Tétramères et cellules CD8 spécifiques d'antigènes

ARTICLE

Tétramères CMH I/ peptide, une révolution technologique

Acteurs de l'immunité spécifique anti-virale et anti-tumorale, les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) sont l'arme majeure dont dispose le système immunitaire pour éliminer toute cellule modifiée. Les fonctions de cytotoxicité spécifiques d'antigène, médiées par CTL, sont en effet fondamentales dans les processus d'élimination des infections virales, des greffes et des tumeurs ou dans certaines maladies auto-immunes.

La nouvelle technologie des tétramères permet de quantifier aisément les CTL spécifiques d'antigène et a bouleversé non seulement l'abord méthodologique autrefois laborieux et hasardeux de ces lymphocytes T cytotoxiques spécifiques d'antigène, notamment des virus de l'immunodéficience humaine (VIH), des hépatites B et C (HBV et HCV), d'Epstein-Barr (EBV) et du cytomégalovirus (CMV) ou du mélanome et du cancer du col, mais a également bouleversé certains concepts fondamentaux de l'homéostasie des lymphocytes CD8.

Différenciation des CTL

Les CTL CD8⁺ possèdent un récepteur clonal spécifique d'antigène, le récepteur des cellules T (TcR), qui ne peut reconnaître un antigène que si celui-ci lui est présenté à la surface des molécules de complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (CMH-I). L'épitope reconnu est un peptide de huit à dix acides aminés. Le nonamère d'origine endogène est obtenu par clivage de précurseurs protéiques principalement grâce à l'action du protéasome, complexe multi-enzymatique cytoplasmique. Sur toute cellule nucléée les six molécules différentes HLA-A, B, C, sont toutes porteuses d'un nonapeptide dont les acides aminés en position 2 et 9 dictent l'affinité globale du peptide pour le CMH. Il s'agit là d'un moyen extrêmement efficace de signalisation au système immunitaire qu'une cellule est devenue étrangère, puisque modifiée par une infection virale endogène, ou par un événement oncogénique.

Le CTL précurseur naïf doit être éduqué (priming) lors d'une première rencontre avec son antigène (Ag), proliférer et se différencier en présence de cellules présentatrices d'antigènes « professionnelles », les cellules dendritiques (DC) et de lymphocytes auxiliaires CD4⁺. Ces précurseurs immatures éduqués (CTLp) ne possèdent ni les granules cytotoxiques intracytoplasmiques contenant perforine et enzymes lytiques (ou granzymes), ni Fas-Ligand, molécule membranaire capable d'induire l'apoptose de cellules-cibles Fas⁺.

Infection virale et prolifération tumorale sont une course-poursuite : l'organisme infecté doit développer une réponse immune cellulaire, spécifique de l'antigène, plus rapidement que la dissémination du virus ou de la tumeur. Après une expansion clonale d'un facteur 10³ à 10⁵, ce sont les CTL effecteurs activés, les CTLe en charge de la fonction de cytolyse qui possèdent l'équipement nécessaire en enzymes lytiques : perforine, granzyme et en FasL.

En fin de réponse immune, l'activité cytotoxique spécifique d'antigène, et donc la majeure partie de ces cellules effectrices, doivent disparaître. Si certaines des cellules effectrices deviennent des CTL mémoires (figure 1), la plupart meurt dans une proportion dépendant de la force du stimulus initial [1]. Ensuite, une seconde rencontre avec l'Ag peut réactiver ces cellules dites « lymphocytes T cytotoxiques précurseurs éduqués » qui pourront alors proliférer et devenir effectrices [2]. Ces lymphocytes de type mémoire pourront, lors d'une deuxième rencontre avec le même antigène, réagir rapidement contre ce dernier avec une efficacité accrue (figure 1).

Les révolutions méthodologiques dans l'analyse des CTL spécifiques d'antigène

Le test traditionnel de relargage de chrome 51 (CRA) a longtemps été le test fonctionnel de référence permettant l'évaluation des CTLe spécifiques d'Ag par la mesure de leur activité cytolytique. Des cellules-cibles, préalablement chargées en ⁵¹Cr, sont mises en présence de la population de cellules effectrices à évaluer pendant 4 h à 37 °C dans un puits de culture. Une fois lysée par un CTLe, une cellule-cible perdra son intégrité membranaire et relarguera le chrome radioactif dans le milieu de culture : la capacité lytique des CTLe testés sera donc proportionnelle au taux de radioactivité présente dans le surnageant. Afin d'augmenter la sensibilité d'un tel test, il est le plus souvent nécessaire d'expandre la population d'intérêt in vitro, et ce pendant au moins 2 semaines avant d'en tester la fonction cytolytique. Cependant ce test ne quantifie pas le nombre de CTL.

Pendant plusieurs années, la seule technique permettant d'évaluer la taille du compartiment T CD8⁺ a été la méthode de dilution limite, ou LDA. Cette technique repose sur la mise en culture de cellules supposées contenir les CTL, de plus en plus diluées, que l'on stimule par l'Ag d'intérêt. Après généralement 15 j de culture, correspondant à dix cycles de réplication en moyenne, la fonction CTL est évaluée par CRA. Cette technique fastidieuse peut donner, d'une expérience à l'autre, des fréquences variables de cellules répondeuses. De plus, elle repose sur le postulat que les CTLe sont capables d'une part de survivre 2 semaines en culture, mais aussi de se diviser en maintenant leur fonction cytolytique. Or une cellule effectrice est une cellule activée qui a déjà subi in vivo de nombreux cycles de division et la stimulation de telles cellules induit généralement plus facilement l'apoptose que la prolifération. Si ces LDA ne permettent donc pas une estimation correcte du nombre de CTLe présents à l'initiation de la culture, ils permettent néanmoins une évaluation convenable du compartiment des CTL mémoires, quiescents à l'initiation de la culture et ayant conservé des capacités de prolifération (figures 1 et 2) [3].

Récemment, trois nouvelles techniques (figure 2) ont été développées, permettant l'évaluation sans pré-culture des CTL spécifiques d'Ag [4-6]. La méthode, développée par Altman et al. [7], permet de quantifier directement les cellules T spécifiques d'Ag par marquage direct de leur TcR avec un complexe de quatre unités de CMH-I préalablement chargées de l'épitope d'intérêt. La fixation de ce tétramère couplé à un fluorochrome se fait sans pré-manipulation in vitro des cellules à tester, et est évaluée par cytométrie de flux. Une analyse multiparamétrique permet de quantifier ces cellules (comme pour une numération de lymphocytes T CD4) et de préciser le phénotype intra- et extracellulaire des cellules T CD8⁺ ayant fixé le tétramère. Ainsi peut-on montrer que les cellules fixant les tétramères sont activées in vivo et portent le marqueur membranaire d'activation T : CD38 [7] mais ne contiennent pas nécessairement l'équipement intra-cytoplasmique en Perforine, caractéristique des CTL [8]. Ces cellules spécifiques d'Ag peuvent également être purifiées (cell sorting) pour être par la suite étudiées plus finement in vitro. La sensibilité de ce test est telle que une cellule positive sur 5 000 cellules T CD8 totales peut être détectée [9].

Les deux autres méthodes [1, 10, 11] mesurent la production d'IFN-gamma après stimulation antigénique. Le nombre de lymphocytes CD8 répondeurs est déterminé après 6 à 20 h de stimulation par mesure d'IFN-gamma soit par test ELISpot (enzyme-linked immuno-spot), soit après stimulation en présence de bréfeldine A et/ou monensine (deux agents bloquant la sécrétion cellulaire) par marquage intracytoplasmique de l'IFN-gamma produit et évaluation par cytométrie de flux [1]. Ces deux techniques détectent une propriété fonctionnelle des CTL, et peuvent alors sous-estimer la taille du compartiment effecteur [3, 4].

Tétramères HLA de classe I/peptides : synthèse et structure

Si la spécificité antigénique de la lyse CTL repose sur la restriction de reconnaissance dictée par le couple TcR/CMH-I, la force de cette liaison est assurée par les molécules d'adhésion présentes sur les deux types cellulaires en contact. En effet, les études réalisées avec TcR et complexes CMH-I/peptides purifiés montrent que la liaison entre ces deux composés est hautement spécifique, mais a une faible affinité et une forte constante de dissociation. Physiologiquement, c'est grâce à cette forte constante de dissociation et cette faible affinité qu'un CTL pourra se lier successivement à différentes cellules-cibles et assurer sa fonction de « serial killer ». En revanche, de telles caractéristiques sont défavorables à l'utilisation de monomères de CMH-I/peptides solubles pour marquer spécifiquement les lymphocytes T portant le TcR spécifique de ce complexe. En 1997, Altman et al. ont contourné ces obstacles et généré des tétramères CMH-I/peptide (Tet), palliant cette faible affinité par une augmentation d'avidité obtenue par la tétramérisation [7].

La production de tétramères CMH-I/peptides se fait en quatre étapes (figure 3).

La synthèse des monomères, chaîne lourde modifiée du CMH-I et beta-2 microglobuline, est réalisée dans un système d'expression procaryote (Escherichia coli). Les protéines recombinantes sont ensuite purifiées après isolement des corps d'inclusion qui seront dissous dans de l'urée 8 M. C'est à ce stade qu'est ajouté l'épitope peptidique à la chaîne lourde et à la beta-2 microglobuline. Le repliement correct du monomère CMH-I/peptide est l'étape critique du processus [7]. Les complexes CMH-I/peptide ayant une conformation correcte sont ensuite purifiés par chromatographie (gel filtration). Sur une molécule de streptavidine (ou d'avidine) se fixent quatre molécules de biotine, et c'est en appliquant ce principe que s'effectue la tétramérisation des monomères : la chaîne lourde du CMH-I est biotinylée en un site unique par l'enzyme BirA. C'est pourquoi, à la séquence génétique de la chaîne lourde, est ajoutée la séquence codant pour le 15-mer substrat de l'enzyme. L'excès de biotine libre est éliminé par chromatographie échangeuse d'ion. Les monomères CMH-I/peptide peuvent alors être tétramérisés : il faut pour cela leur ajouter de la streptavidine couplée à un fluorochrome. Une alternative à la biotinylation enzymatique de la chaîne lourde du CMH par BirA a également été utilisée : dans ce cas, toutes les lysines de la beta-2 microglobuline sont chimiquement biotinylées [12]. Plusieurs alternatives existent à la tétramérisation mais peu de résultats sont disponibles.

Une fois construits, ces tétramères sont incubés avec la suspension cellulaire à tester et leur fixation est analysée par cytométrie de flux. Les études faites avec des tétramères HLA-A*0201 contenant un peptide de l'Influenza avaient fixé un seuil de sensibilité à 0,01 % [6]. Il est possible de détecter des cellules CD8⁺ Tet⁺ de fréquence aussi faible (entre 0,01 et 0,1 %) qui sont spécifiques de l'antigène et capables de produire de l'IFN-gamma après stimulation par le peptide correspondant [6, 13]. L'utilisation de ces tétramères en cytométrie de flux est simple et réalisable aussi bien sur cellules isolées après Ficoll, fraîches ou congelées, ou sur sang total. Néanmoins s'il est possible de détecter quelques cellules spécifiques à ces faibles fréquences un seuil raisonnable de détection, prenant en compte la répétabilité de la mesure se situe plutôt à 0,1 qu'à 0,01 % des cellules CD8.

Utilisation des tétramères et révision des concepts immunologiques

Expansion spécifique et activation non spécifique des lymphocytes CD8 au cours des infections virales

L'utilisation de tétramères au cours de l'infection murine par différentes doses de LCMV (virus de la chorio-méningite lymphocytaire), a permis de montrer directement la taille de l'expansion des lymphocytes CD8⁺ spécifiques d'antigène qui est directement liée à l'intensité de la charge antigénique, et à elle seule [12]. De plus, il est possible de suivre grâce aux tétramères l'épuisement clonal (clonal exhaustion) induit par des doses infectieuses très fortes et responsable de la disparition des cellules Tet⁺ [12].

Les infections virales sont caractérisées par l'activation et l'expansion des lymphocytes CD8. Parmi ces cellules, il est important de différencier les lymphocytes CD8 spécifiques des antigènes viraux, des lymphocytes CD8 qui ne le sont pas mais prolifèrent sous l'effet de certaines cytokines comme l'IL-15 produites lors du processus infectieux. Jusqu'à l'utilisation des tétramères CMH-I/peptide, le seul moyen de quantifier les cellules CD8 spécifiques d'antigènes, par LDA, montrait des fréquences faibles de 1 à 5 % au maximum, laissant une part importante à l'activation non spécifique [2, 5, 14]. En 1998, des modèles d'infection murine par LCMV ont permis d'établir que la taille de la population de CTLe, évaluée grâce aux tétramères et à l'ELISpot, était de 10 à 50 fois plus importante que celle suggérée par LDA. Ainsi 50 à 70 % des cellules T CD8 de la rate d'un animal en phase aiguë de l'infection sont spécifiques du LCMV [1, 10]. En cas de ré-infection, les fréquences obtenues sont du même ordre [1, 10]. Cette forte représentation des cellules CD8⁺ spécifiques d'antigène parmi les cellules CD8⁺ qui sont amplifiées au cours d'infections virales aiguës a également été retrouvée dans le cas de l'infection murine par le virus Influenza pneumonia [15, 16]. Ces dernières études montrent également l'importance du lieu de multiplication virale : la rate d'animaux infectés par influenza, à la différence de la rate des animaux infectés par LCMV, ne contient que 1 à 2 % de cellules CD8⁺ spécifiques d'antigène, tandis que les poumons de ces animaux en contiennent jusqu'à 70 % [15].

De telles intensités de cellules CD8 spécifiques d'Ag remettent donc fortement en cause le concept d'activation non spécifique (bystander activation) que laissait supposer la sous-estimation précédemment établie par LDA : la majorité des lymphocytes CD8⁺ au cours d'une infection virale aiguë lui sont spécifiques.

Ainsi, au cours de l'infection chronique par le VIH, des fréquences de l'ordre de 1 à 5 % de cellules CD8⁺ spécifiques sont détectées par marquage avec des tétramères CMH-I/peptide VIH, tandis que des études antérieures par LDA faisaient état de fréquence de l'ordre de 1/4 000 à 1/20 000 [17].

De même les fréquences de cellules CD8⁺ spécifiques d'antigène de l'EBV, obtenues avec les marquages tétramères CMH-I/peptide, de l'ordre de 5 à 6 %, sont quatre fois plus importantes que celles obtenues par ELISpot, ces dernières étant elles-mêmes cinq fois plus fortes que celles obtenues par dilution limite (LDA) [18, 19].

Définition des populations cellulaires définies par tétramères et LDA

Chacun de ces tests évalue en fait une population cellulaire différente (figure 1). Les tétramères CMH-I/peptide permettent de repérer des cellules spécifiques d'antigène, sans notion de fonctionnalité. Seule la spécificité antigénique est testée, et sont donc marqués les CTL effecteurs ou mémoires activés qui ont subi un processus d'amplification clonale après rencontre avec l'Ag.

La technique ELISpot mesure quant à elle une fonction, la production de cytokine (IFN-gamma ou TNF-alpha) induite par l'antigène testé. Elle permet de quantifier les populations cellulaires fonctionnelles parmi les CTL effecteurs ou mémoires activés marquées par les tétramères. Comme l'évaluation par tétramère, cette méthode se fait directement, sans culture à long terme, mais les fréquences moyennes sont généralement deux fois moins importantes. Les tests par dilution limite, ou LDA, permettent d'évaluer, grâce à la fonction de lyse, des CTL spécifiques d'antigènes après 15 j de culture, donc encore capables de se diviser au moins 10 à 15 fois. Les fréquences obtenues sont 10 à 30 fois inférieures à celles que donne un marquage par tétramères. Cette technique mesure donc en principe des CTL « précurseurs » (mais non naïfs) quiescents à l'initiation de la culture.

Ainsi les différences de fréquences obtenues avec ces différents tests s'expliquent par des différences à la fois de principes techniques, de statut fonctionnel et de différenciation. Lors des infections virales il semble que ces résultats soient corrélés bien qu'à des échelles différentes. Il ne semble pas que ce soit le cas cependant pour les CTL spécifiques de tumeurs. Le choix de la technique de quantification dépend donc du type de cellules que l'on souhaite quantifier.

Tétramères et ligands des CMH de classe I

Autre avancée liée aux tétramères : les tétramères CMH-I ont permis de déterminer les ligands de certains récepteurs NK. Les cellules NK, connues pour leur capacité à tuer les cellules qui n'expriment pas le CMH-I, infectées par des virus ou tumorales, peuvent moduler leur capacité lytique grâce à l'interaction entre des récepteurs NK, appelés KIR (killer-cell inhibitory receptor, récepteur inhibiteur des cellules tueuses) et leur ligand, le CMH-I de la cellule-cible [20]. En effet, la reconnaissance KIR/CMH-I provoque l'inhibition de la fonction cytotoxique de la cellule NK (signal non, off signal), tandis que l'absence de reconnaissance de CMH-I rend les cellules-cibles sensibles à la lyse NK : ce signal « non », permet donc aux cellules normales de ne pas être lysées. Les KIR ont également été retrouvés sur les cellules T activées, principalement CD8⁺, sur lesquelles ils peuvent transduire un signal inhibant le signal activateur déclenché par le TcR [21]. L'expression des KIR, constitutive sur les cellules NK matures, est inductible sur les lymphocytes T CD8⁺ [22]. Ainsi a été montrée une spécificité de reconnaissance entre HLA-E et le couple de récepteurs CD94-NKG2A [23].

Utilisation des tétramères en immunologie clinique

Au cours de l'infection chronique par VIH, la fréquence de lymphocytes CD8⁺ Tet⁺ est comprise entre 0,1 à 5 %, en l'absence de tout traitement et à distance de l'infection aiguë et peut s'élever à plus de 10 % lors de la phase aiguë de l'infection [8, 24, 25]. De telles fréquences de cellules circulantes CD8⁺Tet VIH⁺ effectrices activées nécessitent la présence continue du VIH. On note une diminution exponentielle de ces cellules CD8⁺Tet VIH⁺ lorsque la charge virale est contrôlée sous traitement efficace [7, 9, 24-26] (figure 4A). Selon la même logique, une augmentation, même transitoire, de la charge virale plasmatique ré-induit une augmentation de la fréquence de cellules CD8⁺ Tet VIH⁺ [25, 26].

La spécificité de l'interaction CTL et Tet CMH-I/peptide a été vérifiée in vitro sur une lignée CTL marquée avec la construction tétramérique HLA*0201/Gag VIH-1 (77-85, SLYNTVATL) (produite par C). Tournay, Immunotech-Coulter, Marseille) (figure 4B, gauche). Nous avons pu trier par cytométrie de flux, les populations CD8⁺ Tet VIH⁺ et CD8⁺ Tet VIH- puis l'activité cytotoxique de ces deux populations a été évaluée en CRA contre les cellules B-EBV autologues, chargées ou non en peptide Gag VIH-1 (77-85) : la seule population effectrice existante, spécifique de cet antigène, est contenue dans la fraction CD8⁺ Tet VIH⁺ (figure 4B, droite). Ceci nous a permis de montrer que le tétramère utilisé permet de séparer, de la population CD8 totale, la population CD8⁺ spécifique de l'épitope contenu dans le tétramère [25].

L'activité CTL spontanée (⁵¹Cr) est généralement corrélée au nombre de cellules CD8⁺Tet VIH⁺ [8] détectées ex vivo [9, 25].

Une corrélation significative et inverse a été démontrée entre la fréquence de CTL spécifiques de ce même peptide de Gag, évaluée par tétramères, et la charge virale plasmatique [8]. Cependant cette corrélation n'a pas été retrouvée par toutes les équipes [24]. Il semblerait que les lymphocytes CD8⁺ Tet VIH⁺ ne soient pas tous aussi fonctionnels, et capables d'activité cytotoxique. Ainsi les cellules CD8⁺ Tet CMV⁺ spécifiques d'un épitope de la pp65 du CMV et marquées par le tétramère HLA-A₂ correspondant mises en évidence chez certains patients co-infectés par VIH et CMV sont toutes fonctionnelles et [8], productrices de cytokines (IFN ou TNF) alors que seule une minorité de cellules CD8⁺Tet⁺VIH⁺ seraient fonctionnelles et contiendraient de la perforine. Ce phénomène d'altération fonctionnelle apparaîtrait en phase avancée de l'infection.

Par ailleurs une forte association entre HLA B*5701 et le statut de patients VIH⁺ asymptomatiques et non progresseurs à long terme de l'infection VIH (ALT ou LT-NP) a été mise en évidence. Cependant aucune différence significative n'a été observée entre les fréquences de cellules CD8⁺ marquées par un tétramère B*5701 contenant un épitope du VIH chez ces sujets B*5701 non progresseurs et les individus B*5701 progresseurs [27].

L'infection par le virus de l'hépatite C, VHC, se caractérise par une fréquence de cellules CD8⁺ spécifiques de VHC sensiblement plus faibles que celles mises en évidence dans l'infection à VIH : 0,01 à 1,2 % [28]. Néanmoins les fréquences de cellules CD8⁺ Tet⁺ VHC⁺, évaluées dans des biopsies de foie sont au moins 30 fois supérieures à celles mesurées dans le sang des mêmes individus. De plus, ces cellules CD8⁺ Tet VHC⁺ portent le marqueur d'activation précoce CD69, suggérant que ce sont des CTL activés [28]. Dans le cas du virus non cytopathique de l'hépatite B (VHB), le nombre absolu de lymphocytes intrahépatiques CD8⁺ Tet VHB⁺ chez des patients VHB⁺ avec et sans lésions du foie, est équivalent. En revanche l'inhibition de réplication du VHB a pu être associée à l'expansion de cellules CD8⁺ circulantes, pouvant proliférer après stimulation par VHB, mais restant indétectables chez les patients à forte virémie et présentant une inflammation hépatique [29].

Au cours de l'infection aiguë par EBV, de fortes fréquences, représentant près de 50 %, de cellules CD8⁺ dirigées contre une protéine du cycle lytique [30]) ont pu être rapportées. Après guérison, une chute brutale de ces CD8⁺Tet⁺ est observée, ces cellules restant détectables pendant au moins 3 ans. Des fréquences de 0,5 à 6 % sont en général détectées chez les porteurs chroniques et les cellules spécifiques des protéines du cycle lytique du virus sont dix fois plus importante que les cellules spécifiques des protéines latentes [18, 30]. Dans ce cas, les fréquences détectées sont proches de celles obtenues pour le VIH.

Après infection primaire par cytomégalovirus (CMV), le virus persiste de façon latente dans les cellules myéloïdes. À ce stade, la proportion de cellules CD8⁺ Tet CMV⁺ est comprise entre 0,1 et 9 % [31]. Une réactivation du CMV, après greffe de rein par exemple, peut induire des fréquences de lymphocytes CD8⁺Tet CMV⁺ pouvant atteindre 15 % [31]. En cas de co-infections par VIH et CMV les fréquences des cellules CD8⁺Tet CMV⁺ sont jusqu'à 10 fois supérieures aux fréquences de cellules CD8⁺T et VIH⁺ [32].

Nous avons plus particulièrement étudié un cas de réactivation du CMV lors de l'infection VIH (figure 5). Chez ce patient, à l'initiation du traitement anti-rétroviral (ARV), la charge virale VIH était de 12 000 copies/ml et le taux de lymphocytes T CD4⁺ à 20 cellules/mm³. Les résultats de culture de virus CMV sur fibroblastes étaient positifs mais nous n'avons pas détecté de réponse T CD4⁺ anti-CMV par test classique de prolifération avec incorporation de thymidine. La mesure du nombre de CTL spécifiques du CMV par Tet CMV a mis en évidence une forte fréquence de lymphocytes CD8⁺ spécifiques de pp65, à la fois à l'initiation et après 1 mois de traitement ARV. Après 6 mois de traitement ARV efficace, le nombre de CTL spécifiques du CMV restait élevé, tandis que l'on assistait à la restauration d'une réponse T CD4 spécifique du CMV, et une disparition de CMV circulant en l'absence de tout traitement anti-CMV. Ce contrôle de la réactivation du CMV s'est maintenu au long cours, la charge virale anti-VIH devenant indétectable.

Lymphocytes T CD8⁺ spécifiques de tumeurs

Les premiers tétramères CMH-I/antigène MART-1 de mélanome ont été synthétisés en 1998, et ont permis de mettre en évidence des CTL spécifiques dans des ganglions tumoraux [33]. Ainsi, 0,22 à 1,8 % des lymphocytes T CD8⁺ fixaient les tétramères CMH-I/peptide de mélanome, tandis que les fréquences obtenues par LDA étaient 5 à 20 fois inférieures [33]. Deux tétramères contenant deux antigènes tumoraux exprimés sur 80-100 % des mélanomes humains, MelanA/MART-1 et gp100, ont permis d'isoler des lymphocytes T CD8⁺ spécifiques de ces antigènes, puis de les cloner et les expandre in vitro [34] : 80 % des clones fixant les tétramères avec une forte intensité étaient réactifs contre la tumeur et capables de lyser des cibles portant un antigène tumoral tandis que 15 % seulement des clones fixant le tétramère avec une faible intensité réagissaient avec la tumeur [34]. Cependant les cellules CD8⁺ fixant ce type de tétramères ne pouvaient ni lyser leur cible tumorale directement ex vivo, ni produire des cytokines après stimulation par mitogènes, alors que des lymphocytes CD8⁺ issus du même patient développaient de fortes réponses allogéniques. Cette étude par tétramères montre que les CTL spécifiques de tumeurs sont anergiques in vivo [35] mais peuvent récupérer leur activité fonctionnelle après stimulation in vitro. Par ailleurs, au cours du vitiligo, maladie auto-immune caractérisée par une perte de mélanocytes épidermiques, les fréquences de cellules CD8⁺ liant le tétramère HLA-A2/MelanA⁺ circulants sont élevées et corrélées à l'intensité de la maladie [36].

L'utilisation de clones CTL de spécificité connue pourrait faciliter le développement d'immunothérapie adoptive utilisant des CTL spécifiques d'antigènes tumoraux. Les difficultés techniques d'obtention de ces clones ont limité cette voie d'investigation. Par rapport aux procédures classiques, l'obtention de tels clones grâce à ces tétramères est plus simple, plus rapide, et les cellules isolées tout aussi spécifiques [6, 37]. L'isolement de CTL spécifiques d'antigènes tumoraux, présents à des fréquences relativement faibles dans des prélèvements issus de sang périphérique, de ganglions tumoraux ou de métastases cutanées, a ainsi pu être réalisé avec des tétramères CMH-I/peptide (épitopes : Melan-A, tyrosinase, MAGE3).

Enfin, des tétramères HLA A*0201 contenant un épitope de la protéine E7 du papillomavirus (HPV) marquent de 1/1 855 à 1/42 004 cellules CD8⁺ chez le sujet normal, et de 1/1 260 à 1/19 073 chez les patientes associant cancer du col au néoplasie intra-épithéliale cervicale préinvasive [38]. L'utilisation de ces tétramères pourrait servir ultérieurement à isoler les cellules CD8⁺ Tet⁺, présentes à faibles fréquences dans ces tumeurs lors de protocoles d'immunothérapies [38].

Limites à l'utilisation des tétramères

Si l'utilisation de ces tétramères semble être d'une facilité quasi enfantine, certaines limites apparaissent néanmoins. Des limites de spécificité tout d'abord. La fixation non spécifique des tétramères, bien que faible, peut être encore réduite en mutant un acide aminé impliqué dans l'affinité CMH-I/CD8 [39]. Ces fixations non spécifiques sont en partie dues à la faible affinité des complexes CMH/peptides pour les TCR ainsi qu'à l'interaction possible de ces tétramères avec les récepteurs au CMH des cellules NK. Cette faible affinité impose également des conditions de marquage plus stringentes qu'avec des anticorps monoclonaux et des temps d'incubation supérieurs d'au moins 30 à 45 min généralement à température ambiante.

Une autre limitation provient de la nécessité absolue de connaître avec précision les épitopes optimaux pour chacun des antigènes étudiés ainsi que l'élément de restriction HLA. L'utilisation des tétramères est donc la suite logique de la « chasse » aux épitopes à laquelle procèdent les immunologistes mais ne peut se substituer à celle-ci ni la précéder.

CONCLUSION

Les complexes tétramériques composés de molécules CMH de classe I chargés en peptide permettent donc la visualisation directe ex vivo des cellules T CD8⁺ spécifiques d'antigène par cytométrie de flux introduisant une véritable révolution dans l'évaluation de ces cellules. De constants apports technologiques viennent régulièrement améliorer ce nouveau champ d'investigation. La prochaine étape sera la génération de tétramères CMH-II/peptide, qui permettront le même type d'étude sur les lymphocytes CD4 [40].

La quantification, l'analyse phénotypique et l'isolement des cellules fixant ces tétramères ont permis et permettront d'étendre considérablement notre connaissance des cellules CD8 dans un but cognitif ou appliqué à la clinique, à la thérapeutique ou à la recherche de vaccins.

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