Stratégies d'identification de gènes suppresseurs de tumeurs dans les leucémies aiguës lymphoblastiques

ARTICLE

Les altérations génétiques à l'origine des leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL) sont encore très mal connues. L'idée est généralement admise que, de même que pour les tumeurs solides, la leucémogenèse procède par accumulation progressive d'altérations génétiques, chaque altération procurant un avantage sélectif de croissance à la cellule. Les connaissances actuelles concernant les bases moléculaires de la leucémogenèse proviennent en grande majorité de l'étude des points de cassure de translocations récurrentes observées lors de l'étude cytogénétique des blastes. Cette approche a permis d'impliquer dans la genèse des leucémies aiguës lymphoblastiques l'activation de certains oncogènes ainsi que la création de gènes chimères codant des protéines à activité oncogénique [1]. En revanche, jusqu'à une époque récente, aucun gène suppresseur de tumeur* (GST) n'avait été impliqué de façon convaincante dans la leucémogenèse. En effet, contrairement aux tumeurs solides, les prédispositions génétiques aux leucémies sont rares et il n'a donc pas été possible d'utiliser l'analyse de liaison dans des familles, démarche à l'origine du clonage de nombreux gènes suppresseurs de tumeur en pathologie tumorale héréditaire. Pourtant, les données cytogénétiques concernant les leucémies aiguës lymphoblastiques témoignent de l'existence de délétions touchant de façon récurrente différentes zones chromosomiques [2]. Ce type d'observation suggère la présence, au sein des régions délétées, de gènes suppresseurs de tumeur.

La recherche d'altérations de gènes suppresseurs de tumeur dans une tumeur donnée peut être ciblée sur l'étude de gènes candidats ou bien reposer sur une analyse globale des différences entre cellules cancéreuses et cellules normales. Dans ce dernier cas, on peut schématiquement distinguer deux types de stratégies selon qu'elles reposent ou non sur la localisation chromosomique préalable du gène recherché [3]. Les stratégies présentées ici ont été jusqu'ici essentiellement développées et appliquées à l'étude des tumeurs solides mais sont adaptées tout aussi bien à l'analyse des hémopathies malignes.

* Indépendamment de son rôle physiologique ou du mécanisme d'inactivation, un gène suppresseur de tumeur sera défini, dans la suite de cette revue, comme un gène dont l'inactivation contribue au déclenchement tumoral ou à sa progression.

Étude de gènes candidats

Différents types d'arguments peuvent faire suspecter le rôle suppresseur de tumeur d'un gène dans les leucémies. Il peut s'agir de gènes dont l'implication est déjà établie dans des tumeurs solides. Sont également candidats les homologues humains de gènes suppresseurs de tumeur identifiés dans d'autres espèces  : ainsi, une dizaine de gènes suppresseurs de tumeur de drosophile ont des homologues humains [4]. Enfin, des gènes peuvent être candidats en raison de leur fonction cellulaire qui suggère une action anti-oncogène (régulation négative du cycle cellulaire, activité proapoptotique, maintien de la stabilité du génome).

La liste des gènes candidats s'allonge donc très rapidement à mesure que les connaissances progressent sur la régulation des processus de prolifération et de différenciation des cellules hématopoïétiques et que de nouveaux gènes suppresseurs de tumeur sont identifiés dans des tumeurs solides. Il est extrêmement difficile, cependant, de définir a priori de bons gènes candidats sur la seule indication de la fonction du gène. En effet, il faut que l'inactivation de ce gène, d'une part, ne soit pas compensée par d'autres gènes dont les fonctions peuvent être partiellement redondantes et, d'autre part, ne soit pas létale pour la cellule. Ainsi, l'étude de gènes suppresseurs de tumeur connus pour leur implication dans les tumeurs solides (P53, Rb1) s'est montrée décevante, mettant en évidence la rareté des anomalies de ces gènes dans les leucémies aiguës lymphoblastiques [5]. De même, l'étude de nombreux gènes régulant négativement le cycle cellulaire (P21^Cip1, P27^KIP1, P18^INK4C, P19^INK4D) s'est révélée infructueuse [6, 7].

À l'inverse, la recherche d'anomalies de MTS1, gène codant pour deux protéines distinctes (p16^INK4A et p19^ARF) qui contrôlent toutes deux la prolifération cellulaire, a permis de montrer que ce gène était la cible très fréquente de délétions dans les leucémies aiguës lymphoblastiques T et un peu moins souvent dans les leucémies aiguës lymphoblastiques de lignée B [8]. Il faut noter que, dans ce cas, le rôle physiologique du gène (régulation négative du cycle cellulaire), son implication dans des tumeurs solides et sa localisation dans une région chromosomique fréquemment remaniée dans les leucémies concouraient à le désigner comme gène candidat.

 

Analyse globale des différences entre cellule tumorale et cellule normale

À la différence de l'approche par gène candidat, ces stratégies permettent une étude globale du génome, sans a priori, et peuvent donc déboucher sur l'identification de gènes jusqu'alors inconnus.

Approches positionnelles

Les approches positionnelles se proposent d'identifier un gène suppresseur de tumeur à partir d'informations concernant sa localisation sur le génome. L'implication d'un gène suppresseur de tumeur suppose l'inactivation des deux allèles par différents mécanismes, dont la perte fréquemment observée d'un allèle de ce gène. Une première localisation de régions susceptibles de contenir des gènes suppresseurs de tumeur peut donc être obtenue par différentes techniques qui permettent de dépister de façon systématique les délétions au sein du génome des cellules tumorales.

Les différentes possibilités de localisation

• Cytogénétique

Contrairement au cas des tumeurs solides, les données cytogénétiques concernant les hémopathies malignes sont extrêmement abondantes. En ce qui concerne les leucémies aiguës lymphoblastiques, trois régions présentent de fréquentes délétions. Il s'agit des régions chromosomiques 9p21, 12p13, et 6q21-27, délétées respectivement dans 10, 5, et 5 à 10 % des leucémies aiguës lymphoblastiques à caryotype anormal [2, 9, 10]. À côté de ces régions majeures, de nombreux sites délétionnels mineurs ont été rapportés [2]. Au total, une délétion est retrouvée dans environ 15 à 20 % des leucémies aiguës lymphoblastiques à caryotype anormal. L'ampleur et la localisation des délétions peuvent être précisées par la technique d'hybridation in situ (FISH) utilisant différents types de sondes (cosmides, YAC principalement) dont la localisation est connue.

• Hybridation génomique comparative

L'hybridation chromosomique comparative (CGH) permet l'identification des régions chromosomiques sujettes à un gain (amplification) ou à une perte de matériel génétique (délétion) par comparaison à des cellules normales [11]. L'ADN normal et l'ADN tumoral sont hybridés simultanément sur des chromosomes métaphasiques normaux. Un marquage fluorescent différentiel permet de détecter les quantités respectives d'ADN normal et d'ADN tumoral au niveau de chaque région chromosomique et de mettre ainsi en évidence un déséquilibre de leur représentation au sein du génome. La résolution de l'hybridation chromosomique comparative dépend étroitement de la qualité de l'analyseur d'image, du pourcentage de cellules normales au sein de l'échantillon, et du nombre de copies perdues (une délétion bi-allélique pourra être détectée à partir de 1-2 Mb alors qu'une délétion mono-allélique ne sera détectée qu'à partir de 3-5 Mb dans le meilleur des cas).

L'hybridation chromosomique comparative a été initialement développée pour pallier les difficultés techniques associées au caryotype des tumeurs solides. Malgré l'étude de nombreux types de tumeurs, un seul gène suppresseur de tumeur a été localisé par hybridation chromosomique comparative à ce jour [12], probablement du fait de sa faible résolution pour la détection de délétions, contrairement aux amplifications. Une étude récente sur les leucémies aiguës lymphoblastiques de l'enfant a montré, en ce qui concerne les délétions, que les résultats sont globalement superposables aux données de cytogénétique et que la délimitation des régions n'est pas plus fine qu'avec un banding classique [13]. Dans un avenir proche, il est vraisemblable que des techniques dérivées de l'hybridation chromosomique comparative permettront d'améliorer considérablement sa résolution. Ainsi, les possibilités d'hybridation sur ADN décondensé, d'une part, et l'essor des supports d'hybridation miniaturisés (DNA chips ou puces à ADN), d'autre part, permettent d'envisager de substituer aux chromosomes métaphasiques d'autres substrats d'hybridation. La mise au point d'une puce ADN contenant des sondes régulièrement espacées sur le génome pourrait permettre une approche globale des délétions et des amplifications à un degré de résolution potentiellement très élevé car dépendant directement du nombre de sondes [14].

• Allélotype

Lorsqu'une région chromosomique est délétée, les marqueurs polymorphes situés dans cette région, qui présentent une hétérozygotie constitutionnelle chez un patient, apparaîtront homozygotes dans le tissu tumoral de ce patient en raison de la perte d'un allèle (d'où la qualification de perte d'hétérozygotie) (figure 1).

Ainsi, la mise en évidence d'une perte d'hétérozygotie touchant de façon récurrente les marqueurs polymorphes d'une région conduira à suspecter la présence au sein de cette région d'un gène suppresseur de tumeur dont l'inactivation participe au déclenchement tumoral et/ou à sa progression [15]. Les développements récents des différentes cartes du génome humain (cartes physique, génétique, transcriptionnelle) confèrent à cette approche une puissance nouvelle.

Les marqueurs analysés pour étudier les pertes d'hétérozygotie sont actuellement presque exclusivement des marqueurs de type microsatellite. Ces marqueurs sont hautement polymorphes dans les génomes de mammifères. Les microsatellites peuvent être étudiés par amplification génique in vitro (PCR). Leur nombre est estimé à 10⁵ et ils sont dispersés sur l'ensemble du génome humain. Aujourd'hui, plus de 8 000 microsatellites sont identifiés et localisés, ce qui correspond à une moyenne de 2 à 3 marqueurs par mégabase. L'abondance de ces marqueurs ainsi que la possibilité d'automatisation de leur analyse et leur fort pourcentage d'hétérozygotie dans la population font des microsatellites un outil de choix pour l'étude des pertes d'hétérozygotie dans les cancers.

L'étude globale des pertes d'hétérozygotie associées à un type de tumeur peut être réalisée en analysant un ou plusieurs marqueurs présents sur chacun des bras chromosomiques. On obtient alors ce que Vogelstein a appelé un "allélotype" de la tumeur étudiée, par analogie avec le caryotype. Le premier allélotype publié concernait les adénocarcinomes colorectaux [16]. Depuis, ce type d'approche a permis l'investigation de très nombreux types de cancers solides, apportant de précieux renseignements quant à l'implication de gènes suppresseurs et à leur localisation [3]. L'allélotype d'une tumeur constitue en quelque sorte une version complémentaire du caryotype. Alors qu'une délétion n'est cytogénétiquement visible que si sa taille dépasse plusieurs mégabases, l'allélotype permet de détecter des petites délétions avec une probabilité qui est directement liée à la densité des marqueurs utilisés. De plus, les mécanismes inactivateurs n'entraînant pas de perte franche de matériel génétique tels que l'isodisomie uniparentale acquise ou les recombinaisons mitotiques sont indétectables au microscope mais entraîneront une perte d'hétérozygotie à l'allélotype. Par ailleurs, cette approche nécessite peu de matériel tumoral et aucune culture n'est nécessaire, ce qui élimine d'éventuels biais liés à la sélection de clones présentant un avantage prolifératif in vitro.

En revanche, l'allélotype présente certaines limites. Comme l'hybridation chromosomique comparative, il ne permet pas une étude individualisée des cellules tumorales mais donne un résultat moyen sur l'ensemble des cellules testées. Ainsi, une anomalie ne sera détectée que si elle est présente dans la majorité des cellules analysées et la coexistence de différents clones cellulaires ne sera pas visible. Il est donc important de connaître la proportion de cellules tumorales pour interpréter de façon fiable les résultats obtenus et une richesse d'au moins 70 % en cellules tumorales au sein de l'échantillon analysé est requise. Enfin, il est important de rappeler que, contrairement à l'hybridation chromosomique comparative, l'étude des pertes d'hétérozygotie ne détecte pas une perte de matériel en soi mais un déséquilibre de représentation allélique. Ainsi, l'observation d'une perte d'hétérozygotie peut révéler soit la perte quantitative d'un allèle, soit sa perte qualitative (conversion génique ou isodisomie uniparentale), soit, au contraire, l'amplification d'une région chromosomique.

Deux études globales des pertes d'hétérozygotie ont été publiées avec un nombre relativement restreint de marqueurs et/ou de patients dans les leucémies aiguës lymphoblastiques de l'enfant [17, 18]. La faible fréquence de perte d'hétérozygotie témoigne d'une relative stabilité génomique des cellules leucémiques qui se différencient ainsi de la plupart des cellules cancéreuses de tumeurs solides étudiées à ce jour. Plus récemment, un allélotype plus résolutif a été réalisé par notre laboratoire, en utilisant 247 marqueurs microsatellites répartis sur l'ensemble des chromosomes, soit un marqueur tous les 10 cM. Les résultats de cet allélotype obtenus sur 63 enfants atteints de leucémie aiguë lymphoblastique de lignée B mettent en évidence cinq régions du génome qui sont les sièges de pertes d'hétérozygotie récurrentes dans plus de 10 % des cas. Il s'agit des régions 9p et 12p au sein desquelles les gènes cibles des délétions sont déjà identifiés [8, 19] et des régions 5p, 6q, et 20q (manuscrit soumis).

Les principaux résultats obtenus sont représentés sur le tableau I.

La signification des anomalies observées pour les régions montrant des fréquences faibles de perte d'hétérozygotie reste évidemment délicate à interpréter dans la mesure où l'observation d'une délétion ne traduit pas nécessairement son implication dans la leucémogenèse mais peut simplement refléter le caractère clonal de la population cellulaire étudiée. C'est donc la récurrence des délétions dans une région chromosomique donnée qui constitue un indice quant à la présence vraisemblable d'un gène suppresseur de tumeur dans cette région. L'efficacité de cet allélotype utilisant un marqueur tous les 10 cM a pu être évaluée sur les bras chromosomiques 9p et 12p puisque, chez les mêmes patients, une étude directe des gènes cibles des délétions dans ces régions avait été effectuée. Les résultats sont résumés sur le tableau II.

La sensibilité apparaît nettement supérieure à celle de la cytogénétique alors que les marqueurs utilisés avaient été choisis sans a priori, uniquement sur la base de leur espacement régulier sur le génome.

De la région au gène

• Délimitation de la région d'intérêt

Les régions définies par un allélotype sont généralement de taille trop importante pour permettre le clonage positionnel du gène suppresseur de tumeur. Il faudra donc tenter de restreindre l'intervalle d'intérêt. Pour cela, une bonne connaissance de la carte physique de la région est requise. Une étape préalable consistera donc à préciser, si nécessaire, cette carte physique de manière à ordonner les différents marqueurs et, le cas échéant, à en identifier de nouveaux.

La recherche de pertes alléliques à l'aide de marqueurs supplémentaires présents dans la zone d'intérêt permet de délimiter, en comparant les délétions de plusieurs patients, une "région délétée minimale" censée contenir le gène suppresseur de tumeur. L'efficacité de cette démarche dépend de la fréquence de l'anomalie, de l'abondance de marqueurs polymorphes disponibles, de la taille moyenne des délétions... et de la chance. Appliquée à l'étude des délétions de la région 12p13 dans les leucémies aiguës lymphoblastiques pédiatriques, cette approche nous a permis d'exclure le gène KIP1 et d'incriminer le gène TEL en révélant la présence de petites délétions intragéniques [19, 20].

• Recherche de doubles délétions

L'étude des PDH détecte les délétions mono-alléliques et permet dans certains cas de suspecter des délétions homozygotes. En effet, ces dernières se manifestent par une "interruption de perte d'hétérozygotie" au sein d'une région délétée. Le maintien apparent de l'hétérozygotie au niveau des régions dont les deux allèles sont délétés dans les cellules malignes est alors dû à l'amplification des cellules normales résiduelles inévitablement présentes au sein des échantillons tumoraux. Les lignées cellulaires constituent également un matériel d'étude intéressant car une double délétion se manifestera par une absence totale d'amplification des marqueurs. On peut ainsi utiliser un plus grand nombre de marqueurs localisés dans l'intervalle d'intérêt car il n'est alors plus nécessaire que ces marqueurs soient polymorphes. La présence de doubles délétions peut également être recherchée par FISH ou par Southern blot.

Une autre approche théoriquement possible, mais qui demande à être validée, consiste à déterminer l'origine parentale des allèles délétés. Les résultats obtenus pour l'analyse de la région 9p21 nous montrent que, en cas d'inactivation par délétion bi-allélique, la région doublement délétée est souvent nettement plus réduite que la région de perte d'hétérozygotie [21]. On peut imaginer que les doubles délétions proviennent, au moins dans certains cas, de la survenue de deux délétions partiellement chevauchantes (figure 2).

Si on est capable d'identifier l'origine parentale de la perte d'hétérozygotie, l'observation d'un point de transition entre perte des marqueurs paternels et perte des marqueurs maternels permettra de montrer qu'il existe bien une double délétion et de la localiser. Tout nouveau marqueur étudié permettra alors de restreindre la zone d'intérêt jusqu'à arriver au niveau de la double délétion. Une telle approche peut, par ailleurs, mettre en évidence la perte préférentielle d'un des allèles et amener ainsi à suspecter que le gène cible est soumis à l'empreinte parentale, auquel cas, un seul événement inactivateur suffit à l'extinction totale du gène.

• Étude des translocations inactivatrices

La recherche de translocations inactivatrices par FISH et le clonage des points de cassure peuvent être envisagés. Les translocations inactivatrices sont des événements rares mais qui ont, en principe, l'intérêt de désigner précisément le gène recherché. Il pourrait donc être envisagé d'étudier des translocations, même peu fréquentes, dont l'un des points de translocation correspond à une région de pertes d'hétérozygoties récurrentes. Ainsi, le gène MTS1 a été cloné de manière indépendante grâce à l'étude d'une translocation impliquant la région 9p21 [22].

Cependant, cette démarche n'est pas toujours aisée. Le gène en cause peut être délété au cours de la translocation. Une translocation peut induire des modifications loco-régionales qui touchent des gènes situés à distance du point de cassure. Le gène FHIT illustre les difficultés qui peuvent être associées à ce type d'approche. FHIT est clivé par une t(3;8)(p14.2;q24) associée à un carcinome rénal familial [23] mais son implication dans les tumeurs reste néanmoins très controversée.

• Recherche de gènes

Une fois la région délimitée, il reste à identifier le gène en cause et donc, dans un premier temps, à répertorier les gènes situés dans la région d'intérêt. Cette étape de recherche de gène peut être plus ou moins longue et difficile, dépendant de la connaissance de la région chromosomique concernée et de sa taille. Actuellement, un nombre encore faible de séquences exprimées est localisé, mais les programmes en cours laissent penser qu'une proportion importante de ces séquences (et donc de gènes) sera positionnée sur la carte physique du génome dans un avenir très proche. L'inventaire des gènes localisés dans la région peut désigner un ou plusieurs gènes candidats dont la fonction physiologique est compatible avec un rôle suppresseur de tumeur. Cependant, il est souvent difficile de prévoir la réalité de l'implication d'un gène dans le développement tumoral et le pari que l'on peut faire sur un gène candidat est d'autant moins risqué que la délimitation de la région d'intérêt est fine et que le nombre de gènes présents au sein de cette région est faible.

• Mise en cause d'un gène

La démonstration que le gène est bien impliqué dans la leucémogenèse repose sur la mise en évidence de son inactivation bi-allélique dans les cellules tumorales. Seront alors utilisées les techniques classiques permettant de rechercher les mutations de l'allèle non délété, les délétions intragéniques ou les anomalies de méthylation. Cette étape peut être difficile dans les cas où l'inactivation d'un gène suppresseur fait appel à des délétions bi-alléliques de grande taille impliquant plusieurs gènes ; ce problème s'est posé quant à l'implication de MTS1 dans les leucémies aiguës lymphoblastiques dans la mesure où certaines délétions comprenaient également le gène voisin MTS2 [8, 21].

Par ailleurs, bien que l'inactivation bi-allélique semble de règle, il est possible que, dans certains cas, un simple effet de dosage génique soit impliqué dans la tumorigenèse.

Dans un second temps, si le gène identifié est inconnu, des approches fonctionnelles de surexpression ou d'inhibition in vitro et in vivo permettent de vérifier la vraisemblance de son activité suppresseur de tumeur.

Approches non positionnelles

Récemment, des approches globales, autres que l'approche positionnelle, ont été développées, permettant d'identifier des différences de structure ou d'expression du génome entre deux types cellulaires.

Des techniques fondées sur l'hybridation soustractive de produits PCR ont été proposées pour "cloner la différence" entre deux génomes [24]. Appliquées à la pathologie maligne, ce type de technique peut permettre d'isoler des fragments d'ADN correspondant à des délétions homozygotes par différence entre génome des cellules normales et génome tumoral et donc, de contribuer à l'isolement de gènes suppresseurs de tumeur lorsque le mécanisme d'inactivation est une délétion bi-allélique. Cette approche a récemment contribué à l'identification de gènes suppresseurs de tumeur dans des tumeurs du sein, du pancréas et du système nerveux central : BRCA₂, PTEN et DMBT₁ [3, 25]. Elle n'a pas encore, à ce jour, été utilisée avec succès dans des hémopathies.

Par ailleurs, l'analyse des différences de représentation des transcrits entre cellules normales et tumorales peut être conduite par plusieurs approches dont certaines font appel à la PCR [26, 27] et d'autres à l'hybridation [28-30] sur des sondes immobilisées ou au séquençage massif de très courts fragments d'ADNc [31]. Ces techniques peuvent toutes être utilisées pour recenser les modifications d'expression génétique liées à la tumorogenèse et ont certainement un intérêt majeur pour mettre en évidence les modifications des réseaux fonctionnels qui sont perturbés dans les cellules tumorales [32] ainsi que pour essayer de corréler des modifications d'expression avec la sensibilité des cellules à des drogues chimiothérapeutiques [33]. De plus, l'inactivation d'un gène suppresseur de tumeur conduisant, dans certains cas, à l'absence d'ARNm issu de ce gène, l'analyse des transcrits peut également désigner des gènes suppresseurs de tumeur potentiels : en effet, dans un certain nombre de cas, l'inactivation (par délétions, l'hyperméthylation du promoteur ou encore certaines mutations ponctuelles) se traduit alors par la diminution de la production des ARNm issus de ce gène.

CONCLUSION

REFERENCES

1. Rabbitts TH. Chromosomal translocations in human cancer. Nature 1994 ; 372 : 143-9.

2. Johansson B, Mertens F, Mitelman F. Cytogenetic deletion maps of hematologic neoplasms : circumstantial evidence for tumor suppressor loci. Genes Chrom Cancer 1993 ; 8  : 205-18.

3. Fearon ER. Human cancer syndromes : clues to the origin and nature of cancer. Science 1997  ; 278 : 1043-50.

4. Banfi S, Borsani G, Rossi E, Bernard L, Guffanti A, Rubboli F, Marchitiello A, Giglio S, Coluccia E, Zollo M, Zuffardi O, Ballabio A. Identification and mapping of human cDNAs homologous to Drosophila mutant genes through EST database searching. Nature Genet 1996 ; 13 : 167-74.

5. Fairbairn L J, Dexter TM. Molecular biology of hematopoietic neoplasia. Current Opinion Hemat 1993 : 208-13.

6. Sieber R, Willers CP, Opalka B. Role of the cyclin-dependent kinase 4 and 6 inhibitor gene family p15, p16, p18 and p19 in leukemia and lymphoma. Leuk Lymphoma 1996  ; 23 : 505-20.

7. Hayette S, Thomas X, Bertrand Y, Tigaud I, Callanan M, Thiebaut A, Charrin C, Archimbaud E, Magaud JP, Rimokh R. Molecular analysis of cyclin-dependent kinase inhibitors in human leukemias. Leukemia 1997 ; 11 : 1696-9.

8. Cayuela JM, Madani A, Sanhes L, Stern MH, Sigaux F. Multiple tumor-suppressor gene 1 inactivation is the most frequent genetic alteration in T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood 1996 ; 87 : 2180-6.

9. Raimondi SC. Current status of cytogenetic research in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood 1993 ; 81 : 2237-51.

10. Mitelman F, Kaneko Y, Berger R. Report of the committee on chromosome changes in neoplasia. Human Gene Mapping 1993 : 773-812.

11. Forozan F, Karhu R, Kononen J, Kallioniemi A, Kallioniemi OP. Genome screening by comparative genomic hybridization. TIG 1997 ; 13 : 405-9.

12. Hemminki A, Tomlinson I, Markie D, Järvinen H, Sistonen P, Björkqvist AM, Knuutila S, Salovaara R, Bodmer W, Shibata D, de la Chapelle A, Aaltonen LA. Localization of a susceptibility locus for Peutz-Jeghers syndrome to 19p using comparative genomic hybridization and targeted linkage analysis. Nature Genet 1997 ; 15 : 87-90.

13. Karhu R, Siitonen S, Tanner M, Keinänen M, Mäkipernaa A, Lehtinen M, Vilpo JA, Isola J. Genetic aberrations in pediatric acute lymphoblastic leukemia by comparative genomic hybridization. Cancer Genet Cytogenet 1997 ; 95 : 123-9.

14. Trent JM, Bittner M, Zhang J, Wiltshire R, Ray M, Su Y, Gracia E, Meltzer P, De Risi J, Penland L, Brown P. Use of microgenomic technology for analysis of alterations in DNA copy number and gene expression in malignant melanoma. Clin Exp Immunol 1997 ; 107 (suppl. 1) : 33-40.

15. Lasko D, Cavenee W, Nordenskjöld M. Loss of constitutional heterozygosity in human cancer. Annu Rev Genet 1991 ; 25 : 281-314.

16. Vogelstein B, Fearon ER, Kern SE, Hamilton SR, Preisinger AC, Nakamura Y, White R. Allelotype of colorectal carcinomas. Science 1989 ; 244 : 207.

17. Takeuchi S, Bartram CR, Wada M, Reiter A, Hatta Y, Seriu T, Lee E, Miller CW, Miyoshi I, Koeffler HP. Allelotype analysis of childhood acute lymphoblastic leukemia. Cancer Res 1995 ; 55 : 5377-82.

18. Cavé H, Guidal C, Elion J, Vilmer E, Grandchamp B. A low rate of loss of heterozygosity is found at many different loci in childhood B-lineage acute lymphocytic leukemia. Leukemia 1996 ; 10 : 1486-91.

19. Raynaud S, Cavé H, Baens M, Bastard C, Cacheux V, Grosgeorge J, Guidal-Giroux C, Guo C, Vilmer E, Marynen P, Grandchamp B. The 12;21 translocation involving TEL and deletion of the other TEL allele : two frequently associated alterations found in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood 1996 ; 87  : 2891-9.

20. Cavé H, Cacheux V, Raynaud S, Brunie G, Bakkus M, Cochaux P, Preudhomme C, Lai JL, Vilmer E, Grandchamp B. ETV6 is the target of chromosome 12p deletions in t(12;21) childhood acute lymphocytic leukemia. Leukemia 1997 ; 11 : 1459-64.

21. Guidal-Giroux C, Gérard B, Cavé H, Duval M, Rohrlich P, Elion J, Vilmer E, Grandchamp B. Deletion mapping indicates that MTS1 is the target of frequent deletions at chromosome 9p21 in paediatric acute lymphoblastic leukaemias. Br J Haematol 1996 ; 92 : 410-9.

22. Duro D, Bernard O, Della Valle V, Leblanc T, Berger R, Larsen CJ. Inactivation of the P16INK4/MTS1 gene by a chromosome translocation t(9 ;14)(p21-22 ;q11) in an acute lymphoblastic leukemia of B-cell type. Cancer Res 1996 ; 56 : 848-54.

23. Ohta M, Inoue H, Cotticelli MG, Kastury K, Baffa R, Palazzo J, Siprashvili Z, Mori M, McCue P, Druck T, Croce CM, Huebner K. The FHIT gene, spanning the chromosome 3p14.2 fragile site and renal carcinoma-associated t(3 ;8) breakpoint, is abnormal in digestive tract cancers. Cell 1996 ; 84 : 587-97.

24. Lisitsyn N, Wigler M. Cloning the differences between two complex genomes. Science 1993  ; 259 : 946-51.

25. Mollenhauer J, Wiemann S, Scheurlen W, Korn B, Hayashi Y, Wilgenbus KK, von Deimling A, Poustka A. DMBT1, a new marker of the SRCR superfamily, on chromosome 10q25.3-26.1 is deleted in malignant brain tumours. Nature Genet 1997 ; 17 : 32-9.

26. Diatchenko L, Lau YF, Campbell AP, Chenchik A, Moqadam F, Huang B, Lukyanov S, Lukyanov K, Gurskaya N, Sverdlov ED, Siebert PD. Suppression subtractive hybridization : a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries. Proc Natl Acad Sci USA 1996 ; 93 : 6025-30.

27. Zhang H, Zhang R, Liang P. Differential screening of gene expression difference enriched by differential display. Nucleic Acids Res 1996 ; 24 : 2454-5.

28. DeRisi J, Penland L, Brown PO, Bittner ML, Meltzer PS, Ray M, Chen Y, Su YA, Trent JM. Use of a cDNA microarray to analyse gene expression patterns in human cancer. Nature Genetics 1996 ; 14 : 457-60.

29. Lockhart DJ, Dong HL, Byrne MC, Follettie MT, Gallo MV, Chee MS, Mittmann M, Wang CW, Kobayashi M, Horton H, Brown EL. Expression monitoring by hybridization to high-density oligonucleotide arrays. Nature Biotechnology 1996 ; 14 : 1675-80.

30. Schena M, Shalon D, Heller R, Chai A, Brown PO, Davis RW. Parallel human genome analysis : microarray-based expression monitoring of 1 000 genes. Proc Natl Acad Sci USA 1996  ; 93 : 10614-9.

31. Velculescu VE, Zhang L, Vogelstein B, Kinzler KW. Serial analysis of gene expression. Science 1995 ; 270 : 484-7.

32. Zhang L, Zhou W, Velculescu VE, Kern SE, Hruban RH, Hamilton SR, Vogelstein B, Kinzler KW. Gene expression profiles in normal and cancer cells. Science 1997 ; 276 : 1268-72.

33. Weinstein JN, Myers TG, O'Connor PM, Friend SH, Fornace AJ, Kohn KW, Fojo T, Bates SE, Rubinstein LV, Anderson NL, Buolamwini JK, van Osdol WW, Monks AP, Scudiero DA, Sausville EA, Zaharevitz DW, Bunow B, Viswanadhan VN, Johnson GS, Wittes RE, Paull KD. An information-intensive approach to the molecular pharmacology of cancer. Science 1997 ; 275 : 343-9.