Rôle des Lymphocytes T régulateurs dans la progression de la fibrose hépatique associée à l’infection par le VHC

Nadira Delhem; Françoise Cottrez; Arnaud Carpentier; Céline Miroux; Olivier Moralès; Violaine François; Hervé Groux; Claude Auriault; Véronique Pancré

doi:10.1684/bdc.2008.0752

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Rôle des Lymphocytes T régulateurs dans la progression de la fibrose hépatique associée à l’infection par le VHC

Bulletin du Cancer. Volume 95, Numéro 11, 1029-38, novembre 2008, Article original

DOI : 10.1684/bdc.2008.0752

Résumé

Summary

Auteur(s) : Nadira Delhem, Françoise Cottrez, Arnaud Carpentier, Céline Miroux, Olivier Moralès, Violaine François, Hervé Groux, Claude Auriault, Véronique Pancré , Laboratoire d’immunopathologie des cancers viro-induits, Institut de biologie de Lille, UMR 8161, Lille, Immunosearch, Les Cyclades, chemin de Camperousse, Grasse, Laboratoire d’immunologie, UPREZ 1833, Institut Cochin, Paris, Institut de pharmacologie moléculaire et cellulaire, 60, route des Lucioles, Valbonne, Sophia Antipolis.

Résumé : L’infection par le virus de l’hépatite C (VHC) est fortement prévalente en France. Les caractéristiques principales de l’infection virale sont le très fort risque (environ 80 %) de développement d’un portage chronique et l’évolution vers des lésions d’hépatite chronique active sévère puis de cirrhose, le carcinome hépatocellulaire (CHC) représentant fréquemment le stade ultime de cette évolution. L’évolution vers la forme chronique de l’infection s’accompagne d’une diminution importante de la réponse cellulaire antivirale multi-spécifique des cellules T CD4 et CD8. Nous suggérons que le dysfonctionnement du système immunitaire au cours de l’infection par le VHC, puisse reposer sur l’existence de mécanismes immunosuppresseurs supportés notamment par les lymphocytes T CD4 régulateurs Tr1 via leur production élevée d’IL-10. Ainsi, en utilisant la PCR quantitative en temps réel, nous avons pu mettre en évidence, une augmentation significative de l’expression intra-hépatique de gènes codant diverses molécules impliquées dans l’immunosuppression et décrites comme directement associées à l’activité des T régulateurs. En effet, l’expression de CD4, CD25, T1-ST2 ou CCR5 mais aussi de l’IL-10 et du TGFβ est fortement augmentée chez les patients présentant une cirrhose et/ou un hépatocarcinome versus les patients n’ayant aucune lésion hépatique. Plus récemment, les marqueurs spécifiques de la population régulatrice Tr1 ont été mis en évidence et nous ont permis de valider la surexpression des marqueurs spécifiques de cette sous-population, proportionnellement à l’évolution de la fibrose hépatique. Ces résultats sont confortés par la détection des marqueurs des Tr1 directement dans les biopsies hépatiques, par immunohistochimie ex vivo. Ces résultats nous confortent donc dans l’hypothèse selon laquelle le système immunitaire serait immuno-régulé chez les patients chroniquement infectés qui évoluent vers le CHC, et démontrerait l’implication des Tr1 et possiblement d’autres populations régulatrices tels que les CD4+CD25+ (Treg) dans la progression de la pathologie infectieuse. La mise en évidence de différents phénotypes de T régulateurs chez des patients chroniquement infectés versus des patients présentant un hépatocarcinome renforcerait considérablement l’importance in vivo des effets qui pourraient être induits par les cellules T régulatrices.

Mots-clés : VHC, cirrhosis, carcinome hépatocellulaire, T CD4+CD25+, Tr1

Illustrations

ARTICLE

Auteur(s) : Nadira Delhem¹, Françoise Cottrez², Arnaud Carpentier^1,3, Céline Miroux¹, Olivier Moralès¹, Violaine François¹, Hervé Groux², Claude Auriault⁴, Véronique Pancré¹

¹Laboratoire d’immunopathologie des cancers viro-induits, Institut de biologie de Lille, UMR 8161, Lille
²Immunosearch, Les Cyclades, chemin de Camperousse, Grasse
³Laboratoire d’immunologie, UPREZ 1833, Institut Cochin, Paris
⁴Institut de pharmacologie moléculaire et cellulaire, 60, route des Lucioles, Valbonne, Sophia Antipolis

Article reçu le 26 Mars 2008, accepté le 18 Septembre 2008

Introduction

L’hépatite C est une affection hépatique d’origine virale que l’on avait qualifiée d’hépatite « ni A, ni B » à transmission parentérale jusqu’à ce que l’on mette en évidence l’agent étiologique en 1989 [1]. L’infection par le virus de l’hépatite C (VHC) est fortement prévalente en France : environ 1.3 % de la population générale est en effet chroniquement infectée. On estime que 170 millions de personnes dans le monde sont des porteurs chroniques du VHC et que 3 à 4 millions de personnes sont infectées chaque année. Les caractéristiques principales de l’infection virale sont le très fort risque (environ 60-80 %) de développement d’un portage chronique et, chez les sujets chroniquement infectés, la possibilité d’évolution vers des lésions d’hépatite chronique active sévère puis de cirrhose, le carcinome hépatocellulaire (CHC) représentant fréquemment (30-50 % des cas après 10 ans d’évolution) le stade ultime de cette évolution [2]. En Europe du Sud et au Japon, 50 à 75 % des hépatites C sont associées à un hépatocarcinome.

La relation entre hépatite chronique C et hépatocarcinome est confirmée par de nombreuses études, y compris des études longitudinales [3]. Le cancer primitif du foie est une tumeur maligne qui peut se développer aux dépens des cellules hépatiques.

L’hépatocarcinome est le plus souvent en rapport avec une atteinte virale à l’origine de l’hépatite B ou de l’hépatite C. Le mécanisme précis de l’oncogenèse (transformation cancéreuse) est inconnu. Les patients présentant une tumeur localisée peuvent avoir une survie relativement prolongée après la résection (ablation) de cette tumeur. Néanmoins, comme le diagnostic est généralement tardif, la mort survient souvent en quelques mois. Chez la plupart des malades atteints d’un cancer du foie en l’absence d’hépatite B, on retrouve les traces d’une infection par le VHC. On n’a pas encore élucidé le mécanisme qui conduit de l’hépatite C au cancer du foie. L’hépatite C aggrave par ailleurs toute affection hépatique préexistante à laquelle elle vient se surajouter. Ainsi, le cancer du foie progresse-t-il plus rapidement chez les sujets qui sont porteurs du VHC.

L’infection par le virus de l’hépatite C est caractérisée par sa persistance malgré une réponse immunitaire à la fois humorale et cellulaire [4]. La clearance virale est généralement associée à une réponse antivirale cellulaire multispécifique des lymphocytes T CD4+ et CD8+ [2], qui persiste généralement. Cette réponse immune n’est pas décelable chez des sujets chroniquement infectés ou chez des sujets qui auraient initialement contrôlé l’infection mais chez lesquels la virémie réapparaît par la suite [3]. Le rôle des T CD8+ au cours de l’infection aiguë a été plus clairement étudié dans un modèle expérimental de chimpanzé infecté par le VHC et chez lequel une réponse cellulaire T CD8+ intrahépatique et multispécifique au VHC a été décelée chez 2 chimpanzés/2. Cette réponse immune à permis une élimination du virus uniquement chez 1 chimpanzé [5, 6]. Les lymphocytes CD4 jouent un rôle central dans le contrôle précoce de la réplication virale [7]. Une forte activité des lymphocytes T helper de type 1 (Th1), spécifiques des protéines Core, NS3, NS4 et NS5, a été notamment associée au processus de guérison spontanée [3]. À l’inverse, une réponse CD4 de faible amplitude ou non persistante est plutôt associée à un mauvais pronostic de l’évolution de l’infection à VHC [8]. L’évolution de l’hépatite C vers la forme chronique de l’infection s’accompagne donc d’une diminution importante de la réponse cellulaire antivirale CD4 et CD8 [7]. C’est cette réponse immunitaire altérée qui serait à l’origine de la tolérance au virus et donc sa persistance. La cinétique, l’ampleur et la qualité de la réponse immune anti-VHC au cours des premiers jours et premières semaines après l’infection contribuent probablement de façon très importante à l’évolution et à l’issue de l’infection.

Initialement identifiées en situation de désordres immunologiques telles certaines pathologies auto-immunes inflammatoires, la famille des cellules T régulatrices, dont font partie les Tr1, se caractérise par sa capacité à inhiber la réponse T helper. Ces cellules se caractérisent notamment par un profil de cytokines distinct de celui des cellules Th1 et Th2.

En effet, elles sont décrites comme sécrétant une grande quantité d’IL-10, un niveau modéré d’IFNγ et d’IL-5, un faible niveau de TGFβ et une quantité presque indétectable d’IL-4 ([9].

Bien que considéré comme ayant un rôle dans la maintenance de la tolérance du soi, de récentes études suggèrent que les cellules T régulatrices puissent être induites in vivo contre des antigènes bactériens, viraux ou parasitaires et pourraient favoriser la persistance du pathogène en supprimant la réponse Th1 protectrice [10]. Une étude récente a montré l’implication des cellules T CD4+ helper (Th1) et des T régulateurs au cours de l’infection par le VHC. En effet, la réponse des cellules T CD4 dirigée contre la protéine d’encapsidation (Capside) a été étudiée dans un groupe de femmes infectées par le VHC [11]. Cette étude a montré une augmentation plus importante des CD4 sécrétant de l’IFNγ en réponse à 4 régions immunodominantes de la protéine de capside. Il a également été montré que ces cellules T CD4 produisaient de l’IL10 mais pas d’IL4. D’autre part, une étude in vitro a montré que le virus de l’hépatite C lui-même était capable d’induire une sécrétion de l’IL-10 [12]. Cramp et al. a également observé au cours du traitement de l’hépatite C, une « downregulation » de la production d’IL10, coïncidant avec une « up-regulation » de la production d’IFNγ par les lymphocytes T helper CD4 [13]. Ces études montrent clairement une implication des cellules T helper de type 1, des T régulateurs et de l’IL10 dans la pathologie du VHC.

Matériels et méthodes

Patients

Trente-deux patients chroniquement infectés par le VHC sont inclus dans cette étude. Ils appartiennent à une cohorte de patients suivie dans le service de gastro-entérologie de l’hôpital universitaire Necker - Enfants-Malades (Paris). Les critères d’inclusion sont l’âge (> ou = à 18 ans, et < ou = à 65 ans), un taux d’ALAT au moins trois fois supérieur à la normale et des IgM anti VHA, VHB et VHE négatifs. Chaque donneur présente ou a présenté une sérologie positive pour le VHC prouvée par microparticule EIA de troisième génération (Abbott Axsym, Abbott Park) et confirmée par un test sérologique RIBA strip (Chiron Corporation, Emeryville, Californie) ou recherche de l’ARN du virus C par PCR dans le sérum (Roche Diagnostics, Branchburg, N.J). Tous les patients séropositifs pour le VHC sont chroniquement infectés par le génotype 1b. Le génotypage du VHC a été réalisé par RT-PCR avec des amorces spécifiques de chaque génotype viral (Roche Diagnostics, Branchburg, N.J).

Ne seront pas inclus dans l’étude les patients présentant les critères suivants : une co-infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) ; la présence d’une maladie du foie non associée à l’infection par le VHC et l’absence de PCR-VHC qualitativement détectable.

Matériel biologique

L’ensemble du matériel est obtenu dans le cadre du suivi clinique normal du patient et aucun prélèvement supplémentaire n’a été réalisé pour cette étude. Les biopsies hépatiques ont été réalisées selon la méthode standard de Menghini, consistant en un prélèvement à l’aiguille de 1,6 mM de diamètre. L’analyse anatomopathologique a permis d’établir le stade de fibrose (F), de nécrose et d’inflammation (NI) de chacune des biopsies, permettant ainsi de les classer dans trois groupes distincts. Le groupe des patients chroniquement infectés par le VHC et ne présentant pas ou très peu de lésions de fibrose (F < ou = 1/6, NI < ou = 1/18) (« chroniques » n = 10). Un groupe de patients présentant des lésions hépatiques assimilées histologiquement à une cirrhose (F < ou = 6/6) (« cirrhose » n = 10). Et enfin un groupe de patients ayant atteint le stade du carcinome hépatocellulaire confirmé par une expertise anatomopathologique(« CHC » n = 10). Un groupe contrôle a également été ajouté, comprenant des patients souffrant d’alcoolisme (1 à 2g d’alcool/jour) qui présentent des lésions hépatiques de cirrhose et de CHC, indépendante d’une infection par le VHC ou le VHB (« alcooliques » n = 4).

Toutes les biopsies sont congelées à -80 °C immédiatement après la ponction en vue de l’extraction d’ARN, ou congelées après inclusion dans un cryoprotecteur pour les expériences d’immunohistochimie. Par ailleurs, nous disposons d’un ensemble de biopsies hépatiques qui ont été réalisées sur un patient suivi au décours de la progression de sa fibrose C, environ sur une vingtaine d’années (VHC-génotype 1b). Les biopsies ont été réalisées selon la méthode classique de Menghini et les scores de fibrose et de nécro-inflammation ont été histologiquement validés. Ces analyses de score ont permis d’établir un classement identique à celui établi dans la cohorte de 32 patients précédemment décrite, avec 3 stades distincts : le stade de la chronicité, de la cirrhose et du CHC.

Extraction d’ARN et la rétro-transcription

L’extraction de l’ARN total a été réalisée à partir des biopsies de foie congelées, en utilisant du TRIzol (GIBCO BRL, Invitrogen^®, GB). L’échantillon de tissus est homogénéisé dans 300 mL de TRIzol et incubé 5 min à température. L’ensemble est repris dans 60 mL de chloroforme (PROLABO, Merck Eurolab, France) et centrifugé à 12 000 g pour récupérer la phase aqueuse contenant l’ARN. L’ARN total est ensuite immunoprécipité avec 100 mL d’isopropanol (ACROS Organics, USA), incubé 10 min à température ambiante et centrifugé pour éliminer le surnageant. Le culot d’ARN est lavé deux fois avec de l’éthanol à 70° (CARLO ERBA Reagent, France), resolubilisé dans de l’eau « RNAse Free » (GIBCO BRL, Invitrogen^®, GB) puis quantifié par spectrophotométrie (D.O). Avant la rétro-transcription, une étape préalable de traitement à la DNAse est réalisée (GenHunter corp, France), puis 1 à 4 μg d’ARN total est repris par 5 μL du mélange suivant :

1 μL d’oligo dT (Roche, France) + 0,1 μL de RNAsin (40 U/ μL, PROMEGA, USA) + 4 μL H20, et incubé à 70 °C pendant 5 à 10 min.

Après 5 min à température ambiante, on rajoute 10 μL de la solution suivante :

6 μL de Tampon 5X (Tris-HCl, KCl, MgCl2) (GIBCO BRL, Invitrogen^®, GB) + 1 μL DTT (GIBCO BRL, Invitrogen^®, GB) + 2 μL dNTPs 10 mM (Amersham Biosciences, USA) + 0,1 μL RNAsin + 1 μL de Transcriptase Réverse SuperscriptÔ (GIBCO BRL, Invitrogen^®, GB). La solution est incubée à 45° C pendant 45 à 60 min, puis à 95° C pendant 5 min. Enfin, 70 μL d’eau sont ajoutés pour chaque μg d’ARN utilisé, afin d’obtenir une concentration finale de 10ng/ μL d’ADNc total.

PCR quantitative en temps réel (Light cycler ; Roche diagnostic^®, France)

Toutes les amorces ont été choisies en vue de leur utilisation en PCR quantitative en temps réel et ont été acquises auprès de MWG Biotech (Allemagne) (tableau 1). Les gènes de ménage bActin et G3PDH sont utilisés pour normaliser les résultats. La PCR en temps réel est réalisée à partir d’ADNc à la concentration de 10ng d’équivalent ARN par mL de liquide réactionnel. Pour chaque réaction, le mix PCR contient 14,1 mL d’H₂0, 2,4 mL de MgCl2, 0,5 mL de chaque amorce à 10pmol/l et 2 mL de tampon VCR Master mix. La néosynthèse du double brin d’ADN peut être suivie en temps réel grâce à la mesure d’incorporation du Sybr-Green.

Jusqu’à 32 échantillons peuvent être analysés simultanément avec une étape initiale de dénaturation à 95 °C pendant 8 minutes. Les réactions de PCR sont ensuite réalisées sur 45 cycles comme suit : 15 secondes à 95 °C, 7 secondes à la température adaptée d’hybridation des amorces, et 18 à 64 secondes d’élongation à 72 °C en fonction de la longueur de la séquence ciblée. L’intensité de fluorescence est mesurée à la fin de chaque cycle d’élongation.

Enfin, on réalise un cycle de fusion en faisant monter graduellement la température jusqu’à 95 °C avec une mesure de densité optique continue. Une électrophorèse sur un gel d’agarose (SIGMA-ALDRICH, Allemagne) à 1,5 % dans du Tris Borate EDTA (TBE), suivi d’un marquage de l’ADN par du Bromure d’éthidium (BET), est réalisée après chaque PCR afin de visualiser l’amplicon.

L’analyse de l’expression transcriptomique des gènes est exprimée en « CT » (Cycle Threshold). Pour chaque patient, le CT est normalisée par la moyenne des valeurs des CT des gènes de ménage (bActine et GAPDH) = DCT. L’ubiquitine n’a pas été prise en compte, dans la mesure où l’ubiquitinilation d’un foie varie en fonction du stade de la fibrose. L’expression de chaque gène est ensuite exprimée par rapport au groupe de référence prédéterminé (« chronique ») = DDCT. Par ailleurs, la significativité des résultats obtenus est validée par l’utilisation du test statistique rank sum Mann-Whitney (p < 0.05 = significatif ; p < 0,01 = hautement significatif).

Tableau 1 Séquence des primers utilisés pour la PCR quantitative en temps réel

Gène	Température (°C) Sequences des Primers de fusion		Gène	Température (°C) Sequences des Primers de fusion
hCD4:	5’-GGGAAATCAGGGCTCCTTCTTA	59	hIL-2:	5’-ACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTAC	61
hT1-ST2:	5’-TGGTCCCAAAGGCTTCTTCTT 5’-GTGTTTGCCTCAGGCCAACT	59	hIL2-Ra:	5’-TCCAGAGGTTTGAGTTCTTCTTCTAGA 5’-GGGACTGCTCACGTTCATCA	59
hCCR5:	5’-TGACATTCGCATATCCAGTCCTA 5’-GTCAAGTCCAATCTATGACATCAATTATT	57	hIL2-Rb:	5’-TTCAACATGGTTCCTTCCTTGTAG 5’-GGGCTTTTGGCTTCATCATC	59
hCD49b:	5’-CGGGCTGCGATTTGCTT 5’-CAACGGGTGTGTGTTCTGACA	59	hIL2-Rg:	5’-CTTCTGGACGTCTCCTCCATG 5’-GCCCAATGGGAATGAAGACA	57
hCD18:	5’-TCATCACACACAACCACAACATCT 5’-ATGCTTGATGACCTCAGGAATGT	59	hIL-4:	5’-AGCTGCTGTTCCAAGTGCAA 5’- CACAAGCAGCTGATCCGATTC	59
hCD8a:	5’-ACGGTCTTGTCCACGAAGGA 5’-CCCTGAGCAACTCCATCATGTAC	60	hIL-5:	5’-TTCCAAGAAGTTTTCCAACGTACTC 5’- CCACAAGTGCATTGGTGAAAGA	60
hCD8b:	5’-GGCGTCGTGGTGGGC 5’-TGGCCGCGCAGCTG	55	hIL-6:	5’-TGTACAGGAACAGGAATCCTCAGA 5’- ATGTAGCCGCCCCACACA	58
hCD19:	5’-CTTGTTGGTTTGCACCTTTATGTATG 5’-CTCACCCCCATGGAAGTCAG	60	hIL-10:	5’-CCAGTGCCTCTTTGCTGCTT 5’-GAGAACCAAGACCCAGACATCAA	59
hCD11c:	5’-CTTGAGGCACTGCAGCACAG 5’-AATTCAGGCGCACGTCAAA	56	hIL-10Ra:	5’-CCACGGCCTTGCTCTTGTT 5’-CCGAGAGTATGAGATTGCCATTC	60
hCD25:	5’-ATCCCTACGGGCCCCATAT 5’-GGGACTGCTCACGTTCATCA	59	hIL-10Rb:	5’-CAGATGGTTTCACCTGGACACA 5’-TGGGAGTCACCTGCTTTTGC	59
hCTLA-4:	5’-TTCAACATGGTTCCTTCCTTGTAG 5’-TTCTTCTCTTCATCCCTGTCTTCT	61	hIFN-b1:	5’-TCCGTCAAGGTAGTATTCATGCA 5’-CAGCAATTTTCAGTGTCAGAAGCT	60
hGITR:	5’-GAGATGCATACTCACACACAAAGCT 5’-TGTGTCCAGCCTGAATTCCA	59	hIFN-a2:	5’-GGCGTCCTCCTTCTGGAACT 5’-CAGGAGGAGTTTGGCAACCA	60
hICAM-1:	5’-CCGAGGCACAGTCGATACACT 5’CCCTGATGGGCAGTCAACA	60	hIFNγ:	5’-AGCAGCAGATGAGTCCTTTGTG 5’-ATGTAGCGGATAATGGAACTC	53
hP-Selectin:	5’-GCAGCGTAGGGTAAGGTTCTTG 5’-CTGGAACCCCTGAGTCTACCAC	63	hIFNγ-R1:	5’-GACATTCAAGTCAGTTACC 5’-TCGATTATGATCCCGAAACTACCT	59
hb-actin:	5’-GTCTGTATCTCCATAGCTGCTGAATC 5’-CACGGCATCGTCACCAACT	58	hTGF-b1:	5’-GGAATCGCTAACTGGCACTGA 5’-CGAGCCTGAGGCCGACTAC	62
h5’G3PDH:	5’-AGCCACACGCAGCTCATTG 5’-CCATCAATGACCCCTTCATTG	58	hTGF-bR1:	5’-CGGAGCTCTGATGTGTTGAAGA 5’-TGACAACGTCAGGTTCTGGCT	57
	5’-CTTGACGGTGCCATGGAATT		hTGF-bR2:	5’-AATCGACCTTTGCCAATGCT 5’-GCTGCTTCTCCAAAGTCATT	58
			hGCSF:	5’-AACAAGTCAGGATTGCTGGTGTT 5’-AGAGCCCCATGAAGCTGATG	60
			hG-CSFR:	5’-ATCTTCCTCACTTGCTCTAAGCACT 5’-GACTGGACACATGGTGGCG	59
				5’-TAACCTTGGATCCGTCCGC

Analyse immunohistochimique

Les biopsies de foie sont congelées dans un cryo-conservateur : l’OCT compound (Miles- Elkhart, USA), et sont stockées à -80 °C. Les coupes sériées de 5 μm sont réalisées au cryostat sur des lames préalablement gélatinées, sont séchées à température ambiante pendant 3 à 4h puis fixées à l’acétone froide pendant 10 min avant leur utilisation. Les marquages immunohistochimiques sont réalisés en utilisant le kit DAKO LSAB^® de 2^e génération (Dako^®, USA). Après blocage des peroxydases endogènes pendant 2 minutes avec de l’H₂O₂ à 0,1 % et saturation par du SVF 3 % dans du TBS (Tris Buffer Saline) pendant 10 min, les coupes sont incubées avec l’anticorps primaire dilué dans du TBS 2 % SVF pendant 30 minutes. Après trois lavages, l’anticorps secondaire IgG lapin anti-souris biotynilé est ajouté pendant 15 minutes. Puis, une étape d’amplification est réalisée par l’ajout de la streptavidine HRP (Horse Radish Peroxydase) pendant 10 min permettant la formation du complexe biotine-streptavidine- HRP. L’étape de révélation de la péroxydase se fait par l’ajout de l’AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) pendant 3 min (temps variable), permettant ainsi la révélation d’un chromogène rouge. Les coupes sont contre-colorées avec de l’hemalun de Meyer (Merk, Allemagne) et soumises à un bain d’H2O ammoniaquée (37 mM). Le montage des lames est réalisé dans un milieu aqueux : le glycergel (DAKO, USA), et la lecture est faite sous un microscope optique.

Résultats

Expression des transcrits spécifiques des Lymphocytes

Nous avons observé une augmentation significative (Rank sum Mann-Whitney test : p < 0.05) de l’expression des gènes codant CD4, CD8α et β et CD19 dans les groupes de patients avec cirrhose et CHC, comparés au groupe de patients sans lésion hépatique (« chronique ». Il n’a pas été possible de mettre en évidence d’amplification du marqueur CD11c spécifique des cellules dendritiques, et ce dans aucune des biopsies analysées (figure 1A). Ainsi, l’analyse comparative des CT montre une augmentation de l’expression des marqueurs des lymphocytes T (CD4 et CD8) et des lymphocytes B (CD19) proportionnellement à la sévérité de la fibrose qui est déterminée par le score F/NI. Afin de valider les résultats de façon indépendante, nous avons réalisé des migrations électrophorétiques sur gel d’agarose des produits de chacune des RT-PCR. Les résultats de la migration sont représentés dans la figure 1B, pour 5 patients par groupe, montrant une augmentation de l’expression des marqueurs de lymphocyte T et B dans les stades avancés de la fibrose C.

Expression des transcrits spécifiques des cytokines et de leurs récepteurs

Comparé au groupe de référence (« chronique »), nous avons observé dans les cirrhoses et les CHC une augmentation significative (p < 0.05) des gènes codant les cytokines : IL-5, Il-6, IL- 10, IFN-β1, IFN-α2, TGF-β1 et le facteur de croissance G-CSF. Les gènes codant les récepteurs tels que IL-2R (α, β et γ), IL10-R (α et β), IFNγ-R1 et TGFβ-RII sont également surexprimés dans la cirrhose et le CHC. Au contraire, aucune différence notable n’a pu être mise en évidence entre les 3 groupes pour IL-2, IL-4, IFNγ, TGFβ-RI et G-CSF-R (figure 2A). Les résultats de la migration sur gel d’agarose pour l’ensemble des RT-PCR sont visibles dans la figure 2B.

Expression des transcrits spécifiques des lymphocytes T régulateurs dans les biopsies hépatiques

Un ensemble de marqueurs ont été analysés par Q-PCR afin de caractériser les différentes sous-populations de lymphocytes T régulateurs. Ces marqueurs sont plus ou moins spécifiques des lymphocytes Treg (CD4, CD25, FoxP3, GITR…), des lymphocytes T régulateurs Tr1 (CD4, T1ST2, CCR5, CD18, CD49b), des molécules de co-stimulation (CTLA-4) et des molécules d’adhésion (ICAM1, P-selectin) (figure 1A et 1B). Nous avons observé pour l’ensemble de ces marqueurs une augmentation de leur expression proportionnellement à l’aggravation de la fibrose hépatique. Ainsi, ces résultats suggèrent l’existence intra-hépatique de Treg, mais aussi de Tr1 dans les foies des patients aux stades avancés de la cirrhose et du CHC. Ce résultat établit une corrélation importante entre la prévalence des lymphocytes T régulateurs et le degré de la fibrose hépatique. Pour tous ces gènes plus ou moins spécifiques, la différence d’expression entre le groupe de référence (« chronique ») et le groupe « cirrhoses » ou le groupe « CHC », est statistiquement significative (Rank sum Mann-Whitney test, p < 0.05).

Afin de corréler le recrutement des T régulateurs spécifiquement à l’infection par le VHC, nous avons analysé l’expression des gènes associés aux Treg et aux Tr1 (CD4, CD25, CD49b et CD18) à partir d’ARN extraits de biopsies hépatiques de patients indépendants, souffrant d’une cirrhose ou d’un CHC d’origine alcoolique. Comme le montre la figure 3, nous n’avons pas observé de surexpression des marqueurs des Treg, ni des Tr1 dans ces biopsies.

Analyse imuno-histochimique des marqueurs associés aux Tr1

Afin de confirmer les résultats obtenus par PCR quantitative en temps réel, nous avons recherché l’expression protéique des marqueurs associés aux lymphocytes T régulateurs Tr1, en réalisant des analyses immunohistochimiques sur les biopsies hépatiques autologues. La figure 4 montre les marquages immunohistochimiques réalisés sur des coupes de foies congelées autologues, pour un patient représentatif de chaque groupe (« chronique », « cirrhose » et « CHC »), utilisant un anti-IL-10 (a, b, c), un anti-CD18 (e, f, g), un anti-CD49b (i, j, k) et un anti-CD4 (m, n, o). Le contrôle de la spécificité des marquages a été réalisé en omettant les anticorps secondaires (d, h, l, p). Nous avons très clairement observé une intensification du marquage pour l’ensemble des marqueurs, proportionnellement à la gravité de la fibrose hépatique. Cependant, comme nous l’avons précédemment observé dans les analyses d’expression génique par Q-PCR, nous n’avons pas mis en évidence de différence significative d’expression protéique du CD4, de l’IL-10, du CD18 ou du CD49b entre les biopsies prélevées en phase cirrhotique et celles prélevées au stade du CHC.

Caractérisation des lymphocytes T régulateurs dans les biopsies hépatiques d’un patient suivi à long terme dans l’évolution de sa fibrose C

Nous avons recherché la présence de lymphocytes T régulateurs dans les biopsies hépatiques prélevées de façon séquentielle (tout au long de la progression de la fibrose C : de la chronicité jusqu’au CHC en passant par la cirrhose) chez un patient infecté par un VHC de génotype 1-b (figure 5). Nous avons observé une augmentation significative de l’expression du marqueur CD19 dans les biopsies prélevées au cours de la cirrhose et du CHC en comparaison aux premières biopsies prélevées dans la phase chronique (sans lésion hépatique). L’expression du CD8β, mais pas du CD8α est également augmentée dans la cirrhose et le CHC. Cependant, l’observation majeure de cette étude est l’augmentation significative de l’expression du CD4 au cours du temps et proportionnellement à la sévérité de la récidive, sans observer cependant d’augmentation de l’expression des gènes codant l’IL-2 et l’IFNγ. Nous avons également confirmé dans la cirrhose et le CHC, une augmentation de l’expression de l’IL-10, du TGFβ et de leurs récepteurs respectifs IL-10 Rα, IL-10 Rβ et TGFβ RII, mais pas de l’IL-4. Dans cette étude, l’augmentation significative de l’expression des marqueurs associés aux lymphocytes Treg (CD4, CD25, FoxP3, GITR, Pselectin, ICAM I ...) et Tr1 (CCR5, T1ST2, CD18, CD49b…), permet de confirmer les résultats précédemment obtenus dans l’étude réalisée sur la cohorte de patients. Pour l’ensemble de ces gènes, la différence d’expression observée est statistiquement significative (Rank sum Mann-Whitney test, p < 0.05).

Discussion

Environ 20 % des patients infectés par le VHC développent une cirrhose ou un carcinome hépatocellulaire consécutifs à l’absence au cours de la phase aigue de l’infection virale, d’une réponse CD4 de type Th1 et CD8 cytotoxique efficace [8, 14]. Dans cette étude, nous avons analysé l’expression de gènes phénotypiques et fonctionnels associés aux lymphocytes T, à partir d’ARN extraits de biopsies hépatiques d’une cohorte de patients chroniquement infectés par un VHC de génotype 1-b qui présentaient des lésions plus ou moins avancées de fibrose hépatique. Dans un premier temps, nous avons montré une augmentation significative de l’expression du gène CD8α et β dans les groupes de patients avec cirrhose et CHC. Ces résultats sont en corrélation avec les travaux de Leroy et al, qui ont montré par des approches similaires de Q-PCR et d’analyse immunohistochimique, une augmentation significative de l’expression génique et protéique du CD8β [15]. Ces résultats suggèrent qu’au cours de l’infection chronique par le VHC, les cellules T CD8 sont maintenues au niveau intra-hépatiques mais sont immunosupprimées, et probablement par un mécanisme médié par les T CD4 [16]. D’autre part, comme il a déjà été décrit, ces cellules CD8 jouent également un rôle important en tant qu’effecteur des lésions hépatiques [17].

Nous avons également mis en évidence une augmentation intra-hépatique de l’expression des lymphocytes B, préférentiellement dans les cirrhoses et les CHC, confirmant les données de la littérature concernant la fréquence des lymphomes B associé à l’infection chronique par le VHC. En effet, une étude a montré que la fréquence des cellules B était plus importante dans les PBMCs périphériques des patients avec une fibrose hépatique sévère, comparée aux donneurs sains ou aux patients répondeurs au traitement et qui ont éradiqué le virus [18].

Notre observation majeure est l’augmentation significative de l’expression du CD4 au cours du temps et proportionnellement à la sévérité de la fibrose hépatique. Cependant, nous n’avons pas observé de variation pour l’expression des cytokines effectrices IFNγ et IL-2, écartant une association entre l’augmentation de l’expression du CD4 et une réponse immune effectrice de type Th1. Par ailleurs, l’absence de surexpression de l’IL-4 suggère que les cellules T CD4 de type Th2 sont également à écarter [19]. Les lymphocytes T régulateurs sont un autre type de T CD4 présentant des propriétés immunosuppressives et un profil cytokinique distinct des cellules Th1 et Th2. On distingue parmi eux, les Tr1 qui sécrètent un taux élevé d’IL-10 et peu de TGFβ, les cellules Th3 qui sécrètent essentiellement du TGFβ et les cellules Treg qui suppriment la réponse immune par contact cellulaire [10]. Bien que les taux d’IL-10 et de TGFβ produit in vitro ne semblent pas significativement plus élevés que ceux produit par les cellules Th2, ce qui semble important soit que les Tr1 produisent ces cytokines en absence d’IL-2 ou d’IL-4 [9]. Ainsi, dans cette étude, la production d’IL-10 et de TGFβ en l’absence d’IL-2 et d’IL-4 suggère que les Tr1 pourraient en effet jouer un rôle dans les cirrhoses et les CHC. Bien que les cellules dendritiques du foie soient également capables de sécréter de l’IL-10 [20], l’absence d’expression du CD11c est en faveur d’une production de cette cytokine immunosuppressive exclusivement par les Tr1. L’absence d’expression du CD11c dans toutes les biopsies hépatiques pourrait s’expliquer par le rôle joué à la fois par la protéine d’encapsidation (Core) et la protéine non structurale (NS3) du VHC, qui sont connues pour induire l’activation monocytaire et l’inhibition de la différentiation des cellules dendritiques [21]. Par ailleurs, les résultats obtenus pour les marqueurs associés aux Tr1, tels que CCR5, T1ST2 et plus récemment le CD18 (Intégrine β2) et le CD49b (Intégrine α2) [22], confirment la présence des Tr1 en particulier dans les cirrhoses et les CHC. Cependant, bien que nous ayons identifié les marqueurs associés au Tr1 dans les foies fibrotiques, nous ne pouvons exclure la présence d’autres populations régulatrices telle que les Treg. Contrairement au Tr1, cette sous-population est capable d’inhiber la production d’IL-2, non pas par des mécanismes de sécrétion cytokinique, mais par contact cellule-cellule et expression d’une molécule de co-stimulation inhibitrice CTLA-4 [23]. Dans ce sens, nous avons observé une augmentation significative de l’expression du CTLA-4 intrahépatique dans les stades avancés de la fibrose C. Ces dernières années, de nombreuses études ont permis de proposer des marqueurs plus ou moins spécifiques des Treg, tels que GITR [24], ICAM-I et P-sélectine [25] et plus récemment le facteur de transcription Fox-P3 [26]. Dans notre étude, nous montrons clairement une augmentation de l’ensemble des marqueurs associés aux Treg en particulier dans les stades de la cirrhose et du CHC. En outre, l’ensemble de ces analyses a également été reproduit sur les biopsies séquentielles d’un patient suivi sur une vingtaine d’années, confirmant une augmentation de l’expression des molécules associées à l’immunosuppression et aux lymphocytes T régulateurs (Tr1 et Treg) en fonction de l’aggravation de la pathologie virale hépatique. Ces résultats suggèrent qu’il y ait une présence concomitante de deux populations régulatrices au sein de la fibrose hépatique, pouvant interagir l’une avec l’autre et pourquoi pas jouer un rôle synergique dans la progression de la fibrose C. De plus, l’absence d’augmentation des marqueurs spécifiques des Tr1 ou des CD4+CD25 dans les biopsies hépatiques de patients non infectés par le VHC (ni par le VHB) présentant des cirrhoses ou des CHC d’origine alcoolique, suggère que le recrutement intra-hépatique des T régulateurs soit spécifique de l’infection par le VHC.

L’ensemble de ces données suggère que les lymphocytes T régulateurs sont impliqués dans le statut de chronicité de la maladie et surtout qu’ils sont capables de moduler la réponse immunitaire cellulaire favorisant l’évolution de la pathologie vers le CHC. Il semble important maintenant d’identifier spécifiquement ces populations régulatrices au sein du foie, en les isolant et en les clonant afin d’analyser leur capacité immunosuppressive et leur spécificité antigénique. L’implication de sous-population de T CD4+ régulateurs dans la persistance virale et dans la progression de la pathologie pourrait avoir des retombées significatives et permettre le développement de nouvelles cibles thérapeutiques.

Remerciements

Nous remercions la Ligue régionale contre le cancer (Comité du Nord) et le Groupement des entreprises GEFLUC, pour leur soutien financier. Nous remercions le CNRS, l’Institut Pasteur de Lille et l’université de Lille-II pour leur soutien financier et logistique. Nous tenons également à remercier Jean-Luc Lagneau de l’hôpital Necker pour sa disponibilité.

Et enfin, nous sommes reconnaissants aux patients qui en entrant dans cette étude permettent de faire avancer la science.

Références

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