Détection des anomalies chromosomiques et moléculaires dans les sarcomes des tissus mous : quels sarcomes ? quelles anomalies ? comment ? pourquoi ?

ARTICLE

Auteur(s) : Muriel Genevay¹, Carole Gengler², Louis Guillou²

¹Service de pathologie clinique, Hôpital Cantonal Universitaire, Genève, Suisse
²Institut universitaire de pathologie, rue du Bugnon 25, 1011 Lausanne, Suisse

Article reçu le 3 Avril 2007, accepté le 2 Mai 2007

Classification moléculaire des sarcomes (tableau 1)

Dans la première catégorie tumorale, on trouve les sarcomes porteurs de translocations réciproques qui représentent environ 30 % des sarcomes (par ex. sarcome synovial, sarcome d’Ewing, rhabdomyosarcome alvéolaire, etc.). Les translocations réciproques sont le résultat de cassures au sein de certains chromosomes suivies d’un échange de fragments chromosomiques qui mettent en contact des gènes qui normalement ne le sont pas. La « mise en contact » de deux gènes (par ex. SS18 sur le chromosome 18 et SSX1 ou SSX2 sur le chromosome X dans le cas de la translocation t(X;18)(p11;q11) du sarcome synovial) aboutit à la formation d’un gène chimérique (par ex. SS18-SSX1) appelé aussi gène de fusion, qui est transcrit (figure 1). Le produit de cette transcription est appelé produit de fusion ou transcrit de fusion. Les autres types de sarcome avec des anomalies spécifiques sont les sarcomes porteurs de mutations et/ou de délétions oncogéniques spécifiques (par ex. tumeurs stromales gastro-intestinales ou GIST, tumeur rhabdoïde) et les sarcomes porteurs d’amplifications spécifiques (par ex. liposarcomes bien différenciés et dédifférenciés) (tableau 1).

Les sarcomes tels que les léiomyosarcomes, les liposarcomes pléomorphes, les rhabdomyosarcomes pléomorphes, les schwanomes malins, les fibrosarcomes, les myxofibrosarcomes et les sarcomes non classés à cellules fusiformes et pléomorphes (auparavant appelés histiocytomes fibreux malins) montrent généralement des caryotypes complexes, ce qui a jusqu’à présent empêché l’identification d’anomalies spécifiques pouvant aider au diagnostic. Il est vraisemblable que, dans les années à venir, la combinaison de nouvelles méthodes associant la multi-FISH, la CGH-array, l’analyse du transcriptome permette l’identification d’anomalies spécifiques au sein de ces tumeurs à caryotypes complexes.

Il est important de souligner que la présence d’anomalies chromosomiques n’est pas synonyme de malignité. En effet, de nombreuses tumeurs bénignes (par ex. lipome, lipoblastome, lipome pléomorphe/à cellules fusiformes, schwanome, etc.) comportent des anomalies chromosomiques spécifiques dont on peut se servir pour confirmer le diagnostic morphologique [3] (tableau 1). Comme l’immunohistochimie, la biologie moléculaire et la cytogénétique ne doivent pas se substituer à la morphologie. Elles n’interviennent que comme un complément à l’élaboration du diagnostic, en conjonction avec la présentation clinique, la morphologie et l’immunohistochimie.
Tableau 1 Principales anomalies génétiques spécifiques pouvant être utilisées pour le diagnostic de certains sarcomes et tumeurs bénignes

Comment détecter les anomalies chromosomiques et moléculaires des sarcomes ?

Dans le domaine du diagnostic, les deux principales méthodes de détection en routine sont la RT-PCR (réaction polymérasique en chaîne effectuée après une étape de transcription inverse de l’ARN en ADN complémentaire) et l’hybridation in situ (ISH) en fluorescence (FISH) ou chromogénique (CISH) applicable aux chromosomes métaphasiques ou interphasiques (noyaux). Hybridation in situ et RT-PCR sont complémentaires l’une de l’autre. Si une technique donne des résultats douteux, ces derniers peuvent (et doivent) être vérifiés en faisant appel à l’autre. La RT-PCR est une technique à la fois sensible, spécifique, rapide et peu onéreuse qui peut être utilisée sur tissus frais, congelés ou fixés et inclus en paraffine, ainsi que sur des préparations cytologiques comme un matériel d’aspiration à l’aiguille fine. C’est la méthode de choix pour la détection de transcrits de fusion résultant des translocations réciproques [4]. Elle peut être effectuée sur un matériel très peu abondant comme des carottes biopsiques ou bien sur un prélèvement sanguin ou de moelle osseuse contenant très peu de cellules tumorales perdues au milieu de cellules non tumorales (intérêt pour la détection d’une maladie microscopique résiduelle ou la détection des rechutes tumorales infracliniques) [5, 6]. Il existe cependant des limites à cette méthode. Pour être transformé en ADN complémentaire (ADNc) puis amplifié, l’ARN doit être de bonne qualité. Ainsi, il est fortement recommandé d’éviter de fixer les tissus par le liquide de Bouin conventionnel (contenant de l’acide picrique) si l’on envisage une exploration moléculaire car l’ARN extrait est presque toujours de mauvaise qualité, fragmenté et à l’origine de résultats très souvent ininterprétables [1, 3]. À l’inverse, les fixations par le formol tamponné, l’alcool, l’AFA (un mélange d’alcool, d’acide acétique et de formol) et le liquide de Bouin-Hollande (contenant du sulfate de cuivre) sont adéquats car elles préservent suffisamment l’ARN. Les méthodes de détection basées sur la PCR sont ciblées, c’est-à-dire que les anomalies génétiques que l’on recherche sont déjà connues et identifiables grâce à l’utilisation d’amorces nucléotidiques déjà décrites. L’extrême sensibilité de la PCR peut aussi être un inconvénient ; elle impose une grande rigueur dans les manipulations afin d’éviter les faux positifs dus à une contamination du matériel. Les méthodes de RT-PCR conventionnelles appliquées aux tissus fixés et inclus en paraffine ne peuvent généralement pas détecter des transcrits de fusion qui dépassent 150-200 paires de base (en raison de la fragmentation de l’ARN). Dans cette dernière situation (comme par exemple dans les sarcomes d’Ewing/PNET), il faudra faire appel à des artifices pour amplifier l’ADNc d’intérêt.

La PCR est une méthode d’amplification élective d’une séquence d’ADN double brin (2-3 kilobases en routine), effectuée in vitro par extension itérative de deux amorces, situées de part et d’autre de la région considérée, grâce à une ADN polymérase thermorésistante (Taq-polymérase). L’amplification est effectuée par la répétition de cycles de dénaturation-hybridation-extension qui assure une duplication exponentielle de chaque brin [7]. La PCR est devenue une méthode de choix dans l’analyse génotypique. Elle permet notamment d’identifier des mutations ponctuelles au sein de certaines tumeurs, comme par exemple les mutations « oncogéniques » des gènes KIT et PDGFRA dans les tumeurs stromales gastro-intestinales. La PCR en temps réel, variante de la PCR conventionnelle, permet de quantifier, grâce à des sondes fluorescentes, le produit de PCR à chaque cycle de la réaction, la quantité d’émetteur fluorescent obtenu après amplification étant proportionnelle à la quantité d’amplicons produits. Elle permet de détecter des amplifications [8] ou des délétions ainsi que, après une étape préalable de transcription inverse de l’ARN en ADN, d’identifier les transcrits de fusion spécifiques de certains sarcomes [9]. Utile à la détection précoce des récidives tumorales, elle donne ainsi une idée de la quantité de tumeur présente, ce que ne font pas les méthodes de PCR conventionnelles.

L’hybridation in situ fluorescente (FISH) ou non fluorescente (CISH ou chromogenic in situ hybridization) peut être réalisée, comme la PCR et la RT-PCR, sur tissus frais ou fixés et inclus en paraffine, à l’exception des tissus fixés dans le liquide de Bouin. Elle permet de détecter des translocations, des amplifications ou des délétions de segments de chromosomes mais non des délétions de petite taille (< 100 kilobases) ni des mutations ponctuelles. Il existe plusieurs techniques de mise en évidence des translocations réciproques. L’une des plus couramment utilisées actuellement est la technique break-apart applicable aux chromosomes métaphasiques ou interphasiques [10]. Son principe est de marquer par des fluorochromes différents (ou par des chromogènes différents révélés par cytochimie dans le cas de la CISH) des régions précises d’ADN situées à proximité mais de part et d’autre des points de cassure de la translocation recherchée. S’il y a translocation, les deux sondes marquées sont séparées l’une de l’autre ; s’il n’y a pas cassure, elles restent proches l’une de l’autre ou jointes (figure 2). Le principe inverse peut également être appliqué à la détection des fusions chromosomiques. S’il y a fusion, les deux sondes deviennent proches l’une de l’autre (ou jointes) alors qu’elles restent séparées en l’absence de fusion. L’hybridation in situ est aussi un excellent moyen pour détecter une amplification de gènes d’intérêt comme HER2/neu dans le cancer du sein et MDM2 et/ou CDK4 dans les liposarcomes bien différenciés et dédifférenciés. Sur coupes tumorales, elle a l’avantage de pouvoir corréler le résultat à la morphologie. Sa réalisation est néanmoins plus délicate et plus chère que celle d’une PCR.

Bien que moins spécifique et sensible, l’immunohistochimie peut aussi être utilisée comme témoin indirect de la présence d’anomalies chromosomiques. Ainsi, l’immunomarquage par un anticorps anti-FLi1 [11] (figure 3), anti-WT1 (clone C-19) [12], anti-TFE3 [13] ou anti-INI1 [14] est utile au diagnostic, respectivement, du sarcome d’Ewing, de la tumeur desmoplasique à petites cellules rondes, des tumeurs présentant des remaniements du gène TFE3 (porté par le chromosome X) comme le sarcome alvéolaire des partie molles ou les carcinomes rénaux à cellules claires et papillaires de l’enfant, ainsi que de la tumeur rhabdoïde maligne. L’amplification des gènes MDM2 et/ou CDK4 observée dans les liposarcomes bien différenciés et dédifférenciés peut aussi être mise en évidence en utilisant des anticorps dirigés contre ces protéines.

Pourquoi détecter les anomalies chromosomiques : quel intérêt en pratique ?

Faire la différence entre tumeurs bénignes et malignes

Faire la différence entre deux sarcomes de morphologie similaire

Identifier les lésions qui appartiennent au même spectre lésionnel en dépit de morphologies différentes

Détecter une maladie résiduelle après traitement ou une rechute infraclinique

Quelques exemples d’anomalies génétiques et moléculaires caractéristiques des sarcomes : implications diagnostiques et pronostiques

Sarcome d’Ewing et tumeur neuroectodermique périphérique primitive (PNET)

Rhabdomyosarcomes

Dans les rhabdomyosarcomes embryonnaires, les modifications génétiques ne sont pas aussi spécifiques. Même si la perte allélique du chromosome 11 dans la région 11p15.5 semble être fréquente, elle n’est pas suffisamment spécifique ni suffisamment sensible pour pouvoir servir de marqueur diagnostique, alors que l’aneuploïdie qui se caractérise par le gain d’un chromosome entier (en particulier des chromosomes 2, 7, 8,12, 13, 17, 18 et/ou 19) permet d’orienter le diagnostic. Dans le contexte d’un rhabdomyosarcome, sans pouvoir l’établir de manière formelle, le gain de chromosomes peut être détecté soit par analyse du caryotype, soit par hybridation in situ sur coupes tissulaires avec des sondes centromériques des chromosomes concernés.

Sarcome synovial

Liposarcomes

Les liposarcomes bien différenciés, comprenant les variantes adipocytaires, sclérosantes et/ou inflammatoires et, peut-être, à cellules fusiformes, peuvent présenter des aspects morphologiques extrêmement variables et posent au pathologiste des problèmes de diagnostic différentiel importants. Ils peuvent notamment être confondus avec des lésions bénignes (lipome remanié, lipome pléomorphe/à cellules fusiformes, lipoblastome, angiomyolipome, pseudo-tumeur inflammatoire). Les liposarcomes dédifférenciés ont tendance à être confondus avec les autres sarcomes à cellules fusiformes ou pléomorphes (léiomyosarcome, myxofibrosarcome, fibrosarcome). Il est important de faire la différence entre liposarcome dédifférencié et ces autres sarcomes pléomorphes car les premiers ont une évolution plus indolente et un risque métastatique moindre (15-20 % des cas) que les seconds. Au caryotype, les liposarcomes bien différenciés se caractérisent par la présence d’un chromosome en anneau ou d’un chromosome géant surnuméraire porteur d’une amplification de la région chromosomique 12q13-15 [21, 40]. Plusieurs gènes siègeant dans cette région sont susceptibles d’être amplifiés dont les plus intéressants sont HMGA2 (high mobility group-A2), SAS (sarcoma amplified sequence), CDK4 (cyclin dependent kinase 4) et MDM2 (murine double minute-2). La découverte de ces mêmes anomalies génétiques dans les liposarcomes dédifférenciés a conduit à les inclure dans un même groupe lésionnel regroupant liposarcomes bien différenciés et dédifférenciés. Le phénomène de dédifférenciation s’accompagne néanmoins d’anomalies génétiques surajoutées, notamment dans les régions chromosomiques 1p32, 12q24 et 6q23, ce qui expliquerait leur plus grande agressivité et leur capacité à perdre le caractère lipogénique tant sur le plan morphologique que biologique [42]. L’amplification de MDM2 et de CDK4, que l’on observe dans les liposarcomes bien différenciés et dédifférenciés, peut être détectée par PCR quantitative, FISH ou, indirectement, par immunohistochimie [43, 44]. L’utilisation d’anticorps dirigés contre les protéines MDM2 et CDK4 est le moyen le plus facile pour confirmer le diagnostic, notamment lorsque se pose le problème du diagnostic différentiel entre un liposarcome bien différencié et un lipome remanié ou entre un liposarcome dédifférencié et toutes les autres tumeurs à cellules fusiformes/pléomorphes que l’on peut rencontrer dans le rétropéritoine, le pelvis, le creux inguinal ou la cuisse. En général, plus la tumeur sera dédifférenciée, plus elle aura tendance à exprimer les protéines MDM2 et/ou CDK4 [43]. La mise en œuvre de ces méthodes de détection de l’amplification ou de l’expression de MDM2 et CDK4 a montré que la plupart des tumeurs du rétropéritoine appelées auparavant histiocytomes fibreux malins pléomorphes ou inflammatoires n’étaient en fait que des liposarcomes dédifférenciés méconnus et non diagnostiqués [45, 46]. Récemment, il a été aussi démontré que les liposarcomes dédifférenciés qui présentaient une différenciation hétérologue à type de léiomyosarcome ou rhabdomyosarcome avaient un pronostic identique à ceux qui ne la présentaient pas et avaient significativement moins tendance à métastaser que les léiomyosarcomes et rhabdomyosarcomes purs [47]. L’expression des protéines MDM2 et CDK4 est conservée dans les foyers hétérologues, permettant ainsi de différencier les liposarcomes dédifférenciés des autres sarcomes myogéniques.

Les liposarcomes myxoïdes (environ un tiers des liposarcomes) se développent de préférence dans les tissus mous profonds des extrémités et, dans plus de deux tiers des cas, dans les muscles de la cuisse [20, 21]. Ils se caractérisent par une translocation t(12;16) spécifique impliquant le gène DDIT3 (DNA-damage-inducible transcript 3, anciennement appelé CHOP ou GADD153) situé en 12q13 et le gène FUS (anciennement appelé TLS) situé en 16p11 [21, 40]. Cette même translocation est observée dans les liposarcomes à cellules rondes, qui sont plus agressifs en termes de dissémination métastatique et sont désormais appelés liposarcomes myxoïdes peu différenciés [20]. Le gène DDIT3 est un facteur de transcription mais aussi un régulateur transcriptionnel. Il est impliqué dans la différenciation adipocytaire, l’érythropoïèse et la croissance cellulaire. Son rôle d’inhibiteur de la croissance cellulaire est annulé par la translocation [21]. Le gène FUS possède un domaine de liaison à l’ARN et présente une grande homologie de structure avec le gène EWS. Il n’est donc pas surprenant qu’une variante de la translocation t(12;16) retrouvée dans les liposarcomes myxoïdes soit la translocation t(12;22) qui implique DDIT3 et EWS [21, 40]. Il est parfois difficile de faire la différence, sur le plan morphologique, entre un liposarcome myxoïde bien différencié et un liposarcome bien différencié comportant d’importants remaniements myxoïdes. Le marquage par MDM2 et CDK4 ainsi que la recherche des translocations du liposarcome myxoïde se révèlent alors utiles pour le diagnostic différentiel. De même, la présence de gènes de fusion FUS-DDIT3 ou EWS-DDIT3 permet de faire la différence entre un liposarcome myxoïde et un myxofibrosarcome de faible grade de malignité et entre un liposarcome myxoïde et un myxome intramusculaire montrant une vascularisation plexiforme bien développée. La présence de ces gènes de fusion dans une tumeur à cellules rondes ressemblant à un carcinome, un lymphome ou une variante cellulaire de chondrosarcome myxoïde extrasquelettique permet d’affirmer le diagnostic de liposarcome myxoïde peu différencié.

Les liposarcomes pléomorphes présentent des anomalies chromosomiques complexes, sans signes distinctifs potentiellement utiles au diagnostic ou au pronostic. Récemment, il a été montré que des liposarcomes pléomorphes et des myxofibrosarcomes de haut grade partageaient certaines anomalies chromosomiques, soulevant la question d’une parenté entre ces deux types lésionnels. Cette hypothèse est confortée par l’existence de similitudes morphologiques entre liposarcomes pléomorphes et myxofibrosarcomes.

Tumeurs stromales gastro-intestinales

Sur le plan moléculaire, les GIST (y compris la variante GANT ou gastrointestinal autonomic nerve tumor, appelée aussi plexosarcome) contiennent des mutations activatrices du gène KIT à l’origine d’une activité anormale et incontrôlée de la protéine correspondante qui est un récepteur membranaire à activité tyrosine kinase [48-51]. Ces mutations sont présentes dans plus de 90 % des GIST, y compris dans celles de petite taille (< 1 cm) , phénomène donnant à penser que la présence de ces mutations joue un rôle important dans l’acquisition du potentiel malin. Les GIST survenant dans la triade de Carney ainsi que celles qui surviennent chez les enfants et chez les patients porteurs d’une neurofibromatose de type 1 (maladie de von Recklinghausen) sont souvent dépourvues de mutations [48, 49]. Dans 70 % des cas, les mutations de KIT siègent dans l’exon 11, touchant le domaine juxtamembranaire intracellulaire. Dans 5 à 10 % des cas, elles siègent dans l’exon 9, touchant le domaine juxtamembranaire extracellulaire et, dans 5 % des cas, dans l’exon 13, touchant le domaine activité kinase I. Rarement (< 5 %), elles se situent dans l’exon 17, touchant la boucle d’activation de KIT [51]. La protéine KIT mutée est activée de façon constitutionnelle en l’absence de toute liaison avec son ligand.

Les GIST montrent une expression membranaire ou membranaire et cytoplasmique de KIT en immunohistochimie dans 85 à 95 % des cas. L’anticorps recommandé pour mettre en évidence cette expression est l’anticorps polyclonal anti-KIT (anti-CD117), clone A4502 (Dakopatts, Glostrup, Danemark). Il existe deux autres marqueurs relativement spécifiques et sensibles des GIST : DOG1 (pas d’anticorps encore commercialisé pour cette protéine) et la protéine kinase C thêta (PKCθ) qui est une sérine/thréonine kinase [48, 49]. Ces protéines sont exprimées dans toutes les GIST, y compris celles qui sont négatives pour KIT ou pour le PDGFRA.

Trois à 5 % des GIST n’expriment pas la protéine KIT. Parmi ces tumeurs, 10 à 15 % contiennent pourtant des mutations du gène KIT lorsqu’elles sont examinées sur le plan moléculaire (ainsi l’absence d’expression de la protéine KIT n’exclut pas le diagnostic de GIST et la détection des mutations de KIT est indiquée en cas de GIST KIT-négative). Trente à 65 % des GIST KIT-négatives contiennent des mutations activatrices du récepteur alpha du gène PDGF (platelet derived growth factor) (PDGFRA) [48-51]. Ces GIST KIT-négatives mais PDGFRA-positives sont sensibles au traitement par imatinib mésylate, sauf si la mutation est de type D842V (située dans l’exon 18 de PDGFRA). Elles sont souvent de morphologie épithélioïde et s’observent le plus fréquemment dans l’estomac et en situation extradigestive (mésentère, péritoine) [48, 49]. Les mutations de KIT et PDGFRA sont mutuellement exclusives.

Le devenir des GIST, l’intervalle de temps précédant la rechute, la réponse au traitement par l’imatinib et la survie globale sont corrélés à la localisation anatomique de la tumeur et au type de mutation en cause. Les mutations qui siègent sur l’exon 11 de KIT sont associées à une meilleure réponse au traitement par l’imatinib mésylate que celles qui sont sur l’exon 9 [52]. Les mutations sur les exons 13 et 17 et les GIST dépourvues de mutations sont souvent peu sensibles, voire résistantes, au traitement par imatinib [48, 49, 52]. La dose d’imatinib mésylate à administrer au patient est aussi fonction des mutations en cause. Si le patient présente une GIST avec mutations dans l’exon 11 de KIT, l’administration de 400 ou de 800 mg/j d’imatinib mésylate n’aura pas une influence déterminante sur la survie sans progression de la maladie. En revanche, s’il est porteur d’une GIST avec mutations dans l’exon 9 de KIT, l’administration de 800 mg/j d’imatinib mésylate (au lieu de 400) améliore significativement la survie sans progression et doit donc être recommandée [52]. Cela signifie que la recherche des mutations de KIT (et PDGFRA) devra maintenant être effectuée pour tout patient devant recevoir un traitement par imatinib mésylate afin de pouvoir lui donner le traitement et la dose adéquats d’emblée.

Dans les tumeurs avancées, des anomalies génomiques surajoutées (mutations secondaires ou amplification de KIT et PDGFRA, perte complète ou partielle des chromosomes 14q, 22q, 1p, 15q et 9q, altérations de p16^INK4, amplification de MDM2 et/ou CCND1, etc.) sont parfois responsables d’une résistance acquise à l’imatinib mésylate. Ces patients insensibles à l’imatinib mésylate peuvent néanmoins bénéficier de traitements anti-tyrosine kinase alternatifs comme le sunitinib (SU11248) ou le nilotinib (AMN107).

Tumeur rhabdoïde maligne

Conclusion

Références

2 Helman LJ, Meltzer P. Mechanisms of sarcoma development. Nat Rev Cancer 2003 ; 3 : 685-94.

3 Bridge JA, Sandberg AA. Cytogenetic and molecular genetic techniques as adjunctive approaches in the diagnosis of bone and soft tissue tumors. Skeletal Radiol 2000 ; 29 : 249-58.

4 Qian X, Jin L, Shearer BM, Ketterling RP, Jalal SM, Lloyd RV. Molecular diagnosis of Ewing’s sarcoma/primitive neuroectodermal tumor in formalin-fixed paraffin-embedded tissues by RT-PCR and fluorescence in situ hybridization. Diagn Mol Pathol 2005 ; 14 : 23-8.

5 Schleiermacher G, Peter M, Oberlin O, Philip T, Rubie H, Mechinaud F, et al. Increased risk of systemic relapses associated with bone marrow micrometastasis and circulating tumor cells in localized ewing tumor. J Clin Oncol 2003 ; 21 : 85-91.

6 Avigad S, Cohen IJ, Zilberstein J, Liberzon E, Goshen Y, Ash S, et al. The predictive potential of molecular detection in the nonmetastatic Ewing family of tumors. Cancer 2004 ; 100 : 1053-8.

7 Kaplan JC, Delpech M. Biologie moléculaire et médecine. 2^e éd. Paris : Flammarion Médecine-Sciences, 1993.

8 Hostein I, Pelmus M, Aurias A, Pedeutour F, Mathoulin-Pélissier S, Coindre JM. Evaluation of MDM2 and CDK4 amplification by real-time PCR on paraffin wax-embedded material : a potential tool for the diagnosis of atypical lipomatous tumours/well-differentiated liposarcomas. J Pathol 2004 ; 202 : 95-102.

9 Coindre JM, Hostein I, Terrier P, Bouvier-Labit C, Collin F, Michels J, et al. Diagnosis of clear cell sarcoma by real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction analysis of paraffin embedded tissues. Cancer 2006 ; 107 : 1055-64.

10 Yamaguchi U, Hasegawa T, Morimoto Y, Tateishi U, Endo M, Nakatani F, et al. A practical approach to the clinical diagnosis of Ewing’s sarcoma/primitive neuroectodermal tumour and other small round cell tumours sharing EWS rearrangement using new fluorescence in situ hybridization probes for EWSR1 on formalin-fixed, paraffin wax embedded tissue. J Clin Pathol 2005 ; 58 : 1051-6.

11 Folpe AL, Hill CE, Parham DM, O’Shea PA, Weiss SW. Immunohistochemical detection of FLi-1 protein expression : a study of 132 round cell tumors with emphasis on CD99-positive mimics of Ewing’s sarcoma/primitive neuroectodermal tumor. Am J Surg Pathol 2000 ; 24 : 1657-62.

12 Barnoud R, Sabourin JC, Pasquier D, Ranchere D, Bailly C, Terrier-Lacombe MJ, et al. Immunohistochemical expression of WT1 by desmoplastic small round cell tumor : a comparative study with other small round cell tumors. Am J Surg Pathol 2000 ; 24 : 830-6.

13 Argani P, Lal P, Hutchinson B, Lui MY, Reuter VE, Ladanyi M. Aberrant nuclear immunoreactivity for TFE3 in neoplasms with TFE3 gene fusions : a sensitive and specific immunohistochemical assay. Am J Surg Pathol 2003 ; 27 : 750-61.

14 Bourdeaut F, Fréneaux P, Thuille B, Lellouch-Tubiana A, Nicolas A, Couturier J, et al. hSNF5/INI1-deficient tumours and rhabdoid tumours are convergent but not fully overlapping entities. J Pathol 2007 ; 211 : 323-30.

15 Evans HL. Low-grade fibromyxoid sarcoma : a report of two metastasizing neoplasms having a deceptively benign appearance. Am J Clin Pathol 1987 ; 88 : 615-9.

16 Mertens F, Fletcher C, Antonescu CR, Coindre JM, Colecchia M, Domanski HA, et al. Clinicopathologic and molecular genetic characterization of low-grade fibromyxoid sarcoma, and cloning of a novel FUS/CREB3L1 fusion gene. Lab Invest 2005 ; 85 : 408-15.

17 Guillou L, Benhattar J, Gengler C, Gallagher G, Ranchère-Vince D, Collin F, et al. Translocation-positive low-grade fibromyxoid sarcoma : clinicopathologic and molecular analysis of a series expanding the morphologic spectrum and suggesting potential relationship to sclerosing epithelioid fibrosarcoma. A study from the French Sarcoma Group. Am J Surg Pathol 2007 ; (in press).

18 Sirvent N, Maire G, Pedeutour F. Genetics of dermatofibrosarcoma protuberans family of tumors : from ring chromosomes to tyrosine kinase inhibitor treatment. Genes Chromosomes Cancer 2003 ; 37 : 1-19.

19 Terrier-Lacombe MJ, Guillou L, Maire G, Terrier P, Vince DR, de Saint Aubain Somerhausen N, et al. Dermatofibrosarcoma protuberans, giant cell fibroblastoma, and hybrid lesions in children : clinicopathologic comparative analysis of 28 cases with molecular data — a study from the French Federation of Cancer Centers Sarcoma Group. Am J Surg Pathol 2003 ; 27 : 27-39.

20 In : Fletcher CDM, Unni KK, Mertens F, eds. World Health Organization classification of tumors. Pathology and genetics of tumours of soft tissue and bone. Lyon : IARC Press, 2002.

21 Sandberg AA. Updates on the cytogenetics and molecular genetics of bone and soft tissue tumors. Liposarcoma. Cancer Genet Cytogenet 2004 ; 155 : 1-24.

22 Fagnou C, Michon J, Peter M, Bernoux A, Oberlin O, Zucker JM, et al. Presence of tumor cells in bone marrow but not in blood is associated with adverse prognosis in patients with Ewing’s tumor. J Clin Oncol 1998 ; 16 : 1707-11.

23 Athale UH, Shurtleff SA, Jenkins JJ, Poquette CA, Tan M, Downing JR, et al. Use of reverse transcriptase polymerase chain reaction for diagnosis and staging of alveolar rhabdomyosarcoma, Ewing sarcoma family of tumors, and desmoplastic small round cell tumor. J Pediatr Hematol Oncol 2001 ; 23 : 99-104.

24 Kelly KM, Womer RB, Barr FG. Minimal disease detection in patients with alveolar rhabdomyosarcoma using a reverse transcriptase-polymerase chain reaction method. Cancer 1996 ; 78 : 1320-7.

25 Yaniv I, Cohen IJ, Stein J, Zilberstein J, Liberzon E, Atlas O, et al. Tumor cells are present in stem cell harvests of Ewings sarcoma patients and their persistence following transplantation is associated with relapse. Pediatr Blood Cancer 2004 ; 42 : 404-9.

26 West DC, Grier HE, Swallow MM, Demetri GD, Granowetter L, Sklar J. Detection of circulating tumor cells in patients with Ewing’s sarcoma and peripheral primitive neuroectodermal tumor. J Clin Oncol 1997 ; 15 : 583-8.

27 Riggi N, Stamenkovic I. The biology of Ewing sarcoma. Cancer Lett 2007 ; 254 : 1-10.

28 De Alava E, Kawai A, Healey JH, Fligman I, Meyers PA, Huvos AG, et al. EWS-FLI1 fusion transcript structure is an independent determinant of prognosis in Ewing’s sarcoma. J Clin Oncol 1998 ; 16 : 1248-55.

29 Zoubek A, Dockhorn-Dworniczak B, Delattre O, Christiansen H, Niggli F, Gatterer-Menz I, et al. Does expression of different EWS chimeric transcripts define clinically distinct risk groups of Ewing tumor patients? J Clin Oncol 1996 ; 14 : 1245-51.

30 Huang HY, Illei PB, Zhao Z, Mazumdar M, Huvos AG, Healey JH, et al. Ewing sarcomas with p53 mutation or p16/p14ARF homozygous deletion : a highly lethal subset associated with poor chemoresponse. J Clin Oncol 2005 ; 23 : 548-58.

31 Hostein I, Andraud-Fregeville M, Guillou L, Terrier-Lacombe MJ, Deminiere C, Ranchere D, et al. Rhabdomyosarcoma : value of myogenin expression analysis and molecular testing in diagnosing the alveolar subtype. Cancer 2004 ; 101 : 2817-24.

32 Wachtel M, Dettling M, Koscielniak E, Stegmaier S, Treuner J, Simon-Klingenstein K, et al. Gene expression signatures identify rhabdomyosarcoma subtypes and detect a novel t(2;2) (q35;p23) translocation fusing PAX3 to NCOA1. Cancer Res 2004 ; 64 : 5539-45.

33 Wachtel M, Runge T, Leuschner I, Stegmaier S, Koscielniak E, Treuner J, et al. Subtype and prognostic classification of rhabdomyosarcoma by immunohistochemistry. J Clin Oncol 2006 ; 24 : 816-22.

34 Kelly KM, Womer RB, Sorensen PHB, Xiong QB, Barr FG. Common and variant gene fusions predict distinct clinical phenotypes in rhabdomyosarcoma. J Clin Oncol 1997 ; 15 : 1831-6.

35 Sorensen PH, Lynch JC, Qualman SJ, Tirabosco R, Lim JF, Maurer HM, et al. PAX3-FKHR and PAX7-FKHR gene fusions are prognostic indicators in alveolar rhabdomyosarcoma : a report from the Children’s Oncology Group. J Clin Oncol 2002 ; 20 : 2672-9.

36 Thomson B, Hawkins D, Felgenhauer J, Radich JP. RT-PCR evaluation of peripheral blood, bone marrow and peripheral blood stem cells in children and adolescents undergoing VACIME chemotherapy for Ewing’s sarcoma and alveolar rhabdomyosarcoma. Bone Marrow Transplant 1999 ; 24 : 527-33.

37 Guillou L, Coindre JM, Gallagher G, Terrier P, Gebhard S, De Saint Aubain Somerhausen N, et al. Detection of the synovial sarcoma translocation t(X;18)(SYT;SXX) in paraffin-embedded tissues using reverse transcriptase-polymerase chain reaction : a reliable and powerful diagnostic tool for the pathologists. A molecular analysis of 221 mesenchymal tumors fixed in different fixatives. Hum Pathol 2001 ; 32 : 105-12.

38 Ladanyi M, Antonescu CR, Leung DH, Woodruff JM, Kawai A, Healey JH, et al. Impact of SYT-SSX fusion type on the clinical behavior of synovial sarcoma : a multi-institutional retrospective study of 243 patients. Cancer Res 2002 ; 62 : 135-40.

39 Guillou L, Benhattar J, Bonichon F, Gallagher G, Terrier P, Stauffer E, et al. Histologic grade, but not SYT-SSX fusion type, is an important prognostic factor in patients with synovial sarcoma : a multicenter, retrospective analysis. J Clin Oncol 2004 ; 22 : 4040-50.

40 Pedeutour F, Maire G, Sirvent N. De la cytogénétique à la cytogénomique des tumeurs adipocytaires. 2) Tumeurs adipocytaires malignes. Bull Cancer 2004 ; 91 : 317-23.

41 Pedeutour F, Fo C. De la cytogénétique à la cytogénomique des tumeurs adipocytaires. 1) Tumeurs adipocytaires bénignes. Bull Cancer 2002 ; 89 : 689-95.

42 Chibon F, Mariani O, Derre J, Mairal A, Coindre JM, Guillou L, et al. ASK1 (MAP3K5) as a potential therapeutic target in malignant fibrous histiocytomas with 12q14-q15 and 6q23 amplifications. Genes Chromosomes Cancer 2004 ; 40 : 32-7.

43 Binh MB, Sastre-Garau X, Guillou L, Pinieux GD, Terrier P, Lagace R, et al. MDM2 and CDK4 immunostainings are useful adjuncts in diagnosing well-differentiated and dedifferentiated liposarcoma subtypes : a comparative analysis of 559 soft tissue neoplasms with genetic data. Am J Surg Pathol 2005 ; 29 : 1340-7.

44 Sirvent N, Coindre JM, Maire G, Hostein I, Keslair F, Guillou L, et al. Detection of MDM2-CDK4 amplification by fluorescence in situ hybridization (FISH) in 200 paraffin-embedded tumor samples : utility in the differential diagnostic approach of adipocytic lesions and comparison with immunohistochemistry and real time PCR. Am J Surg Pathol 2007 ; (in press).

45 Coindre JM, Mariani O, Chibon F, Mairal A, De Saint Aubain Somerhausen N, Favre-Guillevin E, et al. Most malignant fibrous histiocytomas developed in the retroperitoneum are dedifferentiated liposarcomas : a review of 25 cases initially diagnosed as malignant fibrous histiocytoma. Mod Pathol 2003 ; 16 : 256-62.

46 Coindre JM, Hostein I, Maire G, Derre J, Guillou L, Leroux A, et al. Inflammatory malignant fibrous histiocytomas and dedifferentiated liposarcomas : histological review, genomic profile, and MDM2 and CDK4 status favour a single entity. J Pathol 2004 ; 203 : 822-30.

47 Bui Nguyen Binh M, Guillou L, Hostein I, Chateau MC, Collin F, Aurias A, et al. Dedifferentiated liposarcomas with divergent myosarcomatous differentiation developed in the internal trunk : clinicopathologic analysis of a series and comparison to conventional dedifferentiated liposarcomas and leiomyosarcomas. Am J Surg Pathol 2007 ; (in press).

48 Rubin BP. Gastrointestinal stromal tumours : an update. Histopathology 2006 ; 48 : 83-96.

49 Miettinen M, Lasota J. Gastrointestinal stromal tumors : review on morphology, molecular pathology, prognosis, and differential diagnosis. Arch Pathol Lab Med 2006 ; 130 : 1466-78.

50 Blay JY, Landi B, Bonvalot S, Monges G, Ray-Coquard I, Duffaud F, et al. Recommandations pour la prise en charge des tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST). Bull Cancer 2005 ; 92 : 907-18.

51 Corless CL, Fletcher JA, Heinrich MC. Biology of gastrointestinal stromal tumors. J Clin Oncol 2004 ; 22 : 3813-25.

52 Debiec-Rychter M, Sciot R, Le Cesne A, Schlemmer M, Hohenberger P, Van Oosterom AT, et al. KIT mutations and dose selection for imatinib in patients with advanced gastrointestinal tumours. Eur J Cancer 2006 ; 42 : 1093-103.

53 Biegel JA, Tan L, Zhang F, Wainwright L, Russo P, Rorke LB. Alterations of the hSNF5/INI1 gene in central nervous system atypical teratoid/rhabdoid tumors and renal and extrarenal rhabdoid tumors. Clin Cancer Res 2002 ; 8 : 3461-7.

54 Modena P, Lualdi E, Facchinetti F, Galli L, Teixeira MR, Pilotti S, et al. SMARCB1/INI1 tumor suppressor gene is frequently inactivated in epithelioid sarcomas. Cancer Res 2005 ; 65 : 4012-9.

55 Hornick JL, Dal Cin P, Fletcher CDM. Loss of INI1 expression is characteristic of both conventional and proximal-type epithelioid sarcoma. Mod Pathol 2007 ; 20 : 16A ; (abstr 52).

56 Cho YM, Choi J, Lee OJ, Lee HI, Jong D, Ro JY. SMARCB1/INI1 missense mutation in mucinous carcinoma with rhabdoid features. Pathol Int 2006 ; 56 : 702-6.