ARTICLE
Auteur(s) : Cedric Matthews1,
Cyril
Favard2
1CNRS, Université de Nice, PRISM, Institute of
Signaling Developmental Biology and Cancer, UMR6543 Centre de
Biochimie, Faculté des Sciences, 06108 Nice Cedex 2
2CNRS, Biophysique cellulaire, Institut de pharmacologie
et biologie structurale, UMR 5089, 205, route de Narbonne, 31077
Toulouse Cedex 4
Article reçu le 4 Octobre 2006, accepté le 16 Novembre 2006
Ces dernières années les techniques d’imagerie du vivant par
contraste de fluorescence ont considérablement évolué. Ces
évolutions sont liées à l’apparition de sondes fluorescentes
optimisées ainsi qu’à de fortes améliorations technologiques de la
microscopie à épi-fluorescence et au développement des microscopes
confocaux permettant une amélioration notable des résolutions
spatiale et temporelle. Ces techniques d’imagerie se trouvent en
bout de chaîne de la production scientifique et le résultat en
termes d’image ou de mesure est dépendant du travail réalisé en
amont par les techniques de biologie cellulaire et de génétique
classiques. Les F-techniques font partie de ces techniques
d’imagerie innovantes de plus en plus utilisées car rendues
accessibles par des systèmes d’imagerie commerciaux. Leur essor
récent est issu de techniques de biophysique développées dans
divers laboratoires, il y a plus de dix ans, dans le but d’étudier
les mouvements de lipides et protéines membranaires [1, 2], le
suivi et les interactions de drogues exogènes, de substances
cancérigènes ou d’anticancéreux [3-5]. Leur point fort est qu’elles
donnent d’une part un suivi de la dynamique macromoléculaire (FRAP,
iFRAP, FLIP, FPA, FCS) et, d’autre part, un suivi spatiotemporel
des interactions entre macromolécules (FLIM, FRET, FCCS).
Rappels
Évolution des sondes fluorescentes
Dans les années 1990, ont été développés des marqueurs
macromoléculaires codés génétiquement et exprimés constitutivement
dans la cellule ou l’organisme d’intérêt, supplantant ainsi
l’utilisation de sondes organiques telle la fluorescéine couplée à
des anticorps. C’est l’utilisation de la GFP (green fluorescent
protein), protéine extraite de la méduse Aequoria victoria et
découverte par Shimomura [6], qui a révolutionné l’imagerie
cellulaire de fluorescence. La GFP et ses nombreux dérivés [7]
obtenus par mutation sont devenus à présent indispensables pour le
chercheur qui veut rendre visible une protéine. Il lui suffit de
fusionner le gène qui code sa protéine d’intérêt avec le gène qui
code la protéine fluorescente. Le gène hybride générera alors une
protéine chimère intrinsèque dans laquelle la partie hôte devrait
jouer son rôle et la partie exogène fonctionnelle et fluorescente
indiquera l’existence et la présence de la chimère.
Une voie extrinsèque est aussi possible, en fusionnant un
fluorophore à un peptide synthétique d’intérêt et en le faisant
pénétrer à l’intérieur d’une cellule vivante pour visualiser son
lieu d’interaction [8].
L’évolution de la qualité et des spécificités des fluororophores
arrive actuellement à un tel raffinement qu’il est possible
d’obtenir des fluorophores sur mesure [9].
Photophysique des fluorophores
La fluorescence est un phénomène de luminescence dont le mécanisme
d’excitation est d’origine lumineuse. Une fois qu’un fluorophore
est porté dans un état excité par l’absorption d’un photon, il
revient spontanément à l’état fondamental selon des voies très
diverses. L’ensemble de ces processus est présenté dans le
diagramme de Perrin-Jablonski ( (figure 1) ).
L’absorption d’un photon d’énergie appropriée fait passer le
fluorophore de l’état fondamental (S0) à un état
électronique excité (S1 ou S2). La molécule
portée à l’état énergétique (S2) peut retourner à l’état
énergétique inférieur (S1) par conversion interne qui
est une transition non radiative (il n’y a pas d’émission de
photons). Une perte d’énergie peut aussi avoir lieu par relaxation
vibrationnelle dans le même état électronique. L’émission de
photons accompagnant la relaxation (S1)-(S0)
est appelée fluorescence. Une autre voie de désexcitation est
possible à partir de l’état S1 en passant par un état
intermédiaire T1, c’est le passage inter-système qui est suivi du
phénomène de phosphorescence. La fluorescence et la phosphorescence
diffèrent par l’énergie des photons émis et par la durée de vie de
leurs états excités. Les temps caractéristiques de ces transitions
énergétiques ont leur importance dans la mise en œuvre des
F-techniques et sont présentés dans le tableau 1( Tableau 1 ).
L’ensemble de ces transitions énergétiques est matérialisé par
les techniques de spectroscopie et, pour les grandeurs énergétiques
qui intéressent les F-techniques, ce sont les spectres d’absorption
et de fluorescence qui sont utilisés comme signature d’un
fluorophore donné.
Il est à noter que le spectre de fluorescence est situé à des
longueurs d’onde plus grandes (ce qui correspond à des énergies
plus faibles) que le spectre d’absorption à cause de la perte
d’énergie par relaxation vibrationnelle dans l’état excité ou par
interaction avec l’environnement.
D’autres grandeurs sont importantes pour comprendre les
F-techniques, elles sont caractéristiques d’un fluorophore
donné : le coefficient d’extinction molaire (ε), le rendement
quantique de fluorescence (φ) et la durée de vie de fluorescence
(τ).
Le coefficient d’extinction molaire (exprimé en
Lmol-1cm-1) représente la capacité qu’a une
molécule d’absorber des photons à une certaine longueur d’onde. Le
rendement quantique de fluorescence (sans unité) est la capacité
d’un fluorophore d’émettre des photons par fluorescence suite à
l’absorption de photons. Il s’exprime par le rapport du nombre de
photons émis sur le nombre de photons absorbés. Il est très
important de savoir que l’intensité de fluorescence, mesurée à
l’état stationnaire, n’est pas directement proportionnelle à la
concentration du fluorophore mais au produit du coefficient
d’extinction molaire, du rendement quantique de fluorescence et de
la concentration du fluorophore (équation 1).
La durée de vie de fluorescence est l’une des caractéristiques
les plus importantes d’une molécule fluorescente parce qu’elle lui
est propre et qu’elle est très sensible à l’environnement
moléculaire du fluorophore. Elle correspond au temps moyen de
désexcitation à partir de l’état S1 qui varie en moyenne
de 1 à 100 ns pour les fluorophores organiques et biologiques.
Tableau 1 Temps caractéristiques des transitions
énergétiques d’une molécule luminescente
|
Type de transitions
|
Temps caractéristiques (s)
|
|
Absorption
|
10-15
|
|
Relaxation vibrationnelle
|
10-12 - 10-10
|
|
Durée de vie de l’état excité S1
|
10-10 - 10-7
|
|
Passage inter-système
|
10-10 - 10-8
|
|
Conversion interne
|
10-11 - 10-9
|
|
Durée de vie de l’état excité T1
|
10-6 - 1 s
|
Méthodes de suivi de la dynamique macromoléculaire
Le but est de perturber le système étudié en faisant :
- soit disparaître de la fluorescence (photoblanchiment),
- soit apparaître de la fluorescence (photo-activation).
Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)
Il y a trente ans, les premières expériences utilisant le
recouvrement de fluorescence après photodestruction par Axelrod
[10] ont été réalisées pour visualiser la mobilité latérale et la
dynamique de protéines fluorescentes dans des cellules vivantes.
Cette technique s’est très largement développée avec l’apparition
des protéines de fusion du type GFP et avec l’évolution des
microscopes dans le positionnement stabilisé et précis du faisceau
d’excitation servant pour la photodestruction des marqueurs
fluorescents. Cette technique est à présent utilisée pour mesurer
la diffusion de molécules dans l’enceinte cellulaire en présence ou
non des phénomènes d’écoulement ou d’échange.
Rappels
La diffusion est le processus physique par lequel la matière est
transportée de régions à forte concentration vers les régions de
faible concentration. C’est le résultat macroscopique de
l’agitation brownienne à l’échelle microscopique. Le modèle de
diffusion d’une particule dans un volume est écrit par la formule
de Stockes-Einstein (équation 2) : qui corrèle le comportement
hydrodynamique d’une sphère avec la température absolue T, la
viscosité de la solution η, la constante de Boltzmann k et le
rayon hydrodynamique de la particule Rh. La vitesse de
diffusion va dépendre du milieu dans lequel la protéine étudiée se
trouve et va refléter l’organisation de celui-ci. Par exemple, des
molécules ancrées dans la couche lipidique de la face externe de la
membrane cellulaire vont diffuser à des vitesses allant de
0,005 μm2.s-1à
0,1 μm2.s-1 alors que celles ancrées sur
la face interne vont diffuser entre
0,1 μm2.s-1 et
1 μm2.s-1, une molécule dans le cytosol
aura une vitesse de diffusion supérieure à
10 μm2.s-1. Ce sont des ordres de
grandeur à prendre en compte lors de l’exécution d’une expérience
de FRAP et que l’on retrouve dans tout type d’étude [11].
Principe du FRAP
Le principe du FRAP est de créer un « trou » de forme
connue par perte de fluorescence irréversible dans un espace de la
cellule afin d’analyser comment il est comblé par le réservoir de
molécules fluorescentes que l’on veut étudier. On peut utiliser
différents types d’illuminations : illumination circulaire où
le faisceau de photodestruction est symétrique, illumination de
type gaussienne, franges d’interférences, TIRF (total internal
reflection fluorescence) [12].
Pour chaque type d’illumination, il y aura une équation
différente pour analyser la courbe de retour de recouvrement de
fluorescence. La ( figure 2 ) montre une
courbe de recouvrement typique et idéale. Dans un système encombré
(comme une cellule), on ne retrouve généralement pas l’intensité de
fluorescence initiale ; cela s’explique par le fait qu’une
partie des molécules fluorescentes ne peut pas diffuser pour
remplir la zone blanchie durant le temps de l’expérience, on parle
alors de fraction immobile.
La valeur de la fraction immobile est donnée par :où M est
la fraction mobile et IM est la fraction immobile. Après
normalisation de la courbe à Fi, la fraction mobile se
définit par :
Le retour de fluorescence en fonction du temps qui est une
mesure de la mobilité moléculaire peut s’écrire en première
approximation :avec, τ demi-temps de résidence,
t0 temps de fin de photodestruction.
τ est relié à la constante de diffusion des molécules
fluorescentes par la relation : avec ω le rayon du
faisceau focalisé.
Lorsqu’une précision accrue est recherchée dans la mesure des
mouvements moléculaires, il est nécessaire d’affiner les modèles en
déterminant les paramètres instrumentaux (géométrie du profil de
photodestruction) et en supposant la nature des mouvements
moléculaires (diffusion 1, 2 ou 3D, transport, échange).
Afin de montrer la complexité croissante liée à une analyse plus
juste, nous présentons ici deux modèles :
- 1) Diffusion 2D avec géométrie d’excitation
gaussienneAxelrod et al. [13] sont les premiers à proposer une
solution analytique, modifiée par la suite [14] afin de prendre en
compte la fraction mobile. Dans ce cas, l’expression analytique
donnant la courbe de recouvrement peut s’écrire :
- Le coefficient de diffusion D peut se déterminer à partir
de τ selon la relation :, avec β un facteur de
correction fonction de l’importance de la photodestruction (K dans
l’équation 7) et ω la taille du faisceau laser à
1/e2.
- 2) Diffusion 3D avec géométrie d’excitation
gaussienne
Le simple fait de rajouter une dimension à la diffusion (ce qui
est le plus souvent le cas dans les échantillons biologiques)
complique terriblement l’expression analytique du retour, Blonk et
al. l’ont déterminé comme suit [15] : avec
Les expressions analytiques décrites montrent ci-dessus la
complexité dans la détermination correcte des grandeurs
caractéristiques de diffusion, transport et échange. Pour cette
raison, la plupart des études réalisées dans des cellules sont des
études comparatives.
Inverse fluorescence recovery after
photobleaching (iFRAP)
Le iFRAP est réalisé comme une expérience de FRAP normale à
l’exception de deux faits : les molécules se trouvant en
dehors de la région d’intérêt sont photodétruites et la perte de
fluorescence de la région non photodétruite est suivie au cours du
temps. Le iFRAP permet de suivre la vitesse de déplacement en
dehors d’une région. Par exemple, le iFRAP a été utilisé pour
suivre la cinétique de dissociation de l’ARN polymérase I marquée
par la GFP, du site de transcription de l’ARNr [16].
Fluorescence loss in photobleaching (FLIP)
Cette technique peut être utilisée pour suivre la continuité d’un
compartiment cellulaire. Pour ce faire, une cellule fluorescente
est photodétruite de façon répétée à l’intérieur d’une petite
région et la fluorescence est suivie en même temps sur la cellule
entière. Toutes les régions de la cellule qui sont connectées à
l’aire photodétruite vont perdre progressivement leur fluorescence
à cause du mouvement latéral des molécules d’intérêt dont le
fluorophore greffé sera inactivé. La vitesse de diminution de
fluorescence d’une région d’intérêt contient l’information de la
vitesse de dissociation de la protéine d’un compartiment
particulier [17]. Par contre, la fluorescence des régions non
reliées ne sera pas affectée.
La technique de FLIP peut aussi être utilisée pour s’assurer si
une protéine a un mouvement uniforme le long d’un compartiment
cellulaire ou si elle entre en interaction, ce qui rend son
mouvement discontinu.
Fluorescence photo-activation (FPA)
Cette technique est apparue grâce aux progrès récents réalisés sur
la modification des fluorophores, notamment ceux dérivés de la GFP.
On trouve actuellement trois protéines photo-activables :
la GFP photo-activable (PA-GFP) [18], la Kaede [19] et la kindling
fluorescent protein 1 (KFP1) [20].
La photo-activation est l’activation photo-induite des molécules
qui va changer les caractéristiques des spectres d’absorption et
des spectres d’émission ( (figure 3) ).
Dans l’exemple présenté, la photo-activation fait apparaître un
pic d’absorbance qui a un λmax de 500 nm
( (figure 3A) )
et le maximum du pic d’émission de fluorescence est décalé de
20 nm de 500 nm à λmax = 520 nm (
(figure 3B) ).
Il conviendra donc après la photo-activation d’exciter le
fluorophore à une longueur d’onde proche
de λmax = 500 nm et de mesurer l’émission de
fluorescence à longueur d’onde
de λmax = 520 nm pour différencier les
populations de fluorophores photo-activés de ceux non
photo-activés.
Sa capacité à allumer la fluorescence fait d’une protéine
photo-activable un excellent outil pour suivre le devenir d’une
protéine dans une cellule vivante. Comme la fluorescence de ces
protéines apparaît seulement après la photo-activation, il est
possible de différencier les molécules photo-activées de celles
nouvellement synthétisées. La photo-activation est quasi
instantanée et les propriétés spectrales sont stables. Cette
technique peut être utilisée en complément du FRAP pour déterminer
des coefficients de diffusion, l’avantage étant ici d’avoir un
meilleur rapport signal/bruit.
Une autre application est le suivi de lignées cellulaires en
regardant la propagation de la fluorescence dans les cellules
filles après photo-activation d’une cellule mère ou d’une
sous-population de cellules mères [20]. Le problème apparaissant
ici est la dilution des molécules fluorescentes photo-activée au
cours des divisions cellulaires qui s’exprime par la perte
progressive du signal de fluorescence ( (figure 4) ). Il reste
toutefois possible de photo-activer les fluorophores dans les
cellules filles s’ils sont exprimés de façon constitutive et de
poursuivre ainsi le devenir de ces types cellulaires au fil des
générations.
La technique de FRAP et les techniques associées ont été
utilisées pour l’étude de facteurs de croissance. La diffusion de
ces facteurs de croissance a été mesurée en fonction du
compartiment cellulaire dans lequel ils se trouvent. L’ajout de
facteurs exogènes par l’expérimentateur induit une variation du
temps de diffusion mettant ainsi en évidence l’interaction de ce
facteur de croissance avec d’autres protéines partenaires [21].
L’étude par FRAP de la diffusion de macromolécules dans des tumeurs
humaines a été utilisée comme témoin de pénétration d’anticancéreux
[22]. L’allure de la courbe de recouvrement du FRAP a aussi été
utilisée en diagnostic pour différencier les cellules tumorales des
cellules non tumorales dans le cancer du sein [23].
Un résumé des variations de signaux de fluorescence que l’on
pourra observer dans les techniques de photodestruction et
photo-activation est présenté sur la ( figure 5 ).
Fluorescence correlation spectroscopy (FCS)
Le FCS est une technique très fine qui permet l’étude des
mouvements moléculaires mais aussi de l’interaction entre
molécules ; plus généralement on mesure des phénomènes
dynamiques dans des systèmes à l’équilibre. Le principe du FCS est
de mesurer des fluctuations de fluorescence dans un volume
d’observation de l’ordre du femto-litre au cours du temps à l’aide
d’un microscope ( (figure 6) ).
Pour des raisons statistiques, cette technique ne doit
s’appliquer que pour de faibles concentrations moléculaires. Au
passage d’une molécule dans le champ d’observation, le détecteur
reçoit une certaine quantité de photons (( figure 7 )A et B) qui se
répète à chaque passage des molécules au cours du temps. La
fluctuation de fluorescence est reliée à la variation de la
concentration dans le volume d’observation si aucun autre phénomène
photophysique ne vient perturber le fluorophore (photodestruction,
variation du rendement quantique…). La diffusion des molécules vers
ou en dehors du volume de détection implique des changements
d’intensité au cours du temps. Ce sont ces changements d’intensité
au cours du temps qu’il faut mettre en évidence, ce qui est réalisé
par la fonction d’autocorrélation G(τ) :
Pour le calcul de la fonction de corrélation, c’est l’écart
d’intensité entre le signal à l’instant t et le signal moyen
<F> que l’on note δF(t) qui est multiplié par
l’écart d’intensité entre le signal à l’instant t + τ et le signal
moyen <F> que l’on note δF(t + τ). Ce rapport est
normalisé par le carré du signal moyen ( (figure 7B) ). Cette
fonction d’autocorrélation est tracée en fonction du temps t sur
une échelle logarithmique ( (figure 7C) ).
Comme dans le cas du FRAP, l’expression analytique de la courbe
d’autocorrélation va dépendre du type d’illumination utilisée et
des mouvements moléculaires supposés. Par exemple, pour un volume
de détection confocal et une diffusion en 3D, le modèle suivant a
été déterminé [24] :
À partir de cette équation, deux informations sont disponibles.
D’une part, l’amplitude à τ = 0 est égale à l’inverse du
nombre de molécules présentes dans le volume d’observation (1/N).
Cela fournit une information sur la concentration de l’échantillon.
D’autre part, le point d’inflexion de la fonction de corrélation
correspond approximativement au temps moyen durant lequel une
molécule reste dans le volume d’observation ( (figure 7) ) et permet
de déterminer son coefficient de diffusion. Le FCS n’est pas une
technique d’imagerie en soi, mais une technique de mesure sous un
microscope. Elle est utilisée depuis longtemps en screening à haut
débit dans l’industrie pharmaceutique et, récemment, dans
l’identification d’activateurs de l’interaction p53-ADN [25] ;
elle se développe dans l’analyse des distributions de temps de
diffusion lors de diverses interactions moléculaires de certains
récepteurs hormonaux et nucléaires [26].
Méthodes de suivi des interactions moléculaires
Forster resonance energy transfert (FRET)
Le FRET est devenu une méthode de choix pour l’analyse des
interactions moléculaires dans la cellule. Malheureusement, cette
propriété moléculaire est bien souvent exploitée à tort et à
travers rendant difficilement concluants les résultats qu’on lui
attribue. Pour bien comprendre cela, il faut revenir à la base
photophysique du principe.
Principe photophysique
Le FRET, initialement observé dans les années 1920 puis expliqué
par Förster [27], reflète un transfert d’énergie non radiatif entre
un fluorophore dit « donneur » (D) et un fluorophore dit
« accepteur » (A), ce qui implique une forte dépendance
spatiale (en 1/r6) de son efficacité (il est important
de comprendre à ce stade que ce transfert se fait sans émission de
photons entre D et A, car les phénomènes d’émission-réabsorption
qui peuvent exister dans des solutions concentrées ont une
dépendance spatiale en 1/r).
Pour que le FRET se produise entre deux molécules, il faut que
trois conditions soient réunies ( (figure 8)
) :
- – le spectre d’émission du fluorophore appelé donneur
doit recouvrir le spectre d’absorption du fluorophore appelé
accepteur ( (figure
8A) ),
- – le moment dipolaire d’émission du donneur ne doit pas
être perpendiculaire au moment dipolaire d’absorption de
l’accepteur ( (figure
8B) ),
- – comme indiqué précédemment, les molécules doivent être
proches dans l’espace.
On définit alors une efficacité de transfert qui est liée à la
distance entre D et A ( (figure 8C) ), ainsi qu’au
rayon de Förster du couple D-A selon la relation :
Cette efficacité de transfert correspond au nombre de photons
restitués par la voie du transfert (donc par A) divisés par le
nombre de photons absorbés par D et est valable dans
l’approximation des solutions diluées, c’est-à-dire quand le couple
D-A contient un D et un A. Le rayon de Förster, qui est une
fonction des propriétés spectrales du couple D-A (J
(λ), φD), de l’orientation (κ2) et de
l’indice de réfraction du milieu (n), peut s’écrire sous la
forme :avec K constante numérique.
Le transfert d’énergie se traduit par une augmentation du
rendement quantique (et de la durée de vie) de A et une diminution
du rendement quantique (et de la durée de vie) de D. Ce sont
ces propriétés qui sont exploitées pour, dans le meilleur des cas,
mesurer une efficacité de transfert et, dans la plupart des cas,
visualiser l’absence ou la présence de FRET.
Bien que l’efficacité de transfert soit une fonction du couple
D-A, on admet généralement que le phénomène de FRET se produit sur
des distances comprises entre 1 et 10 nm.
Méthodes de visualisation
Le FRET peut donc se visualiser par une variation du rendement
quantique (et donc de l’intensité de fluorescence) ou de la durée
de vie de D comme de A. De très nombreuses méthodes ont été
proposées pour le visualiser et le déterminer [28, 29]. Les
méthodes concernant la mesure de la durée de vie (FLIM) seront
détaillées plus loin. Il est important de noter dès à présent que
la mesure d’une efficacité de transfert est rarement possible sous
un microscope où l’essentiel des méthodes se fait en mesure
d’intensité et part donc du principe que la concentration du
donneur et celle de l’accepteur sont des constantes durant le temps
de l’acquisition de l’image.
L’augmentation de l’émission de l’accepteur est la méthode la
plus simple, la plus rapide et la moins coûteuse consiste à faire
une mesure de l’augmentation de l’intensité d’émission de
l’accepteur en excitant le donneur (image FRET) et de relier
celle-ci à l’intensité de l’accepteur en excitant l’accepteur
(image A) et en faisant une image témoin du donneur excité à sa
longueur d’onde (image D) [30]. Son inconvénient majeur est que la
plupart des spectres des couples D-A utilisables en biologie
possèdent de très forts recouvrements à l’émission comme à
l’excitation. Cela implique de faire de nombreuses corrections,
dépendantes de l’échantillon et du matériel utilisé, rendant la
méthode très peu fiable. Cette méthode peut être améliorée par
l’utilisation de microscopes permettant l’enregistrement intégral
des spectres de A et D [31]. Les spectres expérimentaux ainsi
acquis pourront être décomposés en chaque contribution de A et D
permettant de s’affranchir des problèmes de recouvrement à
l’émission. Mais il faut noter que cela ne retire pas les problèmes
de recouvrement des spectres d’excitations et que plusieurs
contrôles sont encore nécessaires.
Le recouvrement de l’émission du donneur est une méthode
indirecte qui consiste à photodétruire A et à mesurer la croissance
de fluorescence de D qui en découle [32, 33]. Elle a pour avantage
de s’affranchir des phénomènes de recouvrement spectraux.
Cependant, elle nécessite une très bonne photodestruction de A
(quasiment 100 %) avant de faire la mesure de D. Cela
implique que l’échantillon soit fixé, que A se photodétruise
facilement et de façon irréversible (ce qui est rarement le cas
pour les XFP) et que D ne soit pas détruit pendant la
photodestruction de A. Bien que cette méthode soit plus fiable
que la précédente, elle est tout de même à utiliser avec beaucoup
de précautions.
La variation de l’anisotropie est une méthode encore très peu
répandue, qui permet de visualiser le FRET en mesurant la variation
de polarisation de D (ou de A). Elle possède l’avantage de pouvoir
mesurer ce que l’on appelle l’homo-FRET, c’est-à-dire le FRET de D
vers D, qui permet d’avoir des informations sur l’oligomérisation
des protéines dans la cellule [34].
Couples D-A
Il existe une infinité de couples D-A dans l’absolu. Les plus
utilisés sont répertoriés dans le tableau 2( Tableau 2 ). L’avènement des XFPs [7] a
conduit à l’utilisation de plus en plus courante de celles-ci. Le
couple CFP-YFP est le plus couramment utilisé mais pas forcément le
plus pratique pour des raisons de recouvrement spectraux à
l’émission comme à l’excitation et de déclins de fluorescence
multi-exponentiels pour les deux.
Tableau 2 Paires de fluorophores les plus
couramment utilisées
|
Donneur
|
Accepteur
|
Donneur
|
Accepteur
|
|
BFP
|
GFP
|
Alexa 350
|
Alexa 488
|
|
BFP
|
YFP
|
Alexa 350
|
Alexa 594
|
|
CFP
|
YFP
|
Fluorescein
|
Cy5
|
|
YFP
|
YFPa
|
Fluorescein
|
Rhodamine
|
|
GFP
|
Rhod-2
|
Fluorescein
|
Texas red
|
|
FITC
|
Rhod-2
|
Rhodamine
|
NBD
|
|
Cy3
|
Cy5, Cy5.5
|
DCIA
|
NBD
|
|
Alexa 488
|
Alexa 555
|
IAEDANS
|
DABCYL
|
|
FITC
|
Alexa 546
|
Tryptophan
|
Dansyl
|
|
FITC
|
Cy3
|
|
|
aUtilisable en homo-FRET.
Applications en cancérologie
Les applications du FRET en cancérologie sont de plus en plus
nombreuses. Elles se situent aussi bien au niveau du diagnostic in
vitro [35], in situ [36], qu’en recherche fondamentale et plus
particulièrement en biologie cellulaire. Une batterie de sondes
l’utilisant a ainsi été développée spécifiquement pour
cartographier dans la cellule les activités de tyrosine kinases,
sérine-thréonine kinases, petites GTPases (Ras, Rho, Rac, cdc42)
[37].
De nombreuses études sur la phosphorylation du récepteur à l’EGF
(connue comme étant élevée dans les cellules tumorales) ont aussi
été menées par le groupe de Bastiaens [38, 39] en utilisant des
chimères CFP/YFP.
Fluorescence lifetime imaging (FLIM)
Mesurer des durées de vie sous un microscope est un développement
assez récent, qui date du début des années 1990 [40-42].
L’avantage majeur de la mesure de durée de vie sous microscope
est qu’il s’agit d’un paramètre indépendant de la concentration du
fluorophore, tout en étant très sensible à l’environnement
moléculaire de ce dernier. Son inconvénient majeur jusqu’à
récemment était sa mise en œuvre, car mesurer des durées de vie
nécessite une instrumentation pointue et coûteuse accompagnée d’un
certain savoir-faire. Avec l’arrivée sur le marché d’instruments
clés en main au début des années 2000 chez la plupart des
constructeurs de microscope, la méthode s’est popularisée et
devient de plus en plus utilisée.
Il existe deux façons majeures de mesurer des durées de vie,
dans un tube à essai comme sous un microscope ( (figure 9) ) : le
comptage de photon unique ( (figure 9A) ) et la
modulation d’amplitude et le décalage de phase ( (figure 9B) ). Les
principes, avantages et inconvénients sont détaillés ci après.
Time correlated single photon counting (TCSPC)
C’est la méthode la plus précise dans la détermination des durées
de vie de fluorescence. Concrètement, elle consiste à mesurer le
temps entre l’impulsion laser qui émet le photon qui sera absorbé
(start) et la détection du photon de fluorescence émis (stop). Elle
nécessite une source pulsée à l’excitation. Les photons sont ainsi
comptés un à un afin de pouvoir établir un histogramme temporel des
photons de fluorescence ( (figure 9A)
). τf est défini comme le temps nécessaire à
atteindre la valeur 1/e2 de l’intensité de départ. Le
gros avantage de cette méthode est que le nombre d’événements
comptés permet d’avoir une très bonne statistique et donc de
déterminer très correctement les durées de vie. Son inconvénient
majeur est le temps nécessaire à cette acquisition, parfois peu
compatible avec des expériences sur des systèmes vivants.
Frequency domain phase modulation (FDPM)
C’est la méthode la plus rapide mais moins précise lorsqu’il s’agit
de mesurer des déclins multi-exponentiels. Elle peut être réalisée
avec une illumination continue ou pulsée. Un modulateur
électro-optique (cellule de Pockels) est utilisé à une fréquence
qui dépend de la durée de vie à mesurer. Une fraction de la source
d’excitation modulée est envoyée sur un photomultiplicateur de
référence, le reste traverse l’échantillon et est détecté sur un
autre photomultiplicateur. La comparaison des deux signaux permet
ainsi de mesurer le déphasage (φ) et le rapport de modulation
(M). τM et τφ sont ainsi déterminés
à partir des valeurs de φ et M ( (figure 9B) ).
Applications en cancérologie
Historiquement et pour des problèmes de temps d’acquisition, les
premiers systèmes de FLIM ont été développés en utilisant la
technique FDPM. Gadella et Jovin ont ainsi étudié l’oligomérisation
du récepteur à l’EGF sur des cellules stimulées puis fixées [43].
L’activation de la PKCα a aussi été suivie de façon dynamique
directement sur des cellules en culture [44]. Plus récemment, des
études à visée diagnostique ont été réalisées par la technique du
TCSPC sur des biopsies de cancer du sein. Tadrous et al. ont
utilisé la variation de la durée de vie moyenne de
l’autofluorescence cellulaire comme outil de différenciation entre
cellules saines et cellules malignes [45]. Cette méthode se voit
aussi déclinée en tomographie [46].
Fluorescence cross correlation spectroscopy (FCCS)
Comme décrit plus haut, la spectroscopie de corrélation de
fluorescence (FCS) est une méthode qui permet de mesurer des
coefficients de diffusion. Ces derniers sont liés au rayon
hydrodynamique de la molécule, donc à son volume et à sa masse.
Théoriquement, la FCS devrait permettre de mesurer des variations
de masse, donc des interactions entre les molécules d’intérêt.
Malheureusement, en première approximation, le coefficient de
diffusion D varie avec M-1/3 ; il faut donc
augmenter la masse d’un facteur 8 pour diminuer D d’un facteur 2.
Cela explique que le FCS peut être utilisé pour l’étude
d’interaction moléculaire seulement dans le cas où la molécule
portant le fluorophore est de bien plus petite taille que sa cible.
Pour pallier ce problème, la technique de spectroscopie de
corrélation croisée de fluorescence a été développée [47, 48]. Le
FCCS nécessite le marquage des deux molécules d’intérêt (A et B)
par deux chromophores distincts. La courbe d’autocorrélation de
chacune des molécules GA(τ) et GB(τ) est
alors enregistrée dans deux canaux différents et les informations
de ces deux canaux sont corrélées entre elles afin d’obtenir une
courbe de corrélation croisée, Gx(τ). L’amplitude de
cette courbe de corrélation croisée à τ = 0 (G0,x)
contient les informations sur l’interaction entre les deux
partenaires A et B. Dans le cas idéal, si la fixation se fait
avec une stœchiométrie 1:1 ; si les deux fluorophores sont
spectralement différenciables et si leur brillance ne change pas
lors de l’interaction, le taux de liaison est alors donné par la
relation suivante : de même
L’obtention de cette information nécessite cependant de
nombreuses précautions. Comme en FCS, la photodestruction doit
absolument être évitée durant l’expérience car elle réduit très
nettement l’amplitude de la courbe de corrélation croisée
(Go,x). Il est aussi nécessaire de s’assurer que les
deux volumes visualisés dans chaque couleur sont parfaitement
spatialement colocalisés et donc de posséder des appareils optiques
parfaitement achromatiques. L’utilisation d’une excitation en
double photon permet de s’affranchir de ce problème, mais elle
n’est pas encore disponible dans les systèmes commerciaux. Le
recouvrement des spectres d’émission des deux chromophores doit
aussi être évité afin de ne pas donner naissance à des faux
positifs dans le canal d’autocorrélation.
Cette méthode est encore en pleine évolution mais semble très
prometteuse pour l’étude des interactions moléculaires dans la
cellule. Les premiers exemples concernent le suivi du trafic
endocytaire [49], la signalisation cellulaire [50], le clivage
enzymatique [51, 52], la fixation de complexes de transcription sur
l’ADN [53].
Conclusion
Les F-techniques sont en plein essor dans les domaines de la
recherche fondamentale variés faisant appel à la microscopie et, à
moyen terme, à la microscopie confocale endoscopique (fibered
confocal fluorescence microscopy ou FCFM). Ces techniques
deviennent facilement accessibles aux biologistes avec l’apparition
d’instruments commerciaux simples d’utilisation et combinant
plusieurs des techniques décrites précédemment. Le développement
des protéines chimères couplées à la GFP et à ses dérivés permet
désormais de les étendre à de nombreux types d’étude et d’envisager
à terme de pouvoir quantifier correctement la dynamique et les
interactions de protéines (nucléaires, membranaires ou
cytoplasmiques). Il est fort à parier que, dans les années qui
viennent, elles permettront de déchiffrer plusieurs des étapes clés
de la prolifération cellulaire.
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