Protéomique et cancer du sein : à la recherche de nouveaux biomarqueurs diagnostiques et théragnostiques

ARTICLE

Auteur(s) : Marine Gilabert^1,2, Stéphane Audebert², Patrice Viens^1,3, Jean-Paul Borg^2,4, François Bertucci^1,3,4, Anthony Gonçalves^1,2,4

¹Institut Paoli-calmettes, Centre de recherche en cancérologie de Marseille, U891 Inserm, oncologie médicale, Marseille, France
²Institut Paoli-Calmettes, Centre de recherche en cancérologie de Marseille, U891 Inserm, Pharmacologie moléculaire, Marseille, France
³Université de la Méditerranée, Marseille, France
⁴Institut Paoli-Calmettes, Centre de recherche en cancérologie de Marseille, U891 Inserm, oncologie moléculaire, Marseille, France

Article reçu le 17 Octobre 2009, accepté le 1 Février 2010

Introduction

À l’heure actuelle, l’un des objectifs majeur en oncologie médicale est de s’éloigner d’une prise en charge et de décisions fondées sur des données de population, pour se rapprocher d’une médecine personnalisée (« traitement à la carte »). C’est ainsi que les caractéristiques moléculaires et physiopathologiques d’un individu et de sa tumeur doivent être pris en compte de façon concomitante pour pouvoir adapter des thérapies spécifiques aux différents profils individuels. Un autre objectif majeur est d’introduire progressivement des thérapies ciblées visant spécifiquement les cellules cancéreuses. Les efforts futurs devraient donc s’attacher à caractériser toute l’hétérogénéité d’un cancer présent chez un individu en utilisant de nouveaux outils diagnostiques et théragnostiques. Un outil theragnostique se définit comme un critère diagnostique permettant de mieux guider le traitement, par exemple en prédisant l’évolution ou l’agressivité d’une maladie et/ou la nature de la réponse thérapeutique, c’est-à-dire l’efficacité du traitement et/ou sa toxicité.

Aujourd’hui, les techniques de biologie moléculaire de haut débit permettent aux investigateurs d’interroger le génome, le transcriptome ou le protéome des cellules cancéreuses. Les applications cliniques potentielles sont importantes, celles-ci étant basées sur l’utilisation combinée de plusieurs marqueurs moléculaires, ou « signature moléculaire », manifestement plus sensible et plus spécifique en terme de prédiction qu’un seul marqueur moléculaire. Cette méthode d’analyse combinée de différents marqueurs moléculaires, géniques, transcriptomiques ou protéiques pourrait permettre tout d’abord une meilleure sélection des patients à traiter, mais surtout une analyse plus fine du diagnostic, du pronostic, et de la prédiction de la réponse thérapeutique, ainsi que l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques.

Au sein des stratégies en « omique », la protéomique représente une des dernières technologies dont le développement est croissant. En effet, parallèlement aux études ayant pour but d’identifier les modifications transcriptionnelles, les approches protéomiques permettent d’évaluer l’expression des gènes par l’analyse comparative des différentes protéines présentes dans un tissu sain et/ou pathologique. Elles offrent l’opportunité de mieux comprendre la grande complexité du protéome tumoral, en complémentant les études réalisées en génomique, l’ARNm et les transcrits n’étant pas toujours parfaitement corrélés à l’expression protéique [1-4]. La complexité de l’étude du protéome est sous-tendue par la présence de modifications post-transcriptionnelles et post-traductionnelles comme les phosphorylations, acétylations, glycosylations ou clivages protéiques [5], non détectables au niveau ARNm mais jouant un rôle déterminant dans la fonctionnalité protéique. Enfin, les protéines représentent des cibles thérapeutiques relevantes et plus accessibles que les acides nucléiques.

Les techniques de protéomique doivent être distinguées entre elles en fonction de l’utilisation ou non de la spectrométrie de masse (SM) (tableau 1). Les approches sans spectrométrie de masse correspondent aux approches en microarrays. Ces approches nécessitent une hypothèse « a priori » et donc une sélection préalable des protéines à tester. À l’inverse, les approches utilisant la SM sont « sans a priori », c’est-à-dire qu’elles ne présupposent pas une connaissance biologique initiale, permettant ainsi l’observation et la quantification d’un large nombre de protéines ou de peptides initialement inconnus, parmi lesquels peuvent être mis en évidence de nouveaux biomarqueurs protéiques relevants pour un phénotype tumoral donné. Les 2 approches ont en commun la possibilité de développer des « signatures multiprotéiques ». Dans cet article, nous passerons en revue les différentes méthodes de protéomique appliquées à des échantillons cliniques de cancer du sein, à visée diagnostique et pronostique. Ces études concernent des tissus tumoraux mais aussi des fluides biologiques incluant sérum, plasma, liquides d’aspiration mammaire ou lavages ducto-alvéolaires.

Tableau 1 Outils de protéomique clinique et recherche de biomarqueurs.

Les approches non basées sur la spectrométrie de masse

Ces dernières années, se sont développées des techniques d’analyse protéique à haut débit, basées sur l’utilisation d’anticorps : les tissues microarrays (TMA) et les protein-arrays.

TMA et IHC

Les avantages de l’IHC sur TMA sont multiples par rapport à l’approche traditionnelle sur lames standards : gain de temps (une fois que le TMA a été construit) puisque tous les échantillons sont analysés en une seule expérience, gain de réactifs rendant l’approche plus économique, et surtout gain de reproductibilité des résultats à travers toute la série puisque tous les échantillons sont testés dans les mêmes conditions, facilitant les comparaisons. Le TMA permet d’augmenter très nettement le nombre de tests réalisables sur une tumeur donnée. Le matériel nécessaire est relativement simple. Le petit format du TMA facilite aussi l’archivage du matériel tissulaire, ainsi que le partage des lames à travers plusieurs institutions. La principale critique du TMA concerne la représentativité d’une carotte tissulaire de 600 μm pour une tumeur potentiellement hétérogène. En fait, la concordance entre lame standard et TMA devient excellente [3, 7, 11, 12] lorsque les prélèvements intéressent pour chaque tumeur 2 à 3 carottes soigneusement sélectionnées au préalable par l’anatomopathologiste. Les autres critiques concernent l’IHC : la subjectivité et le manque de reproductibilité de la lecture manuelle, son caractère qualitatif ou semi quantitatif, la disponibilité inconstante d’anticorps de qualité suffisante pour l’analyse sur paraffine, et enfin le manque de standardisation. Dans le futur, la diffusion et l’amélioration des techniques permettront de minimiser ces limites. Par exemple, l’analyse automatisée des TMAs s’est développée, permettant des résultats plus rapides et reproductibles, mais surtout plus objectifs et sur un mode quantitatif [13-16]. Des logiciels de quantification sont disponibles dans le commerce [17].

En 2009, le TMA reste de loin la technique de protéomique la plus utilisée en cancérologie. Depuis la première publication en 1998, le cancer du sein a été l’un des cancers les plus analysés. La plupart des études se sont focalisées sur la pertinence diagnostique ou pronostique individuelle d’un ou de quelques marqueurs biologiques sur de grandes séries, tandis que seulement quelques études ont cherché à définir, à partir de l’analyse de plusieurs dizaines de protéines d’intérêt, une signature multiprotéique. Nous présentons dans les paragraphes suivants quelques-unes de ces études.

L’IHC sur TMA a été utilisée pour mieux caractériser des classes connues du cancer du sein à travers plusieurs types de classification. C’est le cas des formes héréditaires associées aux mutations des gènes BRCA1 et BRCA2. Hedenfalk et al. [18] ont validé sur un TMA (incluant 23 tumeurs BRCA1-mutées et 17 tumeurs BRCA2-mutées) la surexpression de cycline D1 qu’ils avaient décelée sur puces à ADN au préalable comme associée aux formes BRCA2-mutées. Palacios et al. [19] ont analysé sur TMA l’expression de 37 protéines d’intérêt dans 20 tumeurs BRCA1, 14 tumeurs BRCA2 et 59 tumeurs sporadiques. Les cas liés à BRCA1 et à BRCA2 étaient différents quant à l’expression des récepteurs hormonaux, des protéines du cycle cellulaire et de l’apoptose et des marqueurs cellulaires basaux. La différence la plus éloquente concernait l’expression de protéines du cycle cellulaire avec la surexpression des cyclines D et de leur régulateur (CDK4) dans les formes BRCA2-mutées par rapport aux formes liées à BRCA1. La plupart des tumeurs BRCA1 étaient négatives pour RE et Erbb2, hautement proliférantes et présentaient un phénotype basal. Inversement, une équipe canadienne a montré par IHC sur TMA (64 cas mutés BRCA2 et 185 cas contrôles) que les formes liées à BRCA2 étaient souvent positives pour RE et présentaient un profil luminal [20].

D’autres études se sont portées sur la classification histologique, notamment un type histologique rare et encore énigmatique du cancer du sein, l’adénocarcinome médullaire. Malgré des critères morpho-cliniques d’agressivité, il est associé à un pronostic favorable. Le diagnostic du cancer médullaire typique est parfois difficile. L’expression de 18 protéines (marqueurs de type cellulaire, protéines de prolifération et de différentiation, oncogènes et gènes suppresseurs de tumeurs) a été étudiée dans 61 cancers médullaires typiques et 300 tumeurs non médullaires de grade III [21]. Les carcinomes médullaires étaient caractérisés par un haut degré de différentiation basale/myoépithéliale en accord avec ce qui avait été rapporté sur puces à ADN. Une analyse multivariée par régression logistique montrait que les cancers médullaires étaient définis de manière optimale par une haute expression de P-cadhérine et Ki67, une négativité de erbB2, et une positivité de p53.

Le TMA a également été utilisé pour comparer l’expression de protéines d’intérêt à travers différents stades de progression du cancer du sein, du tissu normal au tissu métastatique. C’est par exemple le cas de la protéine multifonctionnelle 14-3-3σ dont la sous expression a été retrouvée, sur une série de 65 cancers du sein représentés sur un TMA, moins fréquente qu’on ne le pensait [22]. Une autre étude a été réalisée sur un TMA « progression du cancer du sein » incluant 196 tumeurs sans envahissement ganglionnaire (N-), 196 tumeurs avec envahissement ganglionnaire (N+) et 3 ganglions métastatiques de chaque tumeur N+.

Les auteurs ont rapporté une excellente concordance du statut erbB2 entre tumeur initiale et métastases ganglionnaires [23].

Des études comparant cancers du sein inflammatoires versus non inflammatoires ont été réalisées en IHC sur TMA. L’équipe de P. Vermeulen a ainsi validé la surexpression de Ecadherine et RhoC GTPase dans 34 cancers du sein inflammatoires comparativement à 41 cas non inflammatoires [24]. Dans la seconde étude, nous avons analysé l’expression de huit protéines (RE, RP, E-cadherine, EGFR, ErbB2, Muc 1, MIB1 et p53) dans 80 IBCs et dans 552 NIBCs [25]. Ces huit protéines étaient différentiellement exprimées entre les formes inflammatoires et non inflammatoires. En analyse multivariée, les tumeurs inflammatoires étaient caractérisées par la combinaison suivante : expression élevée d’E-cadherine, RE négatif, MIB1 positif, erbB2 positif et marquage cytoplasmique de MUC1. Ainsi, la probabilité pour une tumeur d’être inflammatoire était de 91% lorsque la signature était complète, mais moins de 50% quand seulement 3 ou moins de ces paramètres étaient présents.

D’autres études se sont intéressées aux sous-types moléculaires du cancer du sein initialement révélés par analyse transcriptionnelle sur puces à ADN : luminal A et B, basal, erbB2+ et normal-like [26, 27]. Ces sous-types ont d’abord été confirmés au niveau protéique par classification hiérarchique de données d’IHC obtenues en TMA sur des jeux de 7 à 31 protéines dans des séries d’échantillons de 97 à 1 944 patients [28-33]. Les protéines testées incluaient toujours RE, RP, erbb2 et P53, et très souvent des cytokératines basales et/ou luminales, ainsi que des marqueurs de prolifération. La recherche d’une définition protéique plus performante que la définition triple-négative des tumeurs basales a été faite sur TMA. Dans une première publication [34], Nielsen et al. ont collecté 21 tumeurs définies comme basales à l’aide du profil génomique, et ont mesuré l’expression de 5 protéines d’intérêt (RE, erbB2, EGFR, CK5/6 et Kit) . Le profil RE-, erbB2-, CK5/6+, et/ou EGFR+ offrait une sensibilité de 76 % et une spécificité de 100 % pour identifier les tumeurs basales, et permettait bien d’identifier un groupe de mauvais pronostic à travers une série de 930 cancers du sein déposés sur un TMA. Ce profil a été récemment amélioré avec l’introduction du statut RP- à travers l’analyse d’une série de 4 046 cas représentés en TMA [35]. A coté de ces études cherchant à mieux caractériser des classes et des sous-types pertinents de la maladie, d’autres études se sont basées sur le TMA pour valider et/ou identifier des marqueurs protéiques pronostiques. La plupart d’entre elles ont testé une protéine unique de pertinence connue ou suspectée. Les exemples sont nombreux dans la littérature. Parmi les protéines dont l’expression est associée à un pronostic défavorable, citons par exemple HER2/neu testée dans 359 tumeurs N- [36], COX2 testée dans 1 576 tumeurs [37], la sous-unité catalytique des télomérases (TERT) testée dans 611 tumeurs [38], ou la molécule d’adhésion cellulaire Ep- CAM dans 1 715 tumeurs [39]. À l’inverse, les protéines dont l’expression a été démontrée sur TMA comme associée à un pronostic favorable incluent FHIT [40], STAT5 [41], BCL2 [42], ou Tau, protéine associée au microtubule, testée dans 1 942 tumeurs provenant de l’essai NSABP-28 [43]. Le TMA a aussi permis de valider sur de grandes séries les résultats obtenus en génomique sur puces à ADN. C’est le cas par exemple de deux facteurs de transcription, GATA3 et FOXA1, fortement représentatifs du sous-type luminal A, et dont l’expression protéique était associée à un pronostic favorable sur plusieurs centaines de tumeurs analysées par TMA [31, 44-46]. De même, l’impact pronostique défavorable de protéines codées par des gènes surexprimés dans le sous-type basal a été confirmé en IHC sur TMA ; citons par exemple la protéine de choc thermique CRYAB [47], l’annexine A8 [48], et la protéine S100A9 [49].

L’identification d’une signature « multiprotéique » sur la base d’analyses supervisées similaires à celles réalisées sur puces à ADN n’a été entreprise que très rarement. Nous avons mesuré l’expression (IHC) de 26 protéines sélectionnées dans plus de 1 600 échantillons tumoraux provenant de 552 cancers du sein localisés [31-51]. Par une analyse supervisée appliquée à des données qualitatives d’IHC, nous avons identifié dans un jeu d’apprentissage de 368 tumeurs, puis validé dans un jeu de validation indépendant de 184 tumeurs une signature de 21 protéines dont l’expression combinée présentait un rôle pronostique fort et indépendant. Cette signature conservait son impact pronostique dans divers sous-groupes de patientes définis selon le statut RE et ganglionnaire axillaire, ou selon le traitement systémique adjuvant reçu. Le point important est que la combinaison des 21 protéines était le meilleur prédicteur de survie, nettement supérieur à chaque protéine prise isolément. L’intérêt pronostique de combiner plusieurs marqueurs protéiques dans le cancer du sein a été confirmé dans trois autres études sur TMA [31-52].

Protein arrays

L’approche « antibody microarrays » ou « puce à anticorps » est une des techniques les plus développées. Les sondes protéiques sont des anticorps spécifiques déposés et fixés à la surface d’une matrice solide. Les échantillons protéiques à analyser sont directement marqués par un fluorochrome ou indirectement marqués par un « tag » qui sera secondairement reconnu par un deuxième anticorps marqué (figure 1). De façon alternative, la détection peut se faire par une nouvelle incubation de l’array avec un second anticorps spécifique qui va reconnaître la même protéine que l’anticorps fixé sur la matrice, mais sur un épitope différent.

Cet anticorps secondaire est lui-même lié à un système de détection. Cette méthode dite « méthode sandwich » augmente la spécificité et la sensibilité du test. Les limites de ces approches sont essentiellement la disponibilité des anticorps et l’espace disponible sur l’array. Dans le domaine du cancer du sein, des antibody arrays ont été utilisés sur différents échantillons cliniques, tels que le sérum ou le tissu tumoral lui même. Par exemple, Hudelist et al. ont comparé par cette technique le niveau d’expression de 378 protéines dans le tissu mammaire normal et tumoral issus d’une même patiente [54]. Les différences mises en évidence ont été confirmées par immunohistochimie, suggérant la fiabilité de la technique. Celis et al. ont étudié les cellules adipeuses et le liquide interstitiel provenant du tissu graisseux prélevé à distance de tumeurs à haut risque chez des patientes ayant subi une mastectomie [55]. Ils ont incubé les lysats protéiques correspondants avec le Panorama Ab Microarray Cell Signaling array (Sigma-Aldrich, MO, USA), qui contient 224 anticorps différents, et ont aussi examiné l’expression de multiples cytokines en utilisant la technique « sandwich ». Ils ont ainsi identifié un bon nombre de protéines potentiellement impliquées dans la régulation du microenvironnement tumoral des cancers du sein.

L’expression de cytokines a également été étudiée en utilisant des antibody arrays spécifiques dans des modèles de lignées cellulaires, mais aussi dans les sérums et les tissus tumoraux issus de patientes atteintes de cancer du sein [55, 56]. De cette façon, on a pu suggéré par exemple que l’expression de l’IL8 était associée au statut hormonal (récepteur aux œstrogènes) et au potentiel métastatique des cellules cancéreuses [57]. Plus récemment, le Human Cytokine array III (RayBiotech, Inc, GA, USA), qui peut détecter simultanément 42 cytokines et facteurs de croissance, a été utilisé pour étudier une « signature de cytokines » sérique induite par le statut HER2 dans les cancers du sein [58]. Les antibody arrays peuvent aussi apporter des informations sur les modifications post-traductionnelles de protéines cibles. Par exemple, l’anticorps secondaire en technique sandwich peut cibler soit les protéines totales d’un échantillon, soit les formes actives tyrosines phosphorylées. Cela a été appliqué à des lysats de cancer du sein afin d’évaluer l’activation des récepteurs erbB après fixation d’un ligand et la perturbation de cette activité après fixation d’un inhibiteur spécifique de ces ligands [59]. Parallèlement à ces antibody arrays, des systèmes similaires sur billes sont en cours de développement. Dans le système Luminex (TX, USA), des billes distinctes recouvertes d’anticorps spécifiques dirigés contre différentes cytokines sont mis en présence d’un échantillon protéique. Le mélange est ensuite incubé avec un mélange d’anticorps secondaires similaires aux anticorps de capture. Ces anticorps sont eux-mêmes fluorescents. Les billes sont passées en cytométrie de flux et chaque bille est traitée par deux lasers : l’un pour l’identité de la bille et l’autre pour la quantité de l’anticorps [60]. Des applications récentes dans le cadre du cancer du sein incluent l’étude du profil des cytokines de sérums, dans l’espoir de distinguer des patientes atteintes d’un cancer du sein versus des patientes saines, des patientes N- versus N+, et d’identifier « une signature de cytokines » corrélée au statut HER2 [61].

Il existe une approche complémentaire aux antibody arrays représentée par la technologie « reverse phase protein microarray » (RPPM) où les échantillons protéiques à tester sont déposés de manière automatisée sur des surfaces spécifiques, puis mis en présence d’anticorps spécifiques des protéines à identifier, puis incubés avec des anticorps secondaires marqués et analysés par un système de détection/amplification [62]. Cette méthode, tout comme le TMA, permet l’analyse de plusieurs échantillons en même temps lors d’une seule expérience, mais est limitée par le nombre d’anticorps que l’on peut utiliser. Un avantage est de pouvoir analyser de façon presque complète des voies de signalisation intracellulaire importantes. Par exemple, des anticorps phosphospécifiques peuvent analyser l’état d’activation de protéines de signalisation intracellulaire et établir une corrélation entre ces états d’activation et le statut clinique et/ou pathologique des échantillons [63]. En dépit de leurs résultats prometteurs, l’application large de ces techniques de type arrays reste encore limitée, en partie du fait du coût des anticorps, mais aussi de leurs limites en terme de spécificité.

Les approches fondées sur la SM

• – l’identification formelle et éventuellement la quantification des protéines obtenues ;
• – le « profiling protéique », c’est dire la recherche d’une signature multiprotéique corrélant avec un phénotype donné.

Bien que ces approches soient encore confrontées à des obstacles significatifs, tels que l’accès au protéome minoritaire ou encore la reproductibilité dans un contexte de haut débit et/ou multicentrique, elles présentent l’avantage majeur de ne pas nécessiter de présupposés biologiques « a priori ».

Séparation et identification de protéines par SM

Un grand nombre d’approches basées sur la 2DGE ont été développées dans des modèles pré-cliniques de cancer du sein, mais peu de données ont été générées à partir d’échantillons cliniques. Quelques études ont porté sur des carcinomes in situ ou des tumeurs invasives comparés à des tissus normaux ou des tumeurs bénignes [68-77]. D’autres études ont utilisé des fluides biologiques incluant du sérum ou des épanchements séreux [78, 79]. Récemment, deux études ont utilisé la 2DGE pour réaliser un profil protéique à partir de lysats protéiques obtenus sur des échantillons de tumeurs mammaires. Bloom et al. ont analysé 77 adénocarcinomes primitifs d’origines différentes, incluant 9 cancers du sein, mais aussi des cancers du colon, de l’ovaire, de l’estomac, du rein et du poumon [80]. Quelques spots protéiques ont été identifiés comme spécifiques d’un type tumoral particulier ; 69 d’entre eux ont été identifiés par MS/MS, permettant de construire un algorithme discriminant les différents tumeurs primitives entre elles. Nimeus et al. [81], ont testé la capacité de la 2DGE à identifier des protéines différentiellement en fonction de la rechute tumorale à distance et en fonction de l’expression des récepteurs hormonaux (RH), chez 20 patients avec envahissement ganglionnaire axillaire (N+) recevant une chimiothérapie adjuvante de type cyclophosphamide, méthotrexate et 5FU. Plusieurs protéines permettaient de distinguer le groupe « rechute » du groupe « pas de rechute », spécialement dans le sous-groupe RH+. Les limites de cette technique 2DGE restent l’analyse des protéines de PH ou de poids moléculaire extrêmes, de faible solubilité ou encore présentes à un faible niveau d’abondance. Mais, le plus gros inconvénient reste le manque de reproductibilité entre chaque technique, ce qui constitue un défi dans l’amélioration future de ces techniques. Pour augmenter la rapidité, la sensibilité et la reproductibilité de la 2DGE conventionnelle, la technique de 2D-DIGE (differential gel electrophoresis) a été développée [82]. Ici, les extraits protéiques sont marqués au préalable par des fluorochromes (cyanines : Cy2, Cy3 ou Cy5 par exemple). Typiquement, l’échantillon test est marqué par Cy3, tandis que l’échantillon de référence est marqué par Cy5. Des concentrations identiques des 2 échantillons à comparer sont alors mélangées et séparées simultanément par la même 2DGE. Le pattern 2D est alors visualisé en scannant le gel avec deux longueurs d’ondes spécifiques (l’une pour Cy3, l’autre pour Cy5) grâce à un imageur à fluorescence. La comparaison des images générées permet la quantification de chaque spot. La 2D DIGE élimine ou réduit de façon drastique la variabilité inter-gel associée à la technique 2DGE standard et améliore la précision de l’analyse quantitative, permettant d’envisager son utilisation à haut débit d’échantillons (figure 2).

Une autre méthode de séparation protéique n’impliquant pas de gel utilise les techniques de chromatographie liquide (LC) où les peptides en phase liquide sont retenus puis élués en fonction de leurs propriétés physico-chimiques à l’aide de colonnes chromatographiques spécifiques [64]. Une combinaison de techniques de chromatographie liquide à haute performance HPLC et de MALDI-MS nommée « differential peptide dysplay » a été utilisée pour étudier les peptides générés à partir de cancers du sein invasifs exprimant (RE + ; n = 39) ou non (RE- ; n = 41) des récepteurs aux oestrogènes [83]. Les données spectrométriques étaient corrélées au statut hormonal, conduisant à l’identification de protéines d’expression différente en fonction du statut RE. La LC peut comporter plusieurs séparations chromatographiques séquentielles, comme dans le cadre de la technologie MudPIT (multidimensional protein identification technology) [84]. Deux étapes de HPLC (échange de cations et phase reverse) sont couplées à la MS/MS autorisant l’analyse rapide de matériel complexe et permettant l’identification des séquences peptidiques obtenues. Cette technique a récemment été utilisée pour mettre en évidence un profil d’activité enzymatique dans des tissus tumoraux humains, incluant des cancers du sein, et a généré des signatures fonctionnelles bien corrélées aux sous-types moléculaires précédemment décrits.

Un autre champ de développement très actif est celui de la protéomique quantitative. Ainsi, pour augmenter la reproductibilité et les capacités quantitatives, la LC peut être couplée au marquage préalable des échantillons, comme dans les technique ICAT (isotope coded affinity tag), SILAC (stable isotope labeling with amino acids in cell culture) et iTRAQ (isotope tagging for relative and absolute quantification). La méthode ICAT est basée sur le marquage isotopique des échantillons protéiques à comparer par des tags structuralement identiques mais de masses différentes [85], qui se fixent sur les résidus cystéines. Ces tags sont eux même liés à un groupement biotine. Les échantillons sont alors poolés et soumis à une digestion par trypsine avant la réalisation d’une HPLC puis d’une purification supplémentaire sur colonne d’avidine, précédant l’analyse en spectrométrie de masse. Les peptides résolus mais provenant de chaque échantillon diffèrent alors de quelques kDa et leur ratios d’intensité peut permettre d’évaluer très précisément leur abondance relative. Cette procédure a été utilisée pour comparer des liquides d’aspiration mamelonnaire issus de tumeurs de patientes atteintes d’un cancer du sein par rapport au sein controlatéral non tumoral, identifiant et quantifiant plusieurs protéines différentielles [86]. Dans la technique SILAC, les populations de cellules à comparer font l’objet d’un marquage assez similaire à l’ICAT, mais pendant la phase de culture cellulaire, en supplémentant le milieu de culture avec des acides aminés marqués par les isotopes d’intérêt. Cette procédure a été utilisée par exemple pour comparer deux lignées isogéniques de cancer du sein humains, qui sont également tumorigéniques chez la souris, mais qui présentent des capacités métastatiques distinctes. Après marquage en culture de type SILAC, purification membranaire puis LC-MS/MS, 13 protéines membranaires ont été identifiées comme sur-exprimées et 3 protéines membranaires comme sous-exprimées dans la lignée métastatique, avec validation en cytométrie de flux, western blot et IHC. L’expression de certaines de ces protéines (ecto-5’-nucleotidase and integrin Beta1) apparaissaient associées à un pronostic défavorable [87].

Le marquage isotopique iTRAQ permet lui d’identifier et de quantifier des protéines in vitro dans quatre conditions différentes par LC-MS/MS. Les peptides sont marqués sur leur groupement amine par les réactifs iTRAQ, qui sont de trois types :

• – groupement reporter : il diffère entre les quatre formes du réactif utilisé par sa masse (m = 114, 115, 116 et 117) ;
• – groupement « balance »: sorte de contre-poids afin qu’un peptide marqué par les réactifs iTRAQ aie la même masse d’étiquette ; sa masse varie de 28 à 31 m/z, de manière à ce que chaque marqueur soit en masse totale égale à 145 ;
• – groupement fonctionnel réactif peptide (NHS ester) qui lie de manière covalente le réactif iTRAQ isobare aux amines primaires libres du peptide, soit les fonctions amines primaires des chaînes latérales de lysine et le groupe N-Terminal d’un peptide.

Le principe de la méthode iTRAQ repose sur le marquage de peptides issus d’une digestion par la trypsine avec les réactifs ci-dessus formant un lien covalent avec les amines primaires de l’extrémité amino-terminal ou de la chaîne latérale des résidus lysine. Ces différents réactifs sont dits isobariques car ils possèdent tous une masse moléculaire de 145 Da. Lors de l’analyse en spectrométrie de masse, les peptides marqués (précurseurs) seront donc détectés avec la masse intrinsèque du peptide + 145 Da provenant du réactif iTRAQ. Ce n’est qu’à l’étape de fragmentation du peptide (MS/MS) que l’on pourra apprécier la contribution de chacun des quatre peptides qui se traduira par la libération d’ions (fragments) ayant des masses de 114, 115, 116 ou 117 Da. C’est l’intégration de l’aire sous la courbe des pics émanant de ces ions rapporteurs qui permet l’analyse de quantification relative puisqu’un ratio des valeurs d’intégration peut-être calculé pour chaque peptide détecté [88]. Cette procédure a été appliquée avec succès dans plusieurs études protéomiques, étudiant notamment les modifications du phosphoprotéome dans le cadre de l’oncogenèse mammaire [89]. Récemment, la technique iTRAQ a été utilisée pour comparer des échantillons protéiques issus de 3 cancers du sein humain, avec un phénotype métastatique distinct. L’identification reproductible de 605 protéines non redondantes a été possible. Une comparaison quantitative a ainsi identifié plusieurs protéines différentiellement exprimées selon l’évolution métastatique ou non et l’atteinte ganglionnaire axillaire, confirmées en qRT-PCR [90].

Le développement des différentes techniques de protéomique quantitative a clairement le potentiel pour révolutionner l’application des approches de spectrométrie de masse aux échantillons cliniques, dans le but d’identifier de façon plus fiable et plus reproductible des biomarqueurs protéiques d’intérêt.

Récemment, on a pu observer d’importants progrès dans les performances des SM, essentiellement dus aux progrès des technologies instrumentales avec les trappes ioniques [91], les analyseurs Q-TOF, ou encore les SM à transformée de Fourier [92]. Toutes ces améliorations prédisent un accroissement très probable de la découverte de nouveaux biomarqueurs protéiques. Par exemple, ces dernières techniques peuvent permettre l’analyse complète de protéines entières (« top-down » protéomique) sans nécessité préalable de digérer l’échantillon par une enzyme protéolytique. Cependant, la majeure partie de ces progrès concerne la résolution et la sensibilité des analyseurs, tandis que les procédures pré-analytiques restent très lourdes, et nécessiteront d’être adaptées aux contraintes du haut débit d’échantillons.

Profiling protéique et ProteinChip®

Ces approches ont été popularisées par l’utilisation de la technologie SELDI-TOF-MS (Surface-Enhanced Laser Desorption Ionization Time Of Flight MS) [93]. Cette technique associe directement séparation protéique et présentation au SM pour analyse (Figure 3). La première étape est séparative et utilise des surfaces chromatographiques spécifiques (the ProteinChip arrays, Ciphergen Biosystems, CA, USA, et maintenant BioRad, CA, USA) : échangeuses d’anions et de cations, IMAC (immobilized metal affinity chromatography) phase reverse. Ces surfaces présentent donc différentes affinités biochimiques pour différents types de protéines, et permettent ainsi d’implémenter l’analyse de la grande diversité des protéines présentes dans un échantillon biologique donné. La combinaison de ces multiples surfaces à des approches chromatographiques sur billes préalables peut permettre la détection de jusqu’à 2 000 espèces de protéines à partir du sérum par exemple [94, 95].

Les protéines retenues sur les proteinchip sont ensuite désorbées par transfert d’énergie grâce à un faisceau laser, puis accélérées dans un champ magnétique et identifiées par SM conventionnelle basée sur le temps de vol. L’analyse d’un échantillon biologique génère ainsi un « profil », caractérisé par l’inventaire des protéines présentes où chacune est représentée par un pic caractérisé par sa masse moléculaire (m/z), et dont son abondance relative est évaluée par l’intensité du pic. Les spectres de masse obtenus sont analysés ensuite par des approches statistiques univariées et/ou multivariées et permettent d’obtenir soit un marqueur protéique unique pertinent, soit un « profil protéique » composé de multiples marqueurs. Les pics protéiques discriminants peuvent alors être purifiés et soumis aux approches d’identification basées sur la SM, telles que décrites précédemment (figure 3).

Les principales études de SM SELDI-TOF réalisées à ce jour en cancérologie ont concerné du matériel tumoral (sein, prostate, foie), mais surtout des fluides biologiques, et notamment du sérum, dans une approche essentiellement diagnostique [95-101] (tableau 2). En effet, le sérum traverse en permanence les tissus (physiologiques ou pathologiques) et peut donc être modifié quantitativement ou qualitativement en permanence par les processus rencontrés. Il constitue par conséquent un « surrogate tissue » tout à fait acceptable. Les résultats obtenus dans la recherche de biomarqueurs diagnostiques ont clairement suggéré que le sérum pouvait être modifié plus ou moins spécifiquement par un processus néoplasique donné et que ces modifications étaient détectables de façon reproductible en SELDI-TOF. La validation de ces résultats, la méthodologie utilisée, et la spécificité des protéines éventuellement identifiées dans ces approches restent cependant controversées [102]. En effet, malgré l’excellente sensibilité de la technique, la présence de protéines non spécifiques très abondantes dans des échantillons de type sérum ou plasma peut gêner considérablement la détection de protéines spécifiquement tumorales au profit de protéines de la réponse de l’hôte. De plus nombre d’études réalisées initialement, n’ont pas été validées ultérieurement, et pour certaines ont fait l’objet de malfaçons dans l’analyse statistique des résultats, limitant l’enthousiasme initial.

Cependant, bien que toujours controversée dans sa reproductibilité et sa capacité à détecter d‘authentiques signatures spécifiquement tumorales, l’approche SELDI a pour avantage la facilité de son utilisation à haut débit.

Dans les cancers du sein, la SM SELDI-TOF a été utilisée pour examiner sérums, plasmas et liquide d’aspiration mamelonnaire, ainsi que les tissus tumoraux, à la recherche de biomarqueurs diagnostiques. Certaines études ont identifié des protéines sériques distinguant cancer du sein et mastopathies bénignes ou sujets sains [103-106]. Incluant entre 133 et 356 patients, ces études ont suggéré des profils protéiques avec des sensibilités variant entre 76 et 96% et des spécificités variant entre 85 et 93%. Les pics protéiques à valeur diagnostique entre sujets sains et patientes atteintes de cancer du sein correspondaient à des ratios m/z à 4,3 et 8,9 kDa dans deux études indépendantes. Deux biomarqueurs potentiellement diagnostiques (8,1 et 8,9 kDa) ont été pour leur part validés sur un jeu de données indépendant [107] et identifiés par SM tandem comme un composant du complément C3a (desArg) (8,9) et sa forme tronquée en C-terminal (8,1). Une autre étude à visée diagnostique [108] a analysé 30 échantillons sériques provenant de patientes mutées pour BRCA1 qui ont développé un cancer (n = 15) ou non (n = 15). Cette approche a révélé 23 marqueurs protéiques sériques permettant la classification des patients cancéreux avec 87 % de sensibilité et de spécificité. Cette étude comparait également le profil protéique sérique de patients cancéreux sur mutation BRCA1 aux patients développant un cancer sporadique. Plusieurs protéines apparaissaient up-régulées dans les cancers BRCA1 et classaient les patients avec 94 % de sensibilité et 100 % de spécificité. Cependant, aucune identité de protéines n’était rapportée et le faible nombre de patientes étudiées ne permettait pas de validation indépendante. Dans un étude récente, le profiling SELDI a également été appliqué au plasma de patientes présentant un cancer du sein HER2+ par rapport à des patients contrôles, identifiant un jeu de 7 protéines biomarqueurs, validées ensuite sur un jeu indépendant [109]. D’autres matériels biologiques que le plasma et le sérum ont fait l’objet d’études diagnostiques : la plupart du temps, celles-ci ont comparé le liquide d’aspiration mamelonnaire (ou de lavage des canaux galactophoriques) de sujets atteints de cancer du sein à celui de sujets non cancéreux (avec quelquefois l’utilisation du sein controlatéral non pathologique comme contrôle) [110-112]. Une grande hétérogénéité des profils protéiques obtenus était notée en inter-patient, tandis que la similarité entre les liquides obtenus à partir du sein cancéreux par rapport au sein normal d’un même sujet était grande. Cependant, des pics protéiques différentiellement exprimés ont été observés entre seins cancéreux et seins normaux, certains d’entre eux corrélant avec l’atteinte ganglionnaire axillaire et l‘extension de la maladie [113].

Au delà de ces objectifs diagnostiques, l’utilisation de ces outils d’analyse protéomique à visée pronostique ou prédictive de la réponse thérapeutique s’est très récemment initiée, au niveau tissulaire et/ou sérique. Il s’agit d’une approche que l’on peut qualifier de théragnostique. Au niveau sérique, nous avons récemment décrit pour la première fois que le profil protéique sérique pouvait porter une information pronostique chez des patientes atteintes d’un cancer du sein localisé avec des facteurs de mauvais pronostic [114]. En utilisant la technologie SELDI-TOF, nous avons rétrospectivement analysé le sérum post-opératoire précoce de 81 patientes présentant un cancer du sein à haut risque avec une indication de chimiothérapie adjuvante. Les sérums, collectés après chirurgie et avant initiation de la chimiothérapie adjuvante, ont été fractionnés en combinant billes échangeuses d’anions et rétention sur des ProteinChips de différentes spécificités chromatographiques, puis analysés en spectrométrie de masse. Les protéines différentiellement exprimées en fonction de l’évolution clinique (rechute métastatique ou non) ont été combinées au sein d’un modèle de régression logistique permettant de générer un index de 40 protéines capable de prédire correctement l’évolution métastatique dans 83 % des cas et distinguant 2 groupes de patientes avec des survies sans rechute métastatique et des survies globales radicalement différentes. Cet index apparaissait en analyse multivariée comme le paramètre pronostique indépendant le plus significativement associé à la probabilité de rechute. L’identification de certaines protéines de cet index a été réalisée et celles-ci correspondent essentiellement à des protéines de la réponse de l’hôte, potentiellement impliquées dans des processus biologiques pouvant influer sur le processus métastatique, tels que la réponse immune ou le processus de néoangiogenèse. Deux autres études à visée pronostique ont également appliqué la technologie SELDI-TOF au niveau tissulaire. La première étude a analysé les extraits protéiques cytosoliques provenant de 60 cancers du sein sans envahissement ganglionnaire axillaire dont 30 avaient présenté une rechute métastatique, alors que les 30 autres étant en rémission [115]. Plusieurs protéines différentiellement exprimées entre ces 2 groupes étaient retrouvées, deux d’entre elles avec une valeur pronostique solide, secondairement identifiées par MS/MS comme l’ubiquitine (diminuée dans le groupe métastatique) et la chaîne légère de la ferritine (augmentée dans le groupe métastatique), puis confirmées en IHC et en western blot. Une seconde étude a examiné des tissus cancéreux invasifs après microdissection laser, et a suggéré deux protéines associées au risque d’envahissement ganglionnaire axillaire. De façon intéressante, l’une de ces protéines présentaient un ratio m/z de 8,5 k consistant avec celui de l’ubiquitine, dont l’intensité diminuait en cas d’envahissement ganglionnaire axillaire, de façon similaire à l’étude précédente [116]. Enfin, nous avons récemment examiné en technologie SELDI-TOF le protéome triton-soluble extrait de 27 lignées cellulaires de cancer du sein. En analyse non supervisée, par la procédure de clustering hiérarchique, il était possible de distinguer sur la base du profil protéique en SM les lignées dites « luminal-like » et les « basal-like », en référence aux sous-types moléculaires constitutifs des cancers du sein récemment décrits par l’analyse transcriptomique, et dont la relevance pronostique et thérapeutique apparaît majeure en clinique. En analyse supervisée, nous avons observé plusieurs biomarqueurs protéiques potentiels associés aux phénotypes « luminal-like » ou « basal-like », deux d’entre eux faisant l’objet d’une purification et d’une identification en SM MALDI-TOF : S100A9, augmentée dans les lignées basales, ce qui apparaissait confirmé par d’autres techniques de typage moléculaire (IHC et puces à ADN), avec un caractère pronostique défavorable démontré sur un large TMA de plus de 500 tumeurs, et l’ubiquitine tronquée sur sa portion carboxy-terminale, dont la surexpression était retrouvée dans les tumeurs « luminal-like ». Ces données illustrent les potentialités de l’approche profiling en SM pour mettre en évidence des biomarqueurs pronostiques dans le domaine protéomique clinique en oncologie [49]. Une autre approche basée sur le profiling sérique ou plasmatique comprend l’analyse des modifications des protéines circulantes induites par l’exposition à des agents anticancéreux : certains auteurs ont ainsi exploré en SM SELDI-TOF le plasma de patientes atteintes de cancer du sein et recevant une chimiothérapie pré- ou post-opératoire [117, 118].

La protéomique sérique appliquée à la décision thérapeutique peut également révéler un potentiel intéressant en situation métastatique, lorsque le matériel directement tumoral n’est pas disponible. Nous avons récemment collecté de manière prospective le sérum pré-thérapeutique provenant de 81 patientes recevant un traitement par docetaxel en première ligne thérapeutique. Les sérums ont été analysés en SELDI, permettant de résoudre 521 pics protéiques. Nous avons identifié 20 protéines significativement associées à la survie sans progression et construit un modèle de Cox avec 7 pics protéiques permettant de calculer un risque de progression pour chaque patiente. En utilisant comme cut-off le risque médian de la population, des groupes à haut et faible risque de progression ont été identifiés avec des différences drastiques en terme de PFS, validées en leave-one-out cross-validation. Dans un modèle de Cox multivarié, ce profil multiprotéique apparaissait comme le facteur pronostique indépendant le plus puissant pour cette population [119].

D’autres approches de type profiling ont été développées en protéomique clinique appliquée aux cancers du sein. Ainsi, une adaptation du concept SELDI a récemment été proposée, avec l’association de billes magnétiques à propriété chromatographiques et d’une technologie de SM MALDI-TOF (ClinProt^TM robotic platform ; Brucker Daltonics Inc ; MA, USA). Comme les surfaces des ProteinChips utilisées dans l’approche SELDI, les billes sont dotées de propriétés physico-chimiques distinctes leur permettant d’interroger et de retenir diverses fractions du protéome, avec au décours un dépôt de l’éluât obtenu sur plaque MALDI avant une analyse en SM conventionnelle. Cette approche a été récemment utilisée pour comparer patientes atteintes de cancer du sein et sujets sains avec des résultats prometteurs [120, 121].

Il faut souligner cependant pour la plupart des approches SELDI ou apparentées appliquées au cancer du sein, à l’image de nombreuses études similaires rapportées dans d’autres localisations tumorales, que peu de pics protéiques candidats au titre de biomarqueurs diagnostiques, ont été structurellement identifiés. De plus, la plupart des pics identifiés correspondaient à des protéines physiologiques de la réponse inflammatoire ou de la coagulation, non spécifiquement tumorales, qui plus est bien souvent retrouvés comme potentiellement discriminants dans d’autres pathologies, tumorales ou non. L’objectif principal de ces approches de profiling, c’est-à-dire l’identification d’acteurs spécifiques de la biologie tumorale, pour permettre une meilleure compréhension de l’oncogénèse et découvrir de nouveaux marqueurs diagnostics précoces, n’a donc pas était atteint. Il est tout à fait possible que la concentration de tels acteurs moléculaires soient en fait bien en dessous des limites de détection de la procédure, dont l’excellente sensibilité intrinsèque est très altérée dès lors que l’on travaille sur un milieu complexe tel que le sérum ou le plasma, riche en protéines de très haute abondance. Enfin, la plupart des résultats rapportés l’ont été à partir d’études incluant des populations de taille modeste, et peu ont fait l’objet d’une réelle validation sur un jeu de données indépendant, limitant la portée des conclusions tirées. C’est un point essentiel dans la mesure où le nombre de paramètres examinés excède largement le nombre d’échantillons analysés, générant inéluctablement un grand nombre de faux positifs.

Une autre stratégie permettant de générer des signatures protéiques cliniques potentiellement informatives consiste à travailler sur le matériel tumoral biopsique, avec l’analyse directe des coupes histologiques en SM MALDI-TOF. Cette technique a récemment été utilisée sur des échantillons tumoraux, essentiellement sur cancers du poumon et des tumeurs cérébrales, avec des résultats prometteurs en termes diagnostiques et pronostiques [122-124]. De plus, cette technique permet de réaliser une véritable imagerie tumorale tissulaire, en associant aux pics protéiques obtenus une intensité colorée en fonction de son abondance et une localisation spatiale. Ainsi, la variété des types cellulaires présents dans les tissus tumoraux peuvent être profilés simultanément et intégrés à l’analyse cytologique et morphologique. Le potentiel de cette approche dans les cancers du sein concerne le diagnostic histologique biopsique, l’analyse des marges de résection, ainsi que l’amélioration des algorithmes de décision pronostiques et thérapeutiques [125, 126].

Tableau 2 Principales études SELDI publiées dans le domaine du cancer du sein.

Conclusions – Perspectives

Cependant, le format exact de l’introduction des outils protéomiques à la clinique reste difficile à anticiper. Une application possible pourrait être par exemple la mise au point de puces à protéines capables de détecter dans les tumeurs l’activation de kinases ou de voies de signalisation susceptibles d’être ciblées par les molécules thérapeutiques spécifiques disponibles. Un autre champ d’application est bien entendu le domaine du diagnostic précoce et de l’évaluation pronostique, dont les retombées potentielles sont majeures. Avant que cette ère n’advienne, un certain nombre de limites actuelles doivent être dépassées. Elles tiennent à l’étendue, la dynamique et la complexité du protéome, couplées à la complexité du processus cancéreux. Les approches de protéomique, bien que rapidement évolutives et innovantes, doivent donc connaître un certain nombre de révolutions qualitatives avant d’être introduites en « prime-time » dans le champ clinique.

Par exemple, malgré la sensibilité intrinsèque et le caractère non biaisé a priori des approches en SM, l’accès de ces technologies aux protéomes de faible abondance enfouis au sein d’échantillons très complexes, tels que le sérum ou le plasma, reste limité. Ceci est lié à la très haute gamme dynamique des protéines présentes dans un échantillon biologique et la difficulté à mesurer simultanément des quantités qui diffèrent d’un facteur pouvant atteindre 1010. C’est pourtant parmi ces protéines de faible abondance que se trouvent probablement les biomarqueurs spécifiques. Parmi les approches développées pour contourner cet obstacle, les stratégies de déplétion, d’égalisation ou de sous fractionnement des échantillons sont en cours de développement.

Une autre limitation potentielle concerne la gestion du matériel biologique à examiner. Les protéines étant hautement sensibles à la dégradation, il est impératif que les échantillons cliniques dédiés à l’analyse protéomique à visée de recherche soient collectés, stockés et conservés dans des conditions prospectives optimisées et standardisées, couplées au recueil d’informations cliniques précises et complètes. La quantité du matériel disponible est également une véritable question, puisque les échantillons cliniques sont souvent de taille modeste.

Enfin, l’intégration des approches protéomiques aux autres techniques de typage moléculaire des tumeurs (génomique, transcriptomique, métabolomique, interactomique…) est probablement essentielle si l’on souhaite approfondir mieux encore le démembrement des mécanismes à l’œuvre dans les processus biologiques complexes qui sous-tendent le développement des cancers.

Conflits d’intérêts : aucuns.Soutiens et financements

Anthony Gonçalves a bénéficié des soutiens suivants :

PHRC 2004 ; INCa, Projet libre 2005 ; Union européenne, FP6 2005, Projet OVCAD

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