L ’action des inhibiteurs de RAF sur la voie MAP kinase et sur le développement des mélanomes dépend du  statut des protéines RAS et RAF

ARTICLE

Auteur(s) : Jean-Marie Darbon

La voie RAS/RAF MAP kinase joue un rôle clé dans la transmission des signaux prolifératifs générés à la surface des cellules par les facteurs de croissance. L'activation de RAS (HRAS, NRAS ou KRAS) conduit au recrutement au niveau membranaire d'un membre de la famille des kinases RAF (ARAF, BRAF ou CRAF) et à l'activation successive des kinases MEK1/2 et ERK1/2 [1]. Ce mécanisme d'activation de la voie MAP kinase pourrait mettre en jeu la formation d'hétérodimères BRAF/CRAF [2]. L'activation de cette voie de signalisation joue un rôle particulièrement important dans le développement des cancers et notamment des mélanomes où des mutations de NRAS et de BRAF sont observées avec une fréquence élevée (près de 30 % et 70 %, respectivement). La majorité des mutations BRAF consiste en une substitution Val600Glu dans la boucle activatrice de l'enzyme, conduisant à son activation constitutive et à la stimulation de la cascade MEK/ERK [3].

Une étude récente parue dans la revue Cell [4] met à jour un nouveau mécanisme d'activation de la voie MAP kinase qui revêt une importance potentielle majeure pour le ciblage thérapeutique des mélanomes. L'essentiel de cette étude est conduit sur des lignées cellulaires et met en jeu deux types d'inhibiteurs de RAF : le Sorafenib, de spécificité large (il inhibe notamment les différents membres de la famille RAF), d'une part, et le PLX4720 ou le 885-A, spécifiques de BRAF et notamment de sa version mutée BRAF-V600E, d'autre part. Comme attendu, ces différents inhibiteurs, de même que l'inhibiteur de MEK, PD184352, inhibent la voie MAP kinase dans des cellules de mélanome avec BRAF-V600E mais, de façon surprenante, seuls le Sorafenib et le PD184352 inhibent l'activation de cette voie dans des cellules de mélanome présentant une version mutée de NRAS ; les deux inhibiteurs spécifiques de BRAF induisent au contraire une suractivation de MEK/ERK dans ces cellules. L'extinction par ARN interférence de l'expression de NRAS ou de CRAF abolit cette suractivation et rétablit l'inhibition de la voie MAP kinase. Les auteurs montrent que dans les cellules avec NRAS mutée, l'activité kinase BRAF est inhibée et que le 885-A stimule l'activité CRAF. Ainsi, dans ces cellules, CRAF semble responsable de l'activation de MEK/ERK induite de façon paradoxale par les inhibiteurs de BRAF. Par immunoprécipitation croisée, les auteurs montrent que les inhibiteurs de RAF induisent l'association de CRAF et BRAF dans des cellules avec RAS mutée mais pas dans les cellules BRAF-V600E. Le rôle essentiel de RAS dans l'association de BRAF et CRAF est confirmé par le fait que cette association n'est plus observée lorsque l'on exprime dans les cellules un mutant CRAF (R89L) ou un mutant BRAF (R188L) incapables de se lier à RAS. Les auteurs rapportent aussi que dans des cellules de mélanome ne présentant de mutation ni sur RAS ni sur BRAF, l'association de BRAF et CRAF n'est observée qu'après stimulation par le facteur de croissance EGF (lequel induit l'activation de RAS et celle de la voie MAP kinase) en présence de l'inhibiteur de BRAF, 885-A. L'utilisation d'un mutant BRAF (T529N) résistant à l'action inhibitrice du 885-A (du fait d'une affinité très diminuée) suggère que l'association de BRAF et CRAF est dépendante de la liaison de l'inhibiteur à BRAF. L'expression dans les cellules d'une version inactive (« kinase-dead ») de BRAF (D594A) conduit à une association pérenne de BRAF et CRAF et à une activation constitutive de la voie MAP kinase, démontrant que l'inhibition de BRAF est requise pour l'association BRAF/CRAF. L'utilisation d'un mutant CRAF (T421N) présentant une affinité très diminuée pour les inhibiteurs kinases n'empêche pas l'association de BRAF et CRAF. Mieux, à l'instar du 885-A, le Sorafenib induit alors une sur-activation de ERK.

L'ensemble de ces résultats est compatible avec le modèle présenté sur la figure 1 : dans les cellules où RAS est activée par mutation oncogénique, BRAF est cytoplasmique et c'est l'activation de CRAF, recrutée au niveau membranaire, qui induit l'activation de la voie MAP kinase (figure 1A). L'inhibition de BRAF par les inhibiteurs spécifiques tels que le 885-A (figure 1B) induit son recrutement au niveau membranaire (par un mécanisme qui reste à préciser) et son association à CRAF lié à (et activé par) RAS. Il s'ensuit une suractivation de la voie MEK/ERK. Les inhibiteurs pan-RAF tels que le Sorafenib (figure 1C) induisent également l'association de BRAF et CRAF suite à l'inhibition de BRAF mais ils inhibent également CRAF et abolissent ainsi l'activation de la voie MAP kinase.

La mise en jeu d'un tel mécanisme d'activation de la voie MAP kinase par inhibition de BRAF est confirmée dans un modèle de souris transgénique où l'expression conditionnelle d'un mutant Kras (G12D) dans les mélanocytes ne produit qu'une hyperpigmentation de la queue de l'animal alors qu'elle induit la formation de tumeurs de type mélanome lorsqu'une version inactive de Braf (D594A) est conjointement surexprimée. Une association Braf/Craf est observée dans les cellules issues de ces tumeurs.

Une seconde étude à paraître dans la revue Nature et publiée en ligne [5] confirme l'activation de la voie MAP kinase par les inhibiteurs de RAF dans un modèle cellulaire avec KRAS mutée et BRAF sauvage. Cette activation met là encore en exergue la formation de dimères RAF et l'activation consécutive de CRAF. Comme attendu, les inhibiteurs de RAF inhibent au contraire la voie MAP kinase dans des cellules exprimant BRAF-V600E, une inhibition abolie dans ces cellules par l'expression simultanée d'une version de RAS mutée.

Ces études ont d'importantes implications potentielles sur le plan clinique. Elles suggèrent en effet que l'action antitumorale des inhibiteurs spécifiques de BRAF dépend du statut des protéines RAF et RAS. Ils seront efficients dans les tumeurs BRAF-V600E sans mutation RAS mais pas dans les tumeurs où RAS est activée, notamment celles exprimant une version oncogénique de RAS. Dans ce dernier cas, ils pourront au contraire favoriser la progression tumorale. Par ailleurs, les tumeurs BRAF-V600E sensibles pourront devenir résistantes à l'action de ces inhibiteurs si une mutation RAS se produit au cours du traitement. Dans toutes les tumeurs où RAS est activée, l'utilisation d'inhibiteurs pan-RAF ou, mieux, d'inhibiteurs spécifiques de CRAF ou de MEK, est donc souhaitable.

Références

2 Weber CK, Slupsky JR, Kalmes HA, Rapp UR. Active Ras induces heterodimerization of cRaf and BRaf. Cancer Res 2001 ; 61 : 3595-8.

3 Gray-Schopfer V, Wellbrock C, Marais R. Melanoma biology and new targeted therapy. Nature 2007 ; 445 : 851-7.

4 Heidorn SJ, Milagre C, Whittaker S, Nourry A, Niculescu-Duvas I, Dhomen N, et al. Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF. Cell 2010 ; 140 : 209-21.

5 Poulikakos PI, Zhang C, Bollag G, Shokat KM, Rosen N. RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF. Nature 2010 Feb 23. [Epub ahead of print].