin. En utilisant des lignées immortelles, après
transfert de T de SV40 à l'aide de rétrovirus, il est apparu
que seulement un clone stromal sur seize était capable d'assurer
la survie de précurseurs très primitifs [32]. Par ailleurs,
par génération de lignées continues à partir
de souris transgéniques pour l'antigène T, il est apparu
que des clones différents étaient responsables du maintien
de la myélopoïèse ou de celui de la lymphopoïèse
B [33]. Ce dernier résultat est cependant en contradiction avec
des résultats antérieurs indiquant que deux lignées
murines immortelles modulaient le maintien de la myélopoïèse
ou de la lymphopoïèse B selon les conditions de culture [34,
35]. Ces observations suggèrent que des populations discrètes
du micro-environnement jouent un rôle permissif variable sur le
devenir des précurseurs hématopoïétiques primitifs.
Dans l'état actuel, il apparaît donc bien que le problème
de l'induction de l'hématopoïèse est un champ d'exploration
pour les années à venir. L'utilisation de vecteurs rétroviraux
immortalisants mais non transformants, en raison d'un oncogène
différent de T ou par l'utilisation de promoteur inductible, permettra
de réaliser ces études chez l'homme comme chez la souris.
Les médiateurs de l'interaction entre micro-environnement
et précurseurs hématopoïétiques
Le modèle de culture au long cours et les modèles apparentés
(co-culture en utilisant des lignées murines ou humaines) se prêtent
à l'analyse des médiateurs. Ils ont, d'ores et déjà,
montré la complexité des régulations et permis de
découvrir de nouvelles molécules.
On peut schématiser les résultats en présentant
trois modèles de régulation qui sont vraisemblablement complémentaires :
régulation par les cytokines, par les molécules d'adhésion
ou par de petits peptides.
Dans leur premier travail, Dexter et al. n'avaient pas détecté
de facteurs de croissance. L'amélioration des techniques de détection
a, depuis cette époque, révélé la présence
d'une quantité de cytokines synthétisées par les
cellules stromales. L'utilisation de lignées stromales, permettant
la croissance d'un certain type de précurseur, a, par ailleurs,
permis le clonage de nouvelles cytokines : les interleukines 6, 7
et 11, le facteur Steel et plus récemment un membre de la famille
des chémiokines, le stromal-derived factor 1.
La médiation par les cytokines paraît se faire selon certaines
règles. Les cytokines sont présentes en très faible
quantité (de l'ordre de la picomole par flacon de 25 cm2)
avec vraisemblablement une grande hétérogénéité
de distribution. En effet, certaines molécules de matrice extracellulaire
peuvent lier des cytokines (par exemple l'héparane sulfate lie
le granulocyte macrophage colony-stimulating factor, l'interleukine
3 ou le fibroblast growth factor basique) et ainsi entraîner
de fortes concentrations locales. Les cytokines peuvent également
être liées à la membrane de la cellule stromale, soit
par l'intermédaire d'une molécule membranaire (par exemple
l'héparane sulfate) ou péricellulaire (par exemple la fibronectine),
soit parce que les cytokines existent sous forme membranaire relarguée
lentement sous l'action d'une enzyme (par exemple le macrophage colony-stimulating
factor beta) ou en raison d'une forme transmembranaire résultant
d'un épissage alternatif (par exemple le facteur Steel). En d'autres
termes, la présentation de la cytokine aux cellules cibles par
les cellules stromales est un facteur critique [36], permettant de concevoir
la régulation stromale de l'hématopoïèse médiée
par des cytokines comme la paracine à très faible distance
d'interaction.
Les cytokines impliquées sont vraisemblablement multiples, incluant
facteurs de croissance (par exemple colony-stimulating factors,
facteur Steel, ligand de flt3) et régulateurs négatifs (par
exemple transforming growth factor beta1). La détermination
des cytokines cruciales dépend évidemment de la cellule
cible, mais il ne paraît pas évident qu'une seule cytokine
soit critique pour une cible donnée. Chez la souris [37] puis chez
l'homme [38], un modèle de régulation a été
décrit, soulignant l'équilibre entre facteurs de croissance
prédominants dans les jours qui suivent le renouvellement du milieu
alors que les régulateurs négatifs l'emportent à
distance du renouvellement. On peut ainsi concevoir un contrôle
de l'entrée en cycle de précurseurs primitifs. L'intérêt
essentiel de ce modèle a été de fournir un rationnel
pour transférer des gènes à l'aide de rétrovirus
dans les précurseurs primitifs du chien [39] et de l'homme [40].
Le fait que les cellules stromales soient capables de produire une telle
diversité de cytokines impliquées dans le maintien de l'hématopoïèse
suggère que le substrat cellulaire pourrait être remplacé,
pour un effet donné, par une association adéquate de cytokines.
Par exemple, on peut obtenir l'amplification d'un facteur 100 à
1000 de progéniteurs humains de sang périphérique
ou de sang de cordon après quelques jours à quelques semaines
de culture en présence de facteurs de croissance, sans qu'il y
ait apparemment développement d'une couche stromale. De notre point
de vue, il s'agit là d'un résultat intéressant pour
les applications cliniques mais qui ne renseigne pas sur la physiologie
de la régulation par les cellules du micro-environnement où
les notions de doses efficaces subliminales, de réservoirs et de
présentation des molécules paraissent cruciales. Il n'est
pas exclu, par ailleurs, que, pour obtenir une amplification des précurseurs
les plus primitifs, il faille faire appel à certains types de cellules
stromales. Nous reviendrons sur ce point plus loin.
La seule description du phénotype des cellules stromales suggère
l'importance des molécules d'adhésion. L'abrogation de la
synthèse des collagènes interstitiels désorganise
les couches adhérentes et entraîne un effondrement de la
production de précurseurs [41] alors que la modulation de synthèse
des protéoglycanes l'augmente [42]. L'addition d'anticorps neutralisant
CD44 ou CD106 arrête la production de cellules hématopoïétiques.
Cet ensemble de données a conduit à étudier le rôle
de certaines molécules purifiées, par exemple la fibronectine
soluble à laquelle adhèrent les progéniteurs érythroblastiques
et leur descendance jusqu'au stade de normoblaste orthochromatophile [43].
Les domaines de fibronectine impliqués sont variables selon le
niveau d'immaturité des précurseurs primitifs [44]. Ces
résultats ont eu des incidences pratiques fournissant le rationnel
pour utiliser la fibronectine dans les expériences de tranfert
de gènes dans les précurseurs ; en présence
de fibronectine liée au flacon de culture, l'efficacité
de transfert de gènes est plus élevée, par co-localisation
des particules rétrovirales et des progéniteurs aux mêmes
domaines de la glycoprotéine adhésive [45].
La constatation relativement récente [46] de l'existence de jonctions
ouvertes entre cellules stromales et cellules hématopoïétiques
fait évoquer l'intervention possible d'un troisième type
de médiateur, des peptides de poids moléculaire inférieur
à 15 kDa, intervenant dans la régulation négative
des cellules souches (acétyl-SDKP) ou des neuromédiateurs
qui peuvent stimuler l'hématopoïèse, vraisemblablement
par induction de cytokines. Ces jonctions ouvertes permettent également
d'envisager le couplage entre plusieurs cellules permettant de caractériser
des unités fonctionnelles pluricellulaires [47].
Des observations récentes du groupe d'Ihor Lemischka [48] suggèrent
l'intervention d'une nouvelle classe de molécules dans la régulation
de l'hématopoïèse par les cellules stromales, à
savoir des molécules de la famille lin12/notch qui ont été
d'abord décrites chez l'embryon de certains vers et insectes où
elles jouent un rôle critique dans le destin de cellules équivalentes
jointives (spécification latérale). Les cellules de la lignée
AFT024 permettant la survie de précurseurs murins très primitifs
synthétisent une molécule d l k appartenant à
la famille notch. Cette molécule, non exprimée par des cellules
de lignées n'assurant pas la survie de précurseurs primitifs,
permet, après transfection des cellules de ces lignées,
la formation de zones pavimenteuses à partir de précurseurs
hématopoïétiques co-cultivés. Cette découverte
ouvre un champ nouveau d'exploration des interactions entre stroma et
hématopoïèse.
Le
micro-environnement in vivo
Dans l'introduction nous avons présenté un aspect simple
du micro-environnement. Dans quelle mesure les données fournies
par les études in vitro nous permettent-elles d'affiner
cette représentation ?
Compte tenu de l'importance des cellules stromales à différenciation
musculaire lisse, nous avons étudié la distribution des
cellules présentant un marqueur précoce, l'actine alphaSM,
à partir de biopsies de moelle d'adulte et de fœtus [19, 49].
Comme attendu, les cellules des media artérielles et artériolaires
sont alphaSM actine+. De façon plus intéressante,
nous avons observé que les péricytes péricapillaires
et les cellules abluminales périsinusales exprimaient également
cette isoforme d'actine. Ces dernières cellules correspondent vraisemblablement
aux cellules réticulaires adventicielles observées par Westen
et Bainton [50] sur coupes de moelle de rongeurs. Des cellules allongées
alphaSM actine+ sont également trouvées à
l'intérieur des logettes ; il n'est pas exclu que ces cellules
soient connectées à de petits sinus mal discernables ou
mettent en relation de grands sinus distants de plus de 30 mum. Enfin,
nous avons constaté que les cellules endostéales exprimaient
également l'actine alphaSM. Suivant une première description
des cellules des logettes exprimant l'actine alphaSM par Schmitt-Gräff
et al. [51], nous avons appelé ces cellules, cellules myoïdes.
Le fait que les péricytes péricapillaires et les cellules
myoïdes parasinusales et à l'intérieur des logettes
(intratrabéculaires) soient au contact, par de fines extensions
cytoplasmiques, avec de nombreuses cellules hématopoïétiques
est vraisemblablement significatif sur le plan fonctionnel. Péricytes
péricapillaires, cellules myoïdes parasinusales et intratrabéculaires
et cellules endostéales paraissent former un réseau cellulaire
allant de l'arbre vasculaire médullaire aux confins osseux. Ce
réseau ressemble à celui décrit par Weiss et Geduldig
[52] pour la moelle murine, consistant en "cellules barrière" qui
comportent des myofilaments et synthétisent de la fibronectine.
Le réseau des cellules barrière est peu apparent en conditions
stationnaires mais s'accentue en cas d'anémie, ou après
administration d'interleukine 1 (IL-1). Chez l'homme le nombre de cellules
myoïdes augmente également au cours de nombreuses situations
pathologiques incluant syndrome inflammatoire et anémie [51]. Fauteux
et Osmond [53] ont récemment montré que l'IL-1 radiomarquée
se localisait, après injection intraveineuse chez des souris normales,
non seulement au niveau des macrophages et des cellules endothéliales
des sinus, mais aussi au niveau de cellules "réticulaires" extravasculaires,
dont certaines en situation parasinusale. Les cellules radiomarquées
paraissent plus nombreuses à proximité du fût osseux ;
les auteurs interprètent cette distribution en relation avec une
plus grande fréquence à ce niveau de précurseurs
lymphoïdes B dont la prolifération serait régulée
par l'IL-1.
Cet ensemble de données met en lumière, chez l'homme comme
chez la souris, une composante du micro-environnement faite de cellules
qui, par leur distribution périvasculaire, intratrabéculaire
et endostéale, pourraient avoir une fonction d'organisation du
tissu médullaire. L'expression d'une protéine contractile,
l'actine alphaSM, fait envisager un rôle de régulation du
débit vasculaire ou des surfaces de contact entre compartiments
vasculaire et hématopoïétique par ces cellules ;
cette régulation pourrait être médiée par des
fibres nerveuses afférentes, comme le suggèrent les études
de Yamasaki [47].
L'étude des moelles fœtales humaines [49] montre la présence
de cellules myoïdes avant l'installation de l'hématopoïèse
(huitième à dixième semaine de gestation) et au cours
du développement de cette dernière (dixième à
quinzième semaine de gestation) dans des chambres de tissu conjonctif
centrées par une artériole, structures que nous avons appelées
"logettes primaires". Ces logettes sont le site exclusif de l'hématopoïèse
des os longs de la dixième à la quinzième semaine
de gestation.
Les études de moelle fœtale ont également révélé
l'absence d'adipocytes, ce qui indique que cette population ne joue pas
de rôle dans le développement de l'hématopoïèse
médullaire fœtale. Le rôle des adipocytes pour le maintien
de l'hématopoïèse dans les cultures au long cours a
fait l'objet de nombreuses controverses. Il est certain que ces cellules
sont induites par les stéroïdes et non l'insuline, ce qui
les distingue d'adipocytes d'autres tissus, mais également inhibées
par l'interleukine 1. Ces cellules constituent très vraisemblablement
une voie de différenciation réversible de la cellule souche
mésenchymateuse et leur présence témoignerait de
l'équilibre de nombreux régulateurs (stéroïdes,
cytokines pro-inflammatoires, transforming growth factor beta1)
dont la relation avec l'hématopoïèse reste à
élucider.
L'intérêt
clinique de l'étude du micro-environnement
La transplantation de cellules souches hématopoïétiques
La figure 2 illustre
les étapes vraisemblables du processus de greffe de moelle. Ce
schéma souligne que la prise de greffe résulte de l'interaction
entre deux populations : celle des cellules souches et celle des
cellules du micro-environnement. Les cellules endothéliales médullaires
doivent présenter aux cellules souches des sites de reconnaissance.
Les cellules souches doivent alors franchir la barrière endothéliale
et des cellules myoïdes parasinusales par passage au travers ou entre
les cellules et franchissement d'une membrane basale (considérée
comme discontinue par certains auteurs). S'ensuit la nidation où
les cellules souches sont en contact avec les autres cellules fixes du
tissu médullaire, cellules mésenchymateuses, cellules myoïdes
intratrabéculaires et macrophages résidents. Une prise de
greffe réussie suppose donc un greffon de qualité mais également
un micro-environnement intègre. Cette représentation n'est
pas seulement théorique : Migliaccio et al. [54], par
l'étude de culture de moelle de sujets avec mauvaise prise de greffe,
ont constaté une anomalie de production des progéniteurs
granulomonocytaires vraisemblablement due à un déficit de
synthèse en granulocyte colony-stimulating factor par les
cellules du micro-environnement.
L'équipe de Joel Greenberger [55] a particulièrement étudié
les causes iatrogènes d'anomalies du micro-environnement et leurs
remèdes. Les études in vitro montrent que le stroma
est, par rapport aux précurseurs hématopoïétiques,
radio et chimiorésistant. Les précurseurs du stroma, en
revanche, seraient beaucoup plus sensibles, ce qui expliquerait un mauvais
développement du stroma chez des malades soumis à de multiples
doses de chimio et radiothérapies. Ces anomalies pourraient être
corrigées par transplantation du stroma. La notion que le stroma
est transplantable résulte des observations de Keating et al.
[56] sur la présence de l'acrosome Y dans les cellules stromales
de cultures de moelle de receveurs féminins prélevée
après transplantation de moelles de donneurs masculins. Cette notion
a été réfutée par d'autres travaux. Anklesaria
et al. [57] apportent vraisemblablement des éléments
de compréhension de ces résultats contradictoires, en montrant,
dans un modèle murin, que la transplantation du stroma dépend,
d'une part, de la dose de cellules injectées et, d'autre part,
du conditionnement du receveur.
Si le stroma est transplantable, peut-on envisager l'existence d'une
cellule souche hémato-mésenchymateuse donnant naissance
non seulement aux lignages hématopoïétiques mais également
aux cellules stromales ? Cette hypothèse, envisagée
dès 1924 par Maximow sur des arguments morphologiques [58], était
étayée par l'étude, grâce au polymorphisme
de la glucose-6-phosphate déshydrogénase (G-6-PD), de couches
stromales de certains syndromes myéloprolifératifs (les
cellules stromales présentant la même isoforme que les cellules
hématopoïétiques, ce qui suggérait une appartenance
commune au clone néoplasique) [59]. La transformation de couches
stromales par le virus SV40 avait, par ailleurs, permis de développer
des clones donnant naissance à la fois à des cellules rondes,
CD34+, et à des cellules stromales exprimant l'actine
à spécificité musculaire lisse [60]. Huang et Terstappen
crurent déceler en 1992 [61] la cellule souche commune dans des
moelles fœtales de plus de 15 semaines en isolant une sous-population
très rare, CD34+, 38- et HLA-DR-.
Ces données ont été rétractées depuis
et des expériences récentes montrent qu'une fraction au
moins de précurseurs stromaux fœtaux est CD34+,
38- et 50-, alors que les précurseurs hématopoïétiques
primitifs sont CD34+, 38- et 50+.
Si le problème de la cellule souche commune ne nous paraît
pas définitivement clos (sa persistance durant la vie fœtale
précoce, dans la moelle avant la quinzième semaine, dans
le foie fœtal ou la paroi ventrale de l'aorte thoracique n'étant
pas réfutée), il nous paraît peu probable qu'elle
persiste au délai de la quinzième semaine de gestation.
Il paraît donc peu probable qu'on puisse collecter suffisamment
de précurseurs stromaux lors de la collecte de moelle ou de sang
périphérique après mobilisation, même après
isolement des cellules CD34+. En revanche, la mise en évidence
au cours de ces dernières années de marqueurs membranaires
spécifiques du stroma (par exemple l'antigène reconnu par
l'anticorps Stro-1) [62] devrait permettre un enrichissement suffisant
en précurseurs stromaux à partir de ces différentes
sources pour envisager des transplantations efficaces de cellules stromales
dans le but de réparer un micro-environnement médullaire
déficient ou pour traiter certaines affections du tissu osseux,
par exemple la maladie des os de verre [24].
Les affections avec lésion du micro-environnement
L'hypothèse émise en 1980 [63] que certaines aplasies
médullaires pouvaient être dues à un micro-environnement
déficient a reçu peu de confirmations expérimentales.
Il reste cependant possible qu'un pourcentage faible d'aplasies médullaires
idiopathiques résulte d'anomalies quantitatives ou qualitatives
du micro-environnement.
Un problème plus intéressant est celui des syndromes myéloprolifératifs.
L'étude de la G-6-PD chez des femmes noires hétérozygotes
a montré que polyglobulie de Vaquez, thrombocythémie essentielle
et splénomégalie myéloïde résultaient
du développement d'un clone néoplasique, également
impliqué dans la genèse des leucémies myéloïdes
chroniques (avec participation discutée d'une population lymphoïde).
Ces données montrent que ces syndromes sont des maladies de la
cellule souche. Cependant, dans tous les cas à un stade terminal,
ou dès le début en cas de splénomégalie myéloïde,
il y a apparition d'une myélofibrose, c'est-à-dire d'un
réseau de réticuline constitué essentiellement de
fibres de collagènes I et III avec prolifération de "fibroblastes" ;
ce réseau, au stade avancé de la fibrose, occupe la quasi-totalité
des logettes médullaires, l'hématopoïèse se
développant alors dans les sinus médullaires et les sites
fœtaux d'hématopoïèse extramédullaires
(la rate et le foie). Les "fibroblastes" sont mal caractérisés
(une partie d'entre eux seraient, d'après nos observations préliminaires,
des myofibroblastes). De nombreux arguments font penser que la fibrose
serait due au relargage par des cellules hématopoïétiques
résiduelles et/ou les cellules du mésenchyme médullaire
de facteurs fibrosants (par exemple transforming growth factor
beta1 ou fibroblast growth factor basique). Dans le cas de leucémie
myéloïde chronique (LMC), différents travaux suggèrent
que le stroma est impliqué précocement dans l'évolution
de la maladie. Les précurseurs hématopoïétiques
primitifs de LMC adhèrent mal au stroma allogénéique
[64], ce qui pourrait être en relation avec la nature néoplasique
des précurseurs, mais pourrait également être dû
à des anomalies du stroma (synthèse anormale de molécules
de matrice extracellulaire ou de molécules d'adhésion membranaire)
[65].
L'intérêt
du stroma lors de la manipulation des cellules souches hématopoïétiques
Depuis une décennie, de nombreuses avancées des connaissances
dans des domaines divers font envisager un élargissement de l'indication
de la greffe de cellules souches hématopoïétiques :
utilisation du sang placentaire pour créer des banques utilisables
par l'ensemble de la population d'enfants et d'adultes, modification génétique
des précurseurs primitifs pour guérir des maladies héréditaires
ou acquises (thérapie génique de certains cancers ou du
syndrome d'immunodéficience acquise). Ces nouvelles indications
posent deux problèmes essentiels, celui de l'amplification des
précurseurs immatures et celui du transfert de gènes dans
ces cellules, que la connaissance des interactions entre cellules stromales
et cellules hématopoïétiques peut aider à résoudre.
Comme déjà signalé plus haut, certaines lignées
stromales permettent la survie de cellules très primitives, voire
leur amplification [32]. Par ailleurs, il a été montré
récemment que des lignées déficientes en M-CSF permettaient
non seulement une différenciation vers l'ensemble des lignages
hématopoïétiques des cellules souches embryonnaires
mais également la sélection et l'amplification de précurseurs
immatures par co-culture en présence d'epidermal growth factor
[66]. Ces données fragmentaires peuvent servir de point de départ
pour aborder le problème de l'amplification des cellules souches
en présence de différents types de stroma.
De nombreuses données montrent que l'efficacité du transfert
de gènes dans les précurseurs hématopoïétiques
est augmentée en présence de cellules stromales autologues
ou allogéniques. Les protocoles expérimentaux utilisés
par certaines équipes suggèrent que les cellules utilisées
sont des myofibroblastes. Une meilleure connaissance de l'effet des cytokines
sur les précurseurs et du profil de synthèse des mêmes
cytokines par le stroma devrait permettre d'envisager l'utilisation de
stroma génétiquement modifié pour améliorer
encore l'efficacité de transduction, surtout au niveau des précurseurs
les plus primitifs.
L'intérêt du transfert de gènes
dans les cellules stromales
La possibilité d'expansion ex vivo de cellules stromales
chez l'homme [67] fait envisager leur utilisation pour la thérapie
génique. Comme indiqué plus haut [57], la nidation, dans
la cavité médullaire, des cellules stromales murines après
injection intraveineuse paraît possible, du moins au-dessus d'une
certaine dose de cellules injectées et éventuellement après
conditionnement par radiothérapie. La démonstration de résultats
similaires chez des primates et finalement chez l'homme permettrait d'envisager
l'utilisation de stroma génétiquement modifié pour
le traitement de certaines affections. Le stroma pourrait être la
source de facteur VIII dans l'hémophilie, de facteurs stimulants
(par exemple l'interleukine 3) dans l'aplasie médullaire ou de
facteurs régulateurs (par exemple l'interféron alpha) dans
les leucémies. Des constructions complexes permettraient d'assurer
la régulation de la sécrétion des facteurs critiques.
Ces développements, certes futuristes, nous paraissent justifiés
par le progrès considérable réalisé au cours
de ces dernières années dans la construction des vecteurs.
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* Il s'agit d'une bibliographie minimale ne citant que les travaux
les plus importants. Une bibliographie plus complète peut être
fournie par l'auteur sur demande.
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