ARTICLE
Auteur(s) : Olivier Michielin
Centre du cancer de Lausanne, Centre national de compétence en
recherche, oncologie moléculaire, Lausanne, Institut suisse de
bio-informatique, Lausanne, Institut Ludwig de recherche sur le
cancer, branche lausannoise
Article reçu le 26 Mars 2007, accepté le 10 Avril 2007
Les techniques de détermination structurale des protéines ont amené
un bouleversement profond dans notre compréhension des mécanismes
de reconnaissance moléculaire. Les deux techniques les plus
couramment utilisées sont la cristallographie aux rayons X et la
résonance magnétique nucléaire. L’une ou l’autre de ces techniques
permet la détermination au niveau atomique de l’architecture d’une
protéine libre ou liée à un autre partenaire et donc de comprendre
quelles sont les interactions principales responsables de
l’association. À ce jour, nous disposons d’environ 50 000 protéines
dont la structure a été résolue et déposée dans une banque de
donnée mondiale appelée la Protein Data Bank ou PDB (www.pdb.org)
en accès libre. En raison d’une grande redondance dans les familles
de protéines étudiées, le contenu de la PDB ne couvre qu’un faible
pourcentage des différents types de repliements estimé dans le
protéome humain. Afin de combler ce fossé, des projets de génomique
structurale ont été lancés tant aux États-Unis qu’en Europe avec
pour but la détermination structurale de toute protéine dont la
séquence est suffisamment divergente de structures déjà connues.
Ces projets devraient permettre d’avoir à disposition une structure
pour une grande majorité de séquences d’intérêt médical dans les
années à venir, étendant par là le domaine d’application des
méthodes structurales présentées dans cet article.La connaissance
structurale d’une protéine, libre ou complexée, à un partenaire est
une étape nécessaire mais non suffisante à la compréhension des
mécanismes de reconnaissance moléculaire. Les protéines sont, en
effet, des molécules flexibles et dynamiques, et les fluctuations
thermiques modulent les interactions statiques déterminées par les
structures expérimentales. Il existe donc un fossé entre la
structure et la fonction d’une protéine qui ne peut être comblé
qu’en faisant appel à des méthodes modernes de modélisation
moléculaire. Dans de telles approches, les protéines sont simulées
de manière numérique sur des ordinateurs puissants, permettant de
reproduire in silico leurs aspects dynamiques. De telles
simulations de dynamique moléculaire prennent en compte toutes les
interactions, à savoir les interactions électrostatiques, de van
der Waals, les liaisons covalentes, les liaisons hydrogène et, bien
entendu, toutes les interactions avec les molécules d’eau qui
entourent la protéine. Ces méthodes nécessitent des ressources de
calcul très importantes, mais permettent, à partir de la structure
d’une protéine, de déterminer son affinité pour un ligand ou la
modification de cette affinité lors d’une mutation d’un acide
aminé. Elles permettent ainsi de franchir le pas entre la structure
et la fonction biologique.De par le caractère universel des
interactions utilisées dans les études de dynamique moléculaire, il
est possible d’utiliser ces méthodes dans des projets très
appliqués de recherche translationnelle pour lesquels les
structures des protéines en question sont connues. Une telle
approche a été mise sur pied il y a plusieurs années à Lausanne.
Plusieurs instituts sont impliqués : l’Institut suisse de
bio-informatique (www.isb-sib.ch), l’Institut Ludwig de recherche
sur le cancer (www.licr.org), le Centre national de compétence en
recherche en oncologie moléculaire (www.nccr-oncology.ch) et,
enfin, le Centre du cancer de Lausanne (www.cancer-chuv.ch). La
présence de ces différents instituts permet de mettre en place une
approche translationnelle avec des données de patient comme point
de départ, un design moléculaire utilisant des méthodes in silico,
la validation par des tests in vitro et, finalement, un retour au
patient avec des molécules effectrices nouvelles.Dans ce qui suit,
nous allons illustrer comment ces différentes approches s’intègrent
dans l’optimisation rationnelle de séquences de récepteurs de
lymphocytes T tueurs, avec pour but thérapeutique une utilisation
en immunothérapie du mélanome par transfert adoptif de lymphocytes
génétiquement modifiés, comme représenté dans la figure 1. Cette
approche illustre bien la démarche translationnelle puisque les
données de départ proviennent du patient chez qui des cellules T
particulières sont sélectionnées in vivo. Ces cellules sont
soumises à des étapes d’ingénierie moléculaire et cellulaire afin
de les optimiser avant de les réinjecter au patient. Le processus
réalise donc une boucle qui part du patient et y revient après
plusieurs étapes intermédiaires faisant appel aux sciences de base.
Le complexe TCR-p-MHC
La reconnaissance, par le récepteur (TCR) des lymphocytes T tueurs,
de peptides immunogéniques (p) présentés par le complexe majeur
d’histocompatibilité de classe I (CMH) est l’étape clé dans la
réponse cellulaire spécifique contre les cellules tumorales. En
raison de leurs aberrations génétiques, ces dernières expriment en
effet des peptides anormaux à leur surface à travers leur CMH. Il
existe plusieurs groupes de peptides anormaux dans les tumeurs,
dont les peptides dérivés d’antigènes Cancer-Testis, qui ne sont
exprimés que dans les cancers et les cellules testiculaires, et les
peptides dérivés d’antigènes de différenciation, qui sont également
présents sur les cellules saines dont dérive la tumeur. Les
antigènes Cancer-testis ont l’avantage de la spécificité, mais leur
expression est souvent moins ubiquitaire dans les tumeurs que celle
des antigènes de différenciation. Une liste complète et
régulièrement mise à jour des différents antigènes tumoraux est
disponible sur le site www.cancerimmunity.org. Dans ce qui suit,
nous parlerons en particulier de deux antigènes des cellules de
mélanome, l’antigène NY-ESO1 du type Cancer-testis et l’antigène
Melan-A du type différenciation.
Les complexes p-CMH, ou épitopes, sont détectés par le système
immunitaire et induisent une réponse cellulaire spécifique. Cette
réponse est composée de différents lymphocytes, chacun caractérisé
par un TCR donné. L’ensemble des TCR spécifiques contre un épitope
forme le répertoire immunitaire spécifique. Ce répertoire peut être
large avec plusieurs centaines ou milliers de séquences le
composant ou, au contraire, restreint avec quelques séquences très
sélectionnées. La figure 2 montre un
alignement de quelques séquences composant le répertoire spécifique
contre l’épitope Melan-A. Ces répertoires ont été obtenus chez des
patients atteints de mélanomes en utilisant des tétramères de p-CMH
comme sondes dans des expériences de cytométrie de flux [1]. Le
répertoire anti-Melan-A comprend plusieurs centaines de séquences
et les séquences sélectionnées dans la figure 2 permettent
d’en apprécier la diversité sur une sélection aléatoire.
La sélection des différentes séquences qui composent le
répertoire spécifique se fait sur la base de l’affinité du TCR pour
le p-CMH. L’affinité du TCR est la résultante de toutes les
interactions (électrostatiques, hydrogène ou van der Waals) qui
peuvent être formées entre le TCR et son ligand. On comprend donc
l’intérêt de l’approche structurale dans la compréhension des
motifs tridimensionnels sélectionnés dans la réponse immunitaire
contre un épitope donné. La première structure d’un TCR lié à un
complexe p-CMH remonte à 1996 [2]. Depuis, un peu plus d’une
dizaine de complexes ont été déterminés par cristallographie aux
rayons X. Le TCR est un hétérodimère très similaire, dans sa
partie de reconnaissance du p-CMH, à une immunoglobuline. Le site
de liaison, appelé CDR pour complementarity determining regions,
est formé de 6 boucles variables, 3 provenant de la chaîne α
et 3 de la chaîne β (figure 3). Les boucles
CDR1 et CDR2 font des interactions principalement avec la surface
du CMH alors que les boucles CDR3, beaucoup plus variables
génétiquement, interagissent avec le peptide. L’arrangement spatial
des boucles du CDR permet donc de façonner une surface qui complète
celle de l’épitope et qui réalise le plus possible d’interactions
favorables. De manière grossière, une liaison hydrogène entre le
TCR et son ligand se traduit en une augmentation de 1 à 2 ordres de
grandeurs de la constante d’affinité. Le but de l’optimisation
rationnelle du TCR consiste donc à augmenter les interactions à
haute énergie entre le TCR et son ligand.
Optimisation rationnelle des séquences de TCR
L’affinité du TCR pour son ligand est déterminée par la somme des
interactions spécifiques réalisées entre les boucles du CDR et le
complexe p-CMH. L’analyse tridimensionnelle du répertoire
spécifique contre un épitope donné permet de mettre en évidence des
motifs structuraux communs et de comprendre le mécanisme de
sélection immune. Afin de pouvoir optimiser de manière rationnelle
la séquence des boucles du CDR, il est nécessaire de déterminer la
contribution à l’affinité des différents acides aminés qui les
composent. Au vu de ce qui précède, il est nécessaire, pour obtenir
un résultat fiable, d’évaluer cette contribution sur une
trajectoire de dynamique moléculaire dans laquelle les fluctuations
des interactions sont intégrées au cours du temps.
Afin de valider l’approche, un système test a été utilisé, pour
lequel des données expérimentales de mutagenèse (alanine scanning)
étaient disponibles. Il a donc été possible d’évaluer le potentiel
prédictif de la méthode MM-GBSA basée sur la dynamique moléculaire
[3]. La figure 4 montre la
corrélation entre la valeur prédite par la méthode théorique et la
valeur expérimentale correspondante, avec un coefficient de
corrélation de - 0,76, une fois la correction entropique
effectuée. Une telle corrélation permet d’identifier les résidus
principaux dans la liaison ainsi que ceux qui n’amènent qu’une
faible contribution, ces derniers étant de bons candidats pour être
mutés. En plus de l’identification de résidus ayant un rôle
important, la simulation permet également une analyse très fine des
différentes contributions énergétiques apportées par les différents
résidus (tableau 1). En utilisant de
telles données, il est possible d’obtenir des pistes pour le choix
d’un acide aminé de remplacement. Par exemple, dans ce système, le
résidu tyrosine 31 du CDR1α a une contribution totale favorable
(ΔG = - 2,38 kcal/mol), mais sa composante de désolvatation
électrostatique polaire est clairement défavorable
(ΔG = + 3,31 kcal/mol). Ce résultat permet donc
d’envisager le remplacement de la tyrosine 31 par une
phénylalanine qui se distingue du précédent acide aminé par
l’absence du groupe hydroxyle, responsable de la partie
électrostatique polaire. Une telle substitution permet donc de
garder toutes les contributions favorables de la tyrosine tout en
éliminant la partie défavorable. De telles analyses sont à la base
de l’optimisation rationnelle des TCR contre les cibles
tumorales.
Un des aspects importants de ce programme d’optimisation
rationnelle de TCR est le choix de la cellule de départ. L’étroite
collaboration avec les groupes d’immunomonitoring humain permet en
effet de sélectionner des lymphocytes particuliers obtenus chez des
patients ayant présenté une évolution clinique favorable [4]. De
telles cellules (et TCR spécifiques) sont en effet parfois
observées en grande quantité dans le sang circulant des patients et
semblent procurer une immunité de longue durée. De tels clones sont
appelés « immunodominants » pour cette raison. Étant
donné que l’approche rationnelle permet de faire des optimisations
itératives et bien contrôlées de l’affinité du TCR pour son ligand,
il paraît particulièrement intéressant de l’appliquer à une cellule
de départ présentant un caractère immunodominant. Il est en effet
raisonnable de penser que cette propriété, qui est certainement
multifactorielle (propriétés cinétiques du TCR, relations avec le
corécepteur…), sera, dans une grande mesure, préservée dans les
mutants proposés.
tableau 1 Décomposition en contributions énergétiques
de l’interaction TCR-p-CMH. Les différentes contributions à
l’énergie libre de liaison du complexe TCR-p-CMH ont été calculées
en utilisant la méthode MM-GBSA. Tous les résidus importants de la
chaîne α sont listés [3]
|
Résidu
|
Boucle
|
|
|
|
|
|
|
|
Ser93
|
CDR3
|
0,63
|
-9,06
|
3,04
|
-0,01
|
0,17
|
-5,23
|
|
Phe100
|
CDR3
|
-3,59
|
0,74
|
1,36
|
-0,72
|
0,65
|
-3,04
|
|
Tyr31
|
CDR1
|
-3,46
|
2,37
|
3,31
|
-0,61
|
0,75
|
-2,38
|
|
Tyr50
|
CDR2
|
-3,70
|
4,02
|
5,63
|
-0,57
|
0,58
|
-2,08
|
|
Lys68
|
HV4
|
0,87
|
-56,18
|
53,34
|
-0,34
|
0,59
|
-1,72
|
|
Ser27
|
CDR1
|
-0,52
|
-5,14
|
4,32
|
-0,32
|
0,06
|
-1,60
|
|
Lys48
|
CDR2
|
0,63
|
-65,57
|
62,44
|
-0,26
|
1,25
|
-1,51
|
|
Tyr26
|
CDR1
|
-1,06
|
-1,46
|
1,79
|
-0,11
|
-0,11
|
-0,95
|
|
Ala28
|
CDR1
|
-0,73
|
0,49
|
-0,37
|
-0,33
|
0,13
|
-0,81
|
|
AlalOl
|
CDR3
|
-0,40
|
-0,38
|
0,24
|
-0,08
|
0,02
|
-0,60
|
|
Leu104
|
CDR3
|
-0,10
|
0,15
|
0,06
|
-0,00
|
0,33
|
-0,52
|
|
Ser51
|
CDR2
|
-0,57
|
-1,58
|
1,77
|
-0,46
|
0,47
|
-0,37
|
|
Gln1
|
-
|
-0,16
|
0,44
|
0,28
|
0,00
|
0,00
|
-0,32
|
|
Ala103
|
CDR3
|
-0,04
|
-0,17
|
0,11
|
0,00
|
-0,19
|
-0,29
|
|
Pro30
|
CDR1
|
-0,10
|
-3,20
|
3,14
|
0,00
|
-0,12
|
-0,28
|
|
Phe66
|
-
|
-0,08
|
0,10
|
0,18
|
0,00
|
-0,26
|
-0,26
|
|
Tyr49
|
CDR2
|
-0,21
|
0,15
|
-0,05
|
-0,00
|
-0,13
|
-0,24
|
|
Ser102
|
CDR3
|
-0,96
|
-4,31
|
5,08
|
0,17
|
0,13
|
-0,23
|
|
...
|
|
Thr29
|
CDR1
|
-0,37
|
-1,55
|
3,03
|
-0,18
|
-0,12
|
0,81
|
|
Asp53
|
CDR2
|
-0,10
|
28,56
|
-27,32
|
-0,01
|
0,02
|
1,15
|
Application à l’antigène NY-ESO1
À titre d’exemple, l’optimisation d’une séquence TCR-spécifique
pour l’antigène NY-ESO1 est présentée. Cet antigène est du type
Cancer-Testis et présente donc l’avantage d’être très spécifique
des cellules tumorales. Il est, de plus, présenté par le CMH le
plus fréquent chez les Caucasiens, HLA-A2, présent chez environ
50 % des patients. Ce TCR a été choisi car le lymphocyte T qui
en est porteur représente un des clones immunodominants
sélectionnés dans la réponse spontanée d’un patient survivant à
long terme d’un mélanome métastatique. Ce clone a, de plus, vu sa
fréquence augmenter au cours des vaccinations successives avec le
peptide NY-ESO-1 [5]. Sa présence a pu être suivie sur de
nombreuses années, procurant au patient une protection et une
survie prolongées. Finalement, de bonnes données structurales sont
également disponibles [6]. Ce TCR spécifique représente donc un
candidat idéal pour un projet d’optimisation rationnelle dans le
but d’améliorer encore la reconnaissance tumorale en augmentant son
affinité pour le complexe NY-ESO-1/HLA A2.
Pour ce faire, une simulation de dynamique moléculaire d’une
nanoseconde a été menée sur le complexe. La méthode MM-GBSA mise au
point sur le système test décrit ci-dessus a été appliquée et les
résidus clés identifiés au moyen de leur composante à l’énergie
libre de liaison. Ces données ont permis de mettre en évidence
plusieurs résidus dont l’interaction avec le p-CMH n’était pas
optimale et pour lesquels des mutations intéressantes pouvaient
être proposées. La figure 5 montre la
mutation suggérée par les calculs in silico, la chaîne latérale
modifiée étant représentée en violet transparent. Le résidu en
question appartient au CDR2 de la chaîne Vβ. Par l’approche in
silico et en essayant systématiquement différents acides aminés à
cette position, il a été possible de prédire quel acide aminé
augmenterait la liaison du TCR en faisant une interaction favorable
avec le CMH. Des approches analogues ont permis de proposer un
grand nombre de modifications faisant intervenir des résidus de la
chaîne α et de la chaîne β du TCR.
Une fois les mutations déterminées et évaluées in silico, ces
dernières peuvent être testées in vitro en exprimant le TCR et le
p-CMH de manière soluble et en mesurant son affinité par des tests
Elisa ou par Biacore. Ces constructions sont obtenues par une
approche de biologie moléculaire standard après troncation de la
partie intramembranaire. La figure 6 montre le
résultat d’un Elisa effectué pour la mutation décrite ci-dessus et
illustrée dans la figure 5. Le TCR muté
montre bien ici une affinité accrue par rapport à la séquence
naturellement sélectionnée chez le patient. Il est bien entendu
possible de combiner plusieurs mutations individuelles afin
d’amener l’affinité aux valeurs désirées pour garantir une
activation optimale du lymphocyte lors de son contact avec la
cellule tumorale. Ces travaux sont en cours.
Retour à la clinique
Une fois la séquence TCR optimale déterminée in silico et validée
in vitro par les expériences sur molécules solubles, il est
nécessaire d’évaluer l’effet des modifications sur la fonction des
lymphocytes. Dans ce but, le gène codant pour le TCR modifié est
introduit dans une cellule T dont le TCR endogène n’a pas de
réactivité croisée avec l’épitope d’intérêt. Cette procédure est
effectuée par un vecteur viral (rétrovirus ou lentivirus). À noter
que des mutations sont généralement introduites à l’interface entre
la chaîne α et la chaîne β de manière à empêcher un
appariement croisé entre les chaînes endogènes et les chaînes
introduites. Il est alors possible de tester la spécificité du
lymphocyte résultant sur des lignées tumorales et de quantifier le
gain de la ou des mutations apportées au TCR. Ces vérifications
sont actuellement en cours d’évaluation dans notre centre, mais les
résultats préliminaires sont encourageants.
Finalement, le lymphocyte T ainsi modifié sera utilisé dans des
essais cliniques de phase I. La faisabilité d’une telle
approche a récemment été montrée en utilisant une séquence TCR
naturelle sans les modifications in silico décrites ici [7]. Dans
cette étude, les lymphocytes modifiés ont pu être suivis par PCR et
il a pu être montré de remarquables réponses cliniques chez les
patients qui présentaient un taux élevé et persistant de
lymphocytes modifiés. Dans d’autres cas, la population transférée a
diminué spontanément et n’a pas procuré l’effet espéré, preuve que
certains mécanismes de régulation fine de l’homéostasie
lymphocytaire doivent encore être mieux compris avant le passage à
grande échelle dans ce genre de thérapie. Toutefois,
l’immunothérapie par transfert adoptif représente à l’heure
actuelle la plus solide option thérapeutique chez les patients
souffrant de mélanome métastatique avec des taux de réponse pouvant
atteindre jusqu’à 50 % dans certaines études [8].
Conclusion
L’approche présentée ici présente des avantages importants pour
l’optimisation de TCR. S’il existe des méthodes permettant de
sélectionner expérimentalement, parmi des séquences aléatoires,
celles qui ont la meilleure affinité, comme dans des approches de
type ribosome display [9], l’approche rationnelle permet de
maîtriser beaucoup plus finement les propriétés des TCR générés.
La méthode in silico visant à ne sélectionner que les résidus
clés à muter, la maturation de l’affinité peut se faire en ne
modifiant qu’un nombre très restreint de résidus. Le risque de
générer une réponse immunitaire contre la surface modifiée du TCR
est de ce fait réduit par rapport à des techniques de type ribosome
display, où la séquence finale peut être complètement divergente de
la séquence de départ. Le peu de modifications apportées présente
également l’avantage de conserver au mieux les propriétés générales
du TCR sélectionné dont la fonction est plus modulée que
reconstituée de novo. La sélection de la cellule immunodominante de
départ est donc cruciale. Il paraît donc clair qu’une telle
approche doit s’inscrire dans un projet de recherche
translationnelle qui part d’un immunomonitoring fin des patients.
De plus, les résultats des premières études cliniques vont
permettre de repenser les modifications de séquences
apportées ; en effet, si les TCR générés ne sont pas assez
spécifiques et induisent une auto-immunité, il sera possible de
privilégier les optimisations faisant intervenir des contacts avec
le peptide spécifique de la tumeur par rapport aux contacts faisant
intervenir le CMH qui est commun à toutes les cellules.
Il apparaît donc qu’une des clés du succès d’une telle approche
réside dans l’intégration étroite des données issues des patients
avec celles du laboratoire et qu’un tel scénario n’est possible que
dans un effort de recherche translationnelle impliquant de nombreux
acteurs.
Remerciements
Les travaux présentés dans cet article ne peuvent être envisagés
que dans le cas d’une large collaboration translationnelle. La
liste des personnes impliquées est trop longue pour être mentionnée
de manière exhaustive, mais les principaux acteurs sont listés
ci-dessous. Les Dr Pedro Romero et Daniel Speiser sont
responsables des aspects d’immunologie moléculaire au sein de
l’Institut Ludwig (LICR) et du Centre du cancer de Lausanne (CCL).
Ils sont notamment en charge des essais cliniques de vaccination
active basée sur des peptides. Le Dr Nathalie Rufer est
responsable de l’immunomonitoring spécifique chez le patient dans
le cadre du projet NCCR Molecular Oncology. La plupart des
séquences TCR utilisées proviennent de son activité. Elle est, de
plus, responsable du projet de transfert par vecteur viral des TCR
optimisés dans des populations de lymphocytes cibles. L’expression
de TCR solubles et les mesures préliminaires d’affinité ont été
réalisées par le Dr Melita Irving, le Dr Muriel André et
le Dr Dafné Schmidt. Le Dr Vincent Zoete est, finalement,
un des acteurs principaux dans les aspects de modélisation
moléculaire. Il est responsable de recherche au sein du Groupe de
modélisation moléculaire de l’Institut suisse de bio-informatique.
Vincent Zoete a dirigé Mathias Ferber qui a participé à l’étude du
récepteur NY-ESO-1.
Références
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Speiser D, Rimoldi D, et al. Tetramer-guided
analysis of TCR beta-chain usage reveals a large repertoire of
melan-A-specific CD8+ T cells in melanoma patients. J Immunol
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Biddison WE, Wiley D. Structure of the complex between
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Lissin NM, Wooldridge L, Choi EM, et al.
Structural and kinetic basis for heightened immunogenicity of T
cell vaccines. J Exp Med 2005 ; 201 : 1243-55.
7 Morgan RA, Dudley ME, Wunderlich JR,
Hughes MS, Yang JC, Sherry RM, et al. Cancer
regression in patients after transfer of genetically engineered
lymphocytes. Science 2006 ; 314 : 126-9.
8 Dudley ME, Wunderlich JR, Yang JC,
Sherry RM, Topalian SL, Restifo NP, et al.
Adoptive cell transfer therapy following non-myeloablative but
lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with
refractory metastatic melanoma. J Clin Oncol 2005 ; 23 :
2346-57.
9 Zahnd C, Amstutz P, Pluckthun A. Ribosome
display : selecting and evolving proteins in vitro that
specifically bind to a target. Nat Methods 2007 ; 4 :
269-79.
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