Présentation générale des mécanismes de réparation de l’ADN

ARTICLE

bdc.2011.1323

Auteur(s) : Philippe Pourquier, Jacques Robert robert@bergonie.org

Institut Bergonié, Université de Bordeaux, Inserm U916, 229, cours de l’Argonne, 33076 Bordeaux cedex, France

Tirés à part : J. Robert

L’ADN néosynthétisé peut comporter des erreurs, malgré les fonctions d’édition de l’ADN polymérase chargée de la réplication. Il peut également subir des agressions par de nombreux agents physiques et chimiques : radiations ultraviolettes ou ionisantes, chaleur, composés mutagènes, radicaux oxygénés, etc. De nombreux mécanismes de réparation doivent intervenir pour restaurer la structure de l’ADN, chacun étant destiné à réparer des lésions précises, sur la base de la complémentarité des deux brins de l’ADN. L’impossibilité de réparer des lésions de l’ADN conduit normalement à la mort cellulaire ; le fait de tolérer des lésions caractérise l’instabilité génomique des cellules cancéreuses et participe aux mécanismes de l’oncogenèse : ces lésions peuvent procurer un avantage adaptatif dont les cellules cancéreuses vont tirer parti pour proliférer et disséminer dans l’organisme.

Les lésions de l’ADN

Les lésions de l’ADN sont généralement classées en deux catégories selon leur origine [1-3] (figure 1).

Lésions d’origine endogène :

• – sites abasiques dont la formation résulte le plus souvent de la rupture spontanée de la liaison glycosidique entre la base et le désoxyribose ;
• – modifications oxydatives des bases, qui aboutissent par exemple à la 8-oxoguanine ;
• – désaminations de bases qui entraînent une altération de l’information codante ;
• – mésappariements (mismatch) résultant d’erreurs non corrigées de l’ADN polymérase ;
• – méthylations accidentelles de bases, aboutissant par exemple à la N⁷-méthylguanine ou la N³-méthyladénine ;

Lésions d’origine exogène :

• – dimères de pyrimidines ou de purines, obtenus par liaison covalente entre deux bases adjacentes et provoqués surtout par les radiations ultraviolettes ;
• – adduits d’hydrocarbures aromatiques polycycliques comme le benzopyrène, attaquant les régions riches en électrons des bases azotées ;
• – adduits d’autres composés électrophiles attaquant préférentiellement l’azote 7 de la guanine et ses substituants aminé en 2 et oxygéné en 6 ; certains de ces composés sont des agents anticancéreux (alkylants et platines) ;
• – coupures double brin résultant de l’action des radiations ionisantes ou de l’action des topoisomérases et qui sont stabilisées par certains agents anticancéreux.

Les mécanismes de réparation de l’ADN

Chaque type de lésion peut être pris en charge par un mécanisme de réparation spécialisé. Le (tableau 1) résume les différents mécanismes et leur mise en jeu vis-à-vis des différents types de lésion. La première étape de toute réparation est la reconnaissance de la lésion et de son caractère létal ou non ; cette reconnaissance est généralement suivie d’un arrêt du cycle cellulaire permettant soit la mise en œuvre du mécanisme de réparation approprié, soit la mise en œuvre d’un programme de mort cellulaire si les lésions ne peuvent être réparées correctement. Il peut exister par ailleurs une forme de tolérance des lésions, qui permet aux ADN polymérases de poursuivre la réplication sans réparer l’erreur ; ce phénomène porte le nom de synthèse translésionnelle (translesion synthesis [TLS]).

Tableau 1 Principales lésions de l’ADN et mécanismes de réparation associés.

Réparation par réversion directe (figure 2)

Ce mécanisme concerne la réparation des adduits alkylés formés au niveau de l’O⁶ de la guanine par des agents génotoxiques et par certains agents anticancéreux comme les nitrosourées ou le témozolomide [4]. Cette réparation met en jeu une enzyme, la méthylguanine méthyltransférase (MGMT), qui prend en charge le groupement alkyle sur le groupement thiol d’une cystéine. C’est une enzyme-suicide, qui ne peut ensuite être détoxiquée et ne peut donc servir que pour la réparation d’une seule lésion : ce mécanisme est ainsi dépendant de la disponibilité en MGMT, donc de son taux de transcription et de traduction. Le promoteur de son gène est sujet à la méthylation de ses îlots CpG qui gouverne ainsi son niveau d’expression. Ce niveau d’expression est très variable d’un tissu à l’autre et les tumeurs ont été définies comme présentant le phénotype Mer⁺ ou Mer⁻ en fonction du degré d’expression de la MGMT. La mesure de l’expression de la MGMT et/ou de la méthylation du promoteur peut constituer un outil de prédiction de l’activité du témozolomide dans les glioblastomes. Un agent susceptible de contrecarrer l’activité de la MGMT est l’O⁶-benzylguanine qui peut lui servir de leurre en la détournant des sites alkylés de l’ADN. D’autres dérivés de l’O⁶-benzylguanine sont en développement.

Réparation des mésappariements (mismatch repair, [MMR]) (figure 3)

Ce mécanisme vise à corriger les erreurs commises lors de la synthèse de l’ADN par les polymérases δ et ε, erreurs non corrigées par son activité d’édition, et dont la fréquence est estimée à environ 10⁻¹⁰ [5, 6]. Des hétérodimères formés par les protéines MSH2 et MSH6, ou MSH2 et MSH3 (MSH : MutS homolog 2) pour de très courtes insertions et délétions, sont capables de reconnaître ces lésions et de recruter des protéines spécialisées dans leur réparation, MutL homolog 1 (MLH1) et PMS2 (postmeiotic segregation increased), formant un tétramère avec les précédentes. Le complexe glisse à distance du mésappariement, puis hydrolyse le brin portant l’erreur sur quelques dizaines de nucléotides en aval, pendant que l’autre brin est protégé des exonucléases par la protéine replication protein A1 (RPA). Une nouvelle synthèse de l’ADN est réalisée par une ADN polymérase et la continuité du brin restaurée par une ligase.

Ce mécanisme de réparation est déficient dans certains cancers qui présentent alors le phénotype d’instabilité microsatellitaire, caractérisé par le fait que les répétitions de dinucléotides caractéristiques de certains microsatellites, difficiles à reproduire à l’identique lors de la réplication de l’ADN, demeurent altérées en absence de MMR fonctionnel. Ce phénomène survient en particulier dans certaines formes des cancers du côlon et de l’ovaire qui présentent un ensemble de caractères phénotypiques particuliers. Il peut être en cause dans les cancers sporadiques lorsque les mutations des gènes MLH et MSH surviennent dans une cellule somatique et dans les cancers associés à une prédisposition héréditaire lorsqu’elles surviennent dans la lignée germinale d’un individu.

Réparation par excision de base (base excision repair, [BER]) (figure 4)

Ce mécanisme vise le plus souvent à remplacer les bases azotées altérées par un processus oxydatif endogène. Des ADN glycosylases, dont la nature varie selon la base endommagée, sont capables d’hydrolyser la liaison N-osidique liant la base au désoxyribose et d’éliminer cette base, créant ainsi un site abasique. Ce site est reconnu par une endonucléase apurinic-apyriminidic endonuclease 1 (APE1) qui hydrolyse la liaison phosphodiester et génère ainsi une coupure simple brin [7, 8]. Les protéines X-ray repair cross complementation group 1 (XRCC1) et Poly(ADP) ribose polymérase 1 (PARP1) interviennent alors et recrutent une protéine polynucléotide kinase (PNK) qui phosphoryle l’extrémité 5′OH et déphosphoryle l’extrémité 3′P au niveau de la coupure, étape indispensable pour la restauration de la liaison phosphodiester par l’ADN polymérase β, parfois par une ADN polymérase θ ou λ. Le seul nucléotide manquant est remplacé dans le cas du short patch BER ; dans le cas du long patch BER, cinq à six nucléotides sont ajoutés au niveau de la lésion, ce qui provoque un chevauchement (flap) qui devra être éliminé par l’endonucléase flap endonuclease (FEN1). Dans les deux cas, une ligase doit ensuite restaurer la continuité de l’ADN.

Réparation par excision de nucléotides (nucleotide excision repair [NER]) (figure 5)

Ce mécanisme, mis en jeu principalement pour la réparation des lésions de l’ADN par les rayons UV, est mis à profit pour réparer d’autres lésions impliquant en particulier les adduits formés par certains agents alkylants et les platines, en particulier au niveau de l’azote 7 de la guanine. Le NER fait intervenir plusieurs protéines incluant les protéines XP, ainsi nommées parce que leurs mutations invalidantes dans la lignée germinale provoquent une maladie appelée xeroderma pigmentosum, caractérisée par une hypersensibilité aux rayons UV et une prédisposition héréditaire aux cancers de la peau. La reconnaissance des lésions peut se faire de deux façons [9-12] : (1) dans le cas du global genome NER (GG-NER), les lésions sont reconnues, indépendamment de leur localisation dans le génome, par un complexe protéique XPC-RAD23B ; (2) dans le cas du transcription-coupled-NER (TC-NER), seules les lésions survenant au niveau des régions transcrites de l’ADN sont prises en charge, au moment où l’ARN polymérase II doit interrompre son travail de transcription, grâce à l’intervention de protéines nommées Cockayne syndrome A et B (CSA et CSB) ; ce mécanisme est utilisé pour que les gènes transcrits soient plus rapidement réparés.

Dans les deux cas, des hélicases nommées XPD (ou ERCC2) et XPB (ou ERCC3), possédant une polarité opposée, et associées au complexe protéique de transcription appelé TFIIH, maintiennent la double hélice en position ouverte pour permettre l’accessibilité aux enzymes de réparation. La protéine XPA reconnaît et vérifie la présence de la lésion, la protéine trimérique RPA se lie à l’ADN endommagé et l’endonucléase XPG (ou ERCC5) incise le brin endommagé en 3′ de la lésion. Intervient ensuite l’endonucléase XPF (ou ERCC4), en association avec le facteur excision repair cross complementation group 1 (ERCC1), qui incise l’ADN endommagé en 5′ de la lésion, et libère un fragment simple brin de 24 à 32 nucléotides. L’ADN polymérase δ ou ε reconstitue alors la partie excisée en apportant les nucléotides complémentaires à ceux du brin non excisé servant de matrice, et une ligase restaure la continuité de l’ADN.

Le NER est sous le contrôle de p53 et les tumeurs ayant une mutation de p53 ne peuvent le mettre en jeu et il en résulte une instabilité génomique accrue. Le niveau d’expression et/ou d’activité des protéines du NER est un facteur important de sensibilité aux agents anticancéreux provoquant des lésions de l’ADN réparées par ce mécanisme, comme les dérivés du platine. La surexpression de ERCC1 est un facteur important de résistance au cisplatine des cancers du poumon non à petites cellules et certains polymorphismes altérant l’efficacité de XPD sans l’invalider sont associés à l’activité de l’oxaliplatine dans les cancers colorectaux. Le développement de molécules destinées à inhiber le système NER pour potentialiser l’activité des agents alkylants et platinants est à l’ordre du jour. Un alkylant particulier, la trabectadine ou ET-743, qui cible l’amine en 2 de la guanine, interfère notamment avec le NER : ce composé est, au contraire des agents classiques, d’autant plus actif que le niveau d’activité NER est élevé, sans doute parcequ’il stimule une activité NER futile [13]. Son association avec le cisplatine dans des cancers comme les carcinomes ovariens pourrait se révéler synergique.

Recombinaison homologue (homologous recombination repair [HRR]) (figure 6)

Ce mécanisme est mis en jeu pour réparer les coupures double brin de l’ADN, en particulier celles créées par les radiations ionisantes. Il est mis en jeu après reconnaissance des lésions par des kinases jouant un rôle de « senseur » des lésions : ataxia telangectasia mutated (ATM) et ataxia telangiectasia and Rad-3 related (ATR) [14]. Ces molécules sont susceptibles de reconnaître et de phosphoryler de nombreuses protéines : certaines sont directement impliquées dans la réparation, comme l’histone H2AX ; d’autres, comme checkpoint 1 et 2 (pour CHK1 et CHK2), sont impliquées dans l’arrêt du cycle cellulaire ; d’autres encore, comme murine double minute homolog 2 (MDM2), dans l’apoptose. La recombinaison homologue est un phénomène assez lent, car il utilise le chromosome non endommagé pour servir de matrice et assurer une réparation fidèle de l’ADN. Un complexe protéique, appelé MRN car constitué des trois protéines meiotic recombination homolog 11 (MRE11), radiation response yeast homolog 50 (RAD50) et Nijmegen breakage syndrome 1 (NBS1) ou nibrine, est activé par phosphorylation par ATM et exerce une activité 3′ exonucléasique. Une série de protéines, RAD51, XRCC2, XRCC3, breast cancer protein 1 et 2 (BRCA1, BRCA2) sont impliquées dans la resynthèse de l’ADN lésé, qui est obtenue en recopiant la séquence homologue sur la chromatide sœur. Cette resynthèse, induite à partir des extrémités 3′ de chaque brin, s’étend au-delà de la lésion et la restauration des fragments d’ADN originaux est permise par une enzyme spécifique appelée résolvase. Les mutations de BRCA1 et BRCA2 sont rencontrées dans une proportion importante de cancers du sein à prédisposition héréditaire.

Recombinaison non homologue (non-homologous end joining [NHEJ]) (figure 7)

Dans cette réparation des cassures double brin, il y a une simple réassociation des extrémités séparées par la cassure [15]. Ce processus est peu fidèle, car il peut introduire des délétions ponctuelles, mais c’est le principal mécanisme de réparation des cassures double brin chez l’homme. Les extrémités séparées sont reconnues par un complexe constitué de deux protéines, KU70 (ou XRCC6) et KU80 (ou XRCC5) et d’une autre kinase, la DNA-related protein kinase, catalytic subunit (DNAPKcs) qui active par phosphorylation une 3′ exonucléase appelée Artemis ou DNA cross-link repair (DCLRE), qui prépare les extrémités coupées avant que la ligase 4, associée à une protéine XRCC4 et à un facteur XRCC4-like factor (XLF), ne vienne raccorder les deux extrémités séparées. Les défauts du NHEJ sont probablement liés à la survenue des anomalies chromosomiques qui caractérisent les hémopathies malignes (translocations, inversions, etc.).

L’inhibition des sérine/thréonine kinases de la famille phosphatidylinositol 3-kinase-related protein kinase (PIKK) à laquelle appartiennent les kinases ATM, ATR et DNAPK, pourrait être un moyen de sensibiliser les cellules aux agents provoquant des cassures double brin de l’ADN, comme les inhibiteurs de topoisomérase II et les radiations ionisantes [16]. La wortmannine et la caféine sont des composés peu sélectifs et actifs seulement à concentration élevée ; des agents plus sélectifs et plus actifs sont en cours d’étude. L’approche par ARN interférents ou par peptides à effet dominant négatif relève encore de l’expérimentation in vitro.

Les mécanismes de tolérance des lésions de l’ADN

Les procaryotes comme les eucaryotes ont développé des mécanismes de tolérance des lésions de l’ADN, moins coÛteux en énergie que leur réparation. Ils consistent en particulier chez les mammifères en une série d’ADN polymérases translésionnelles, chacune spécialisée dans le franchissement d’un type de liaison [17] : ADN polymérase η (POLH) pour les dimères de thymine créés par les UV, ADN polymérase ι (POLI) pour les dommages oxydatifs, ADN polymérase κ (POLK) pour les adduits aromatiques, ADN polymérase θ (POLQ) pour les sites abasiques, etc., certaines étant par ailleurs utilisées pour la resynthèse de l’ADN après réparation. Ces polymérases sont fortement mutagènes et la synthèse translésionnelle est utilisée par les tumeurs pour accroître leur niveau d’instabilité génomique. Leur expression est souvent altérée dans les cancers, tantôt diminuée (altérant en conséquence la synthèse réparatrice de l’ADN) et tantôt augmentée (favorisant alors l’accumulation de mutations). Des hélicases peuvent également participer à la synthèse translésionnelle d’ADN.

Le rôle de PARP1 dans la réparation de l’ADN

La poly(ADP) ribose polymérase 1 (PARP1) est capable de se lier aux extrémités des cassures double brin de l’ADN lors de leur réparation par recombinaison ou lors de l’incision des sites abasiques par les endonucléases du BER. Cette enzyme catalyse la fixation, sur les résidus d’acide glutamique de protéines nucléaires, de polymères d’ADP-ribose provenant de l’hydrolyse du NAD⁺ qu’elle catalyse également. De nombreuses protéines ayant un rôle direct dans la réparation de l’ADN ou dans la régulation de la réponse aux dommages de l’ADN sont des substrats de l’activité de PARP1 : ATM, p53, KU70, KU80, DNAPK, XRCC1, MRE11, POLB, LIG3, TOP1, etc. La découverte du rôle de PARP1 dans la réparation de l’ADN par le système BER a conduit au développement d’inhibiteurs dans le but de potentialiser l’action des agents alkylants [18-20].

Si des inhibiteurs de PARP1 sont associés au témozolomide, le BER est inhibé et il s’ensuivra une induction de la mort cellulaire indépendante de la méthylation de la guanine sur l’oxygène 6. De la même façon, ces composés sont susceptibles de potentialiser l’action des radiations ionisantes, productrices de coupures double brin, ou des inhibiteurs de topoisomérase I, générateurs eux aussi de coupures double brin lors du passage d’une fourche de réplication sur un complexe de clivage. Une autre utilisation potentielle des inhibiteurs de PARP se situe au niveau des tumeurs ayant une déficience dans les mécanismes de réparation des coupures double brin : c’est le cas des cancers du sein ou de l’ovaire présentant une mutation invalidante des gènes BRCA1 ou BRCA2 [21].

Conflits d’intérêts: aucun.

Références

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