ARTICLE
Auteur(s) :, Frédérique
Penault-Llorca, Anne Cayre
Département de pathologie, Centre Jean-Perrin, 58, rue
Montalembert, BP 392, 63011 Clermont-Ferrand
Le trastuzumab (Herceptin®, Produits Roche), anticorps
monoclonal ciblant directement l’oncorécepteur de surface HER2, est
commercialisé depuis août 2000 et les pathologistes sont de plus en
plus sollicités pour rechercher le statut HER2 d’une tumeur
mammaire, en phase métastatique mais aussi au diagnostic, en vue de
l’inclusion des patientes dans des essais adjuvants [1].La
détermination du statut HER2 peut être effectuée par la recherche
de l’amplification du gène et/ou de la surexpression de la protéine
codée par ce gène. De nombreuses méthodes peuvent être utilisées
pour l’étude de HER2 [2-4]. Le niveau d’amplification du gène est
étudié en southern-blot, dot-blot, FISH (fluorescent in situ
hybridization) ou, plus récemment, en CISH (chromogenic in situ
hybridization). Le niveau d’expression peut être étudié au niveau
de l’ARN (northern, RT-PCR…) ou de la protéine par western, Elisa
et surtout immunohistochimie (IHC) sur fragments frais congelés ou
en paraffine.Si toutes ces méthodes ont été utilisées, les deux
méthodes actuellement préconisées dans les études cliniques et en
routine sont l’IHC et la FISH. Ces techniques présentent une grande
spécificité puisqu’elles permettent un contrôle morphologique et
une visualisation directe du signal recherché au niveau des
cellules carcinomateuses infiltrantes.
L’IHC, quoi de neuf en 2004 ?
Plusieurs anticorps spécifiques anti-HER2 sont commercialisés. Les
plus utilisés sont l’anticorps monoclonal NCL-CB11
(Novocastra®, Ventana), dirigé contre la partie
intra-cytoplasmique de la protéine HER2, et l’anticorps polyclonal
A485 (Dako). L’anticorps Tab250 (Zymed) reconnaît le domaine
extracellulaire de HER2. Il est très utilisé aux États-Unis.
Afin de faciliter la standardisation de l’évaluation du statut
HER2 par IHC, plusieurs tests standardisés ont été commercialisés
(Herceptest® par Dako, puis Pathway® par
Ventana). Ces kits sont constitués de réactifs prêts à
l’emploi et adaptés à l’usage en automate. Par ailleurs, des
échantillons provenant de lignées cellulaires sont proposés comme
témoins positifs ou négatifs de la réaction. Le test
Herceptest® a été au cœur d’une polémique autour de
la fiabilité de l’IHC [5-8], à partir d’une publication de Jacobs
et al. [5] alléguant sa trop grande sensibilité et sa production de
faux positifs. En fait, les conclusions étaient fondées sur des
résultats obtenus à partir de tissus fixés en formol-alcool. Ce
type de fixateur à base d’alcool, qui préserve très bien les sites
antigéniques, n’est pas recommandé avec ce kit conçu pour une
sensibilité optimale. Beaucoup d’études ont par la suite
« réhabilité » le kit Herceptest®, en montrant
son excellente corrélation avec la technique de FISH [9, 10]. Il
est important de rappeler ici qu’il est indispensable de suivre
rigoureusement toutes les étapes et les consignes du protocole pour
obtenir des résultats fiables. Pour les anticorps utilisés hors
kit, les dilutions préconisées par les fabricants sont trop
concentrées. Pour valider sa technique, le pathologiste peut suivre
les recommandations du Gefpics [11]. Les anticorps CB11 et A485
donnent des résultats équivalents moyennant l’adaptation des
conditions techniques reposant principalement sur l’utilisation
d’un démasquage antigénique en tampon citrate à pH 6 et sur une
dilution importante de l’anticorps primaire (CB11 de 1/500 à
1/800 ; A485 de 1/400 à 1/500 avec les nouveaux lots
d’anticorps dont la titration est plus basse). Tous les fixateurs
peuvent être utilisés à condition d’adapter la technique. Une
vigilance importante est nécessaire concernant les lots d’anticorps
et les réactifs en général.
Des problèmes récents ont surgi avec des lots d’anticorps
polyclonaux Dako dont la concentration avait été diminuée de moitié
alors que les références du produit et le prix n’avaient pas été
modifiés. Une information réduite et peu lisible apparaissait sur
les fiches techniques. Des problèmes ont également été notés avec
des systèmes de révélation de chez Ventana, qui se sont avérés
générateurs de faux positifs et qui ont par la suite, grâce à la
vigilance des pathologistes, été retirés de l’indication
« test HER2 ». La nouvelle législation européenne
concernant les réactifs de laboratoire et les procédures de
réactovigilance devraient nous permettre à l’avenir d’éviter, au
moins en partie, ces problèmes.
Le FISH : quoi de neuf en 2004 ?
Le principe est celui d’une hybridation de l’ADN tumoral en une
étape, avec une sonde fluorescente reconnaissant le gène HER2. Une
deuxième sonde reconnaissant le centromère du chromosome 17 peut
être couplée à la première ou être réalisée dans un second temps
[2-4, 12, 13]. Trois tests sont principalement commercialisés : les
kits Abott/Vysis (sonde HER2 et centromère du chromosome 17),
Oncor/Ventana (sonde HER2) et Dako (sonde HER2 et centromère du
chromosome 17). Les deux premiers kits sont approuvés par la Food
and Drug Administration (FDA), le troisième est en cours
d’approbation. Avec la sonde Oncor/Ventana, il n’est pas possible
de faire un double marquage par co-hybridation de sondes, mais il
est possible de réaliser une seconde hybridation avec la sonde du
centromère du chromosome 17. La FISH est une méthode indirecte de
détection de la cible du trastuzumab. On détecte l’amplification du
gène et non sa surexpression et, dans 5 à 10 % des cas, il peut y
avoir surexpression sans amplification. Cette technique est
réservée à des centres spécialisés. Au même titre que l’IHC, des
variations intra et inter-laboratoires sont possibles, liées à des
variations techniques (fixation, épaisseur des coupes,
prétraitements…) et à des difficultés d’interprétation (difficulté
de repérage des zones invasives, autofluorescence…).
À ce jour, les techniques d’hybridation in situ telles que la
FISH n’ont pas encore de cotation dans la nomenclature des actes
ACP français et ne peuvent être assimilées à des actes d’IHC. La
FISH permet de rendre des résultats quantitatifs et les acides
nucléiques seraient moins sensibles que les épitopes antigéniques à
la fixation. Après une grande vague de discrédit concernant l’IHC
et la recommandation d’utiliser la FISH comme seul test, il
apparaît actuellement que ces deux techniques sont complémentaires.
La FISH permet de contrôler les cas douteux en IHC et de
standardiser l’IHC. Elle a une place clé dans la démarche
d’assurance qualité, l’IHC permettant de contrôler les cas
indéterminés ou non réalisables (décollement, autofluorescence,
fixateur non adéquat) par la FISH. Le 29 octobre 2004, la
Commission européenne a approuvé l’utilisation de la FISH et de la
CISH (qui sera détaillée plus loin) comme techniques alternatives à
l’IHC pour la détermination du statut HER2.
Quel score de réponse ? Qui est HER2-positif ?
Pour l’IHC, le score actuellement utilisé dans les essais cliniques
est le score de l’Herceptest®. Ce score est non optimal.
Il a été initialement conçu pour séparer les cas considérés comme
positifs (2+ et 3+) des cas négatifs (0, 1+). Mais les cas 2+, on
le sait maintenant, ne sont pas faiblement positifs et doivent être
considérés comme négatifs jusqu’à preuve du contraire (en général
par la recherche d’une amplification par FISH, présente dans 5 à 20
% des cas) [5]. Les travaux du Gefpics ont montré qu’un seuil de
positivité de plus de 60 % de cellules marquées augmentait le taux
de concordance avec le statut du gène par FISH [14]. Ce nouveau
score, confirmé en partie par certains auteurs [15], est très
prometteur. Cependant, il doit encore être validé dans des études
cliniques, en particulier par rapport à la réponse au trastuzumab.
Pour la FISH, en théorie, un cas pourrait être considéré comme
amplifié s’il présente plus de 2 copies du gène. Cependant, entre 2
et 4 copies, la cellule peut être en train de se diviser. Une
cellule normale présente 2 copies du gène HER2 et 2 copies du
centromère du chromosome 17. L’amplification est certaine à partir
de 4 copies. Une amplification est considérée comme faible entre 4
à 10 copies et forte au-dessus de 10. En général, on n’arrive plus
ensuite à compter le nombre de spots HER2, les points se groupant
en paquets (clusters). Lorsque l’on observe entre 5 à 6 copies de
HER2, il peut s’agir d’une aneuploïdie. Si l’on dispose de la sonde
centromère 17, on réalise le rapport gène HER2/centromère du 17,
pour ne pas interpréter comme amplifiés des cas pour lesquels il
existe une sur-représentation du gène HER2 par aneuploïdie du
chromosome 17 (il ne s’agit pas de vraies amplifications). Une
amplification est ainsi définie par un rapport supérieur à 2,2. De
plus, les tumeurs mammaires présentent toujours des cellules en
division et parfois un certain degré d’hétérogénéité tumorale. Il
est donc recommandé de compter au moins 40 noyaux et 60 si l’on se
trouve dans la zone borderline définie soit par un rapport
HER2/CH17 entre 1,8 et 2,2, soit entre 3,5 et 4 signaux HER2 par
cellules [16].
Pour optimiser au mieux la FISH, il convient de standardiser les
conditions de fixation au sein d’une même structure, en particulier
d’abolir le Bouin aqueux, de standardiser l’épaisseur des coupes
(4-5 μm), de veiller à l’étape de digestion des tissus (ni
sous-digestion génératrice d’autofluorescence, ni sur-digestion
entraînant des noyaux « vides » et une absence de signal)
et, si possible, de sélectionner une coupe histopathologique sans
carcinome in situ ou bien de repérer les zones à évaluer afin
d’éviter les faux positifs. Enfin, il faut savoir que les noyaux
normaux sont souvent moins sensibles à la digestion et que la
présence de deux signaux dans le sein normal (témoin interne) n’est
pas toujours obtenue. La FISH peut être utilisée sur des
préparations nucléaires, en particulier sur des cellules tumorales
circulantes [17].
Corrélation entre la FISH et l’IHC
Depuis que les cas 2+ en IHC ne sont plus considérés comme
« positifs », les données de la littérature montrent une
forte corrélation entre l’amplification du gène HER2 et
l’hyperexpression de la protéine HER2, quelles que soient les
méthodes utilisées. La comparaison entre les résultats des méthodes
morphologiques (FISH et IHC), est particulièrement intéressante et
montre un niveau de concordance très élevé, supérieur à 90 % [10,
14, 18, 19]. Cependant, certains auteurs jugent la FISH beaucoup
plus fiable, moins sujette à des variations d’interprétation du
score et plus sensible en raison d’une plus grande résistance du
matériel génomique à la fixation par rapport aux épitopes
antigéniques [4, 6, 18, 20].
Place des nouvelles techniques
Parmi les trois techniques actuellement les plus utilisées (CISH,
PCR et Elisa), la CISH est la plus prometteuse [21]. Le Gefpics a
également été à l’initiative d’un travail de validation de la CISH
par rapport à la FISH [22, 23]. L’étude a porté sur 79 carcinomes
infiltrants du sein, préalablement testés pour leur statut HER2 par
IHC et FISH. Quatre-vingt-quinze pour cent des cas ont été
analysables en CISH. Lorsque l’on compare les méthodes FISH et CISH
en fonction du caractère non amplifié ou amplifié, l’agrément est
de 96 %. Il est de 92,8 % dans les cas 2+ en IHC [22]. Ces
résultats sont tout à fait superposables à ceux de la littérature
et placent la CISH comme une alternative intéressante à la FISH
pour la recherche d’une amplification du gène HER2, ce qui vient
d’être reconnu par la Commission européenne. La PCR est plus
précise après microdissection, ce qui l’alourdit. Les taux
circulants d’HER2 ne sont pas corrélés au niveau d’expression de la
tumeur [21]. L’Elisa ne peut donc pas servir à sélectionner les
patientes en vue d’un traitement. Elle peut servir à suivre
l’efficacité d’un traitement (diminution des taux circulants) ou à
identifier une rechute précoce (réascension des taux) [24] mais son
intérêt comme marqueur prédictif de réponse au trastuzumab est
actuellement trés débattu [25].
Assurance qualité
Une démarche d’assurance qualité est indispensable pour assurer la
fiabilité globale d’un test. Le Gefpics a publié des
recommandations [11] permettant de calibrer et de contrôler une
technique IHC « maison » (utilisation de témoins,
évaluation d’une série de 100 cas et comparaison aux données de la
littérature…).
Plusieurs procédures peuvent être utilisées [11, 26] :
- • au sein de la même structure, vérification régulière
des pourcentages de cas positifs en s’assurant qu’ils restent bien
dans la fourchette des 15-25 % et/ou pratique de doubles
évaluations avec un autre test (IHC ou FISH) ou par une autre
structure ;
- • participation à des tests multicentriques, régionaux,
nationaux comme ceux de l’Association française pour l’assurance
qualité en anatomie pathologique (Afaqap) permettant l’évaluation
des protocoles techniques et de l’interprétation des résultats de
différentes structures ; des tests nationaux et des études
multicentriques ont également été réalisés pour l’IHC et la FISH
aux États-Unis, au Canada et au Royaume Uni [10, 27-30] ;
- • utilisation de tissue arrays avec plusieurs cas sur le
même bloc pour évaluation simultanée des protocoles techniques [15,
31] ;
- • participation à des modules éducationnels, utilisation
de CD-Rom, etc.
Le collège des pathologistes américains a une attitude
différente. Pour eux, la seule recommandation est d’utiliser un
test approuvé (IHC et/ou FISH) par la FDA, sous forme de kit. Dans
le cas contraire, la responsabilité du pathologiste pourra être
engagée. Ainsi, aucune recommandation n’est donnée pour valider un
test maison [16].
Recommandations actuelles
En France et dans la plupart des pays [11, 26]( (figure 1) ) :
- • à l’heure actuelle, il n’y a pas de réactif ni de
méthode pouvant être recommandés pour le test ;
- • dans le compte rendu, il faut rapporter la méthode et
le réactif utilisés ; seul le contingent invasif doit être
pris en compte dans le score ;
- • pour l’IHC, seul le marquage membranaire est considéré
comme positif ; le compte rendu doit inclure le pourcentage
estimé de cellules marquées plus ou moins l’intensité ; il
faut définir le seuil choisi et comment il a été validé ;
- • si un score particulier ou une valeur seuil de
positivité sont utilisés, ils devront être définis ; les cas «
douteux » devront être testés par une autre méthode, en particulier
la FISH permettant d’évaluer les scores IHC « douteux » ou
incertains ;
- • quels que soient la technique et le seuil utilisés,
ils devront être corrélés avec les données cliniques et
morphologiques ;
- • les techniques de CISH et de PCR sont en
émergence.
Aux États-Unis [16] :
- • il est recommandé d’utiliser des tests standardisés
(problèmes d’assurance médicale et de remboursement) ;
- • la FISH est recommandée, comme l’IHC, en première
intention ( (figure
2) ) ;
- • les cas limites en FISH devront être contrôlés par
IHC ;
Au Royaume-Uni [3, 32] :
- • il recommandé d’effectuer au moins 250 tests IHC par
an pour être habilité ;
- • il est recommandé d’utiliser des tests
standardisés.
Conclusion
L’immunohistochimie est une méthode fiable et rapide de
détermination du statut de HER2. Elle peut être standardisée et
calibrée en prenant la FISH ou la CISH comme technique de
référence. Elle doit être soumise à des règles de contrôle de
qualité interne et externe. Sa fiabilité est maximale pour les cas
négatifs ou fortement positifs. Par contre, pour les cas dont
l’expression est d’intensité intermédiaire et dont le pourcentage
de cellules marquées se situe aux alentours de 50 à 80 %, une
vérification par FISH du statut de HER2 est justifiée. À l’inverse,
si la FISH ou la CISH sont utilisées en première intention, les cas
douteux et/ou polyploïdes devront être re-testés par IHC. Les
données cliniques concernant la survie indiquent que les patientes
avec une tumeur surexprimant fortement HER2 (score 3+ en IHC) ou
amplifiée (FISH et CISH positives) tirent le meilleur bénéfice
clinique du traitement par trastuzumab [33, 34]. La CISH est une
technique alternative fiable à la FISH, avec des contraintes
techniques plus adaptées aux structures de pathologie [23]. La FISH
pourrait être utilisée sur des cellules tumorales circulantes et
donner une information supplémentaire sur le statut HER2 des
cellules métastatiques (qui pourraient acquérir un phénotype HER2
positif au cours de l’évolution métastatique) [17]. Ces résultats
demandent cependant à être confirmés par d’autres études. Dans tous
les cas, l’adhésion à des procédures d’assurance qualité, internes
et externes, est indispensable.
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