Exosomes et immunothérapie antitumorale

ARTICLE

Auteur(s) : Nathalie Chaput¹, Fabrice Andre^1,3, Noël E.C. Schartz^1,2, Caroline Flament¹, Eric Angevin¹, Bernard Escudier³, Laurence Zitvogel¹

¹ Unité d’immunologie, Département de biologie clinique, Institut Gustave-Roussy, 39 rue Camille-Desmoulins, 94805 Villejuif. 
² Département de dermatologie 2, AP-HP Hôpital Saint-Louis, Paris. 
³ Département de médecine, Institut Gustave-Roussy, 39 rue Camille-Desmoulins, 94805 Villejuif

Article reçu le 7 avril 2003 accepté le 10 juillet 2000

Les exosomes sont des vésicules unilamellaires dont les caractères ultra-structuraux ont été définis [9]. Leur composition protéique a été caractérisée par western-blot [9], spectrométrie de masse [16, 17] et cytométrie de flux [18]. Leurs caractéristiques physiques, biochimiques et immunologiques les distinguent des vésicules provenant d’autres compartiments cellulaires, comme la membrane plasmique ou le réticulum endoplasmique. Ici, nous nous concentrerons seulement sur les exosomes de cellules dendritiques (DEX), les exosomes de cellules tumorales (TEX), les exosomes d’ascite compliquant les carcinoses péritonéales (TEXAS), les exosomes provenant des cellules tumorales contenues dans l’ascite et probablement provenant d’autres types cellulaires (CPA).

Caractéristiques physicochimiques et moléculaires des exosomes

Les exosomes sont des vésicules de 60 à 100 nm de diamètre qui migrent dans un gradient de sucrose à une densité allant de 1,13 (exosomes de lymphocytes B) à 1,210 g/cm³ (DEX/TEX/TEXAS) [4-20]. Ce sont des vésicules thermostables qui peuvent être cryopréservées à – 80 °C pendant environ 6 mois.
Les exosomes sont secrétés par des cellules vivantes et ont des caractéristiques moléculaires très différentes des corps apoptotiques [17]. La composition protéiques des DEX a été étudiée chez la souris et chez l’homme. Certaines protéines, comme les tétraspanines [18] et les protéines de choc thermique [16], sont sur-représentées dans les membranes de tous les exosomes. Les autres diffèrent en fonction de la cellule d’origine : le récepteur à la transferrine ou TRf (réticulocytes, [7, 21]), les molécules du CMH et les molécules de costimulation (cellules dendritiques [5, 10, 16-18, 22], les lymphocytes B [9, 19], les macrophages [8, 15], les entérocytes [20], les lymphocytes T [23]), les intégrines (cellules dendritiques [5, 10, 17, 18, 22], les réticulocytes [7, 21], les macrophages [8], les lymphocytes T [23]), les membres de la superfamille des immunoglobulines (lymphocytes B [9, 19]), les plaquettes [24]) des peptidases de surface (entérocytes [20], macrophages [8, 15]), les protéines du cytosquelette (cellules dendritiques [22], macrophages [8, 15], entérocytes [20]), des protéines membranaires de transport et de fusion (cellules dendritiques [22], macrophages [8, 15]), des protéines de transduction du signal (cellules dendritiques [22] et lymphocytes T [23, 25]), des enzymes métaboliques (entérocytes [20] et cellules dendritiques [22]) et des antigènes cytosoliques (cellules tumorales [4, 6]).

Production et caractérisation des exosomes

Il a été établi que les DEX avaient des propriétés immunostimulantes chez la souris [5] et qu’ils pouvaient représenter un « substitut » à la thérapie cellulaire. Un procédé de grade clinique a donc été développé pour permettre l’utilisation d’exosomes en thérapeutique. Les DEX et les TEX peuvent être purifiés rapidement (en 4-5 heures à partir de 2-3 litres de culture). L’ultrafiltration du surnageant clarifié de culture et l’ultracentrifugation sur un coussin de D2O/sucrose (densité : 1,19 à 1,210 g/cm³) permettent de réduire le volume et d’augmenter la concentration protéique approximativement de 200 et 1 000 fois respectivement. Le rendement est de 40 à 50 % si l’on compare la quantité de molécules de classe II du CMH avant et après purification. Les contrôles de qualité de la préparation exosomale ont été réalisés sur la base de la quantification des molécules de classe II du CMH, composition protéique par cytométrie de flux et tests fonctionnels, permettant une standardisation du procédé de préparation. Une technique rapide et reproductible de purification associée à des contrôles de qualité a permis de lancer un essai clinique de phase I [24].
Partant du principe que les cellules tumorales pouvaient sécréter des exosomes (TEX) dans des flacons de culture cellulaire, l’hypothèse de la présence d’exosomes dans les collections liquidiennes spontanées, en particulier dans les ascites de patients atteints de carcinose péritonéale, a été émise [4]. Le liquide prélevé est centrifugé une première fois à 1 200 rpm (élimination des cellules flottantes), puis ultracentrifugé afin de sédimenter les exosomes. Le culot est alors remis en suspension dans un gradient de D2O/sucrose et à nouveau ultracentrifugé. Les exosomes sont ainsi purifiés. Une dernière étape d’ultracentrifugation permet le lavage et la sédimentation des exosomes afin de les isoler et de les conserver. L’analyse ultra-structurale des éléments du culot de centrifugation met en évidence de nombreuses vésicules ayant un diamètre de 50 à 100 nm, ressemblant morphologiquement aux exosomes, que l’on a nommées exosomes d’ascite (TEXAS). À l’heure actuelle, aucun procédé GMP n’a été mis au point pour l’obtention d’exosomes d’ascite. Les exosomes d’ascite peuvent aussi être caractérisés par quantification des molécules de classe I du CMH [4].

Etudes précliniques sur l’immunogénicité des DEX

Il a été montré que les DEX chargés avec des peptides élués de tumeur faisaient régresser une tumeur P815 établie de manière T-dépendante. Ce travail, mené par Laurence Zitvogel et al., consistait, après purification d’exosomes de cellules dendritiques et chargement des exosomes avec des peptides élués de tumeur (P815), à vacciner des souris porteuses d’une tumeur P815 avec ces derniers et à observer le ralentissement ou la régression de la croissance tumorale. Le rejet tumoral permettait une protection de longue durée contre la tumeur [5].
Les molécules de classe I du CMH peuvent être directement chargées avec des antigènes, après élution acide des exosomes purifiés [24, Dee Shu et al., résultats non publiés]. Pour les molécules de classe II du CMH, un chargement sera effectué de manière indirecte des peptides de classe II sur les cellules dendritiques en culture [26, 27]. Nous avons démontré que les complexes classe I/peptide exosomaux pouvaient stimuler un clone lymphocytaire de manière spécifique et restreinte au CMH in vitro. Dans le modèle murin HLA A2.1 transgénique, l’injection de DEX HLA A2.1 + chargés avec le peptide Mart1 permet l’expansion de lymphocytes T CD8 + spécifiques A2/Mart1 dans le ganglion drainant l’injection. Ces DEX permettent cette expansion uniquement s’ils sont chargés sur des cellules dendritiques porteuses ou co-administrés avec une substance adjuvante comme les séquences oligonucléotidiques CpG ou des ARN double brin Ampligen® [N. Chaput et al. 2003, soumis]. Ces résultats montrent l’importance et la nécessité de co-injecter avec les DEX une substance permettant la maturation in situ des cellules dendritiques de la peau (pour une vaccination sous-cutanée), suggérant le rôle des cellules dendritiques pour amener les DEX aux ganglions drainant et pour permettre une présentation de ces derniers aux lymphocytes T afin de déclencher une réponse T-spécifique efficace.

Essai clinique de phase I avec des DEX

Se fondant sur ces rationnels précliniques, nous avons entrepris un essai clinique de phase I. Une méthode de grade clinique a été développée pour obtenir des exosomes dérivés de cellules dendritiques (ultrafiltration suivie d’ultracentrifugation sur coussin de D2O/sucrose). Les molécules de classe I des DEX sont ensuite chargées avec des peptides tumoraux synthétiques [26]. Après acceptation par les agences réglementaires de la description du produit fini, du procédé et des résultats de l’étude de la toxicité chez l’animal, un essai de phase I a été lancé avec comme principal objectif de tester la faisabilité et la toxicité de l’injection de DEX chez des patients présentant un mélanome métastatique. Cet essai a été réalisé chez des patients HLA-A1/B35 et – DPO4 porteurs d’un mélanome de stade III-IV exprimant MAGE-3. Les DEX étaient purifiés à partir du surnageant de culture des cellules dendritiques autologues cultivées en GM-CSF/IL4 à J7 de la culture. Le peptide MAGE-3 était alors chargé sur les cellules dendritiques (6 premiers patients) ou directement sur les dexosomes (9 derniers patients), dont 6 avec de fortes doses de peptide chargé sur les DEX. Les exosomes ont été injectés (sous-cutanés et intradermiques) de manière hebdomadaire dans 4 sites distincts, puis toutes les 3 semaines chez les patients répondeurs (maladie stable ou régression tumorale). Quinze patients ont été admis dans cet essai (mélanome progressif, incluant des métastases cutanées, ganglionnaires, pulmonaires et hépatiques). La vaccination a été bien tolérée sans toxicité limitante. La maladie était stabilisée chez un patient présentant un mélanome de stade III après plus de 8 injections (chargement indirect), un second patient a présenté une réponse mixte caractérisée par une régression au niveau de sites sous-cutanés et une progression au niveau pulmonaire (chargement direct, faible dose de peptide sur les DEX). Un troisième patient a présenté une réponse partielle. Trois autres patients ayant bénéficié d’un traitement impliquant un chargement direct des exosomes avec une forte dose d’antigène ont présenté une stabilisation ou une réponse partielle. Un immunomonitoring chez ces patients a été réalisé afin de déterminer s’il y avait une réponse immunitaire liée au traitement avec des exosomes de cellules dendritiques. L’immunomonitoring des réponse T CD8⁺ n’a pas mis en évidence d’augmentation significative des lymphocytes T CD8⁺ dirigés contre l’antigène MAGE-3, les réactions DTH effectuées avant et à la fin du traitement sont restées négatives.
La conclusion globale de cet essai est d’une part que la vaccination avec des exosomes de cellules dendritiques est réalisable et n’induit pas de toxicité grave et, d’autre part, que des réponses cliniques encourageantes peuvent être obtenues [29]. Cependant ces réponses ne peuvent pas être corrélées à l’apparition de lymphocytes T spécifiques d’après les résultats de l’immunomonitoring. Ces résultats suggèrent la nécessité d’un traitement adjuvant afin de pouvoir optimiser l’immunogénicité T-spécifique des exosomes. Une étude préclinique a été lancée chez l’animal, qui a permis de démontrer que ce traitement adjuvant dans des oligodéoxynucléotides CpG était très immunogène et induisait une réponse T CD8⁺ spécifique efficace.
Une autre étude de phase I est en cours dans le cancer du poumon non à petites cellules. Dans cet essai, 7 patients ayant une tumeur de stade III et IV non réséquable et déjà traités par plusieurs lignes de chimiothérapie ont été inclus. La tumeur exprimait les antigènes MAGE-3, 4 et 10. Après purification, les dexosomes étaient chargés avec les peptides tumoraux synthétiques et injectés aux patients. Trois des sept patients vaccinés ont présenté une stabilisation de longue durée de la maladie (6, 9 et 10 mois respectivement). Les autres patients ont progressé. L’administration des dexosomes a été bien tolérée sans toxicité limitante [Valente, ASCO, 2002].

Rationnel de l’utilisation des exosomes dérivés des cellules tumorales en clinique

L’objectif d’une immunothérapie antitumorale est d’induire une réponse lymphocytaire T cytotoxique dirigée contre de multiples antigènes tumoraux. La vaccination par cellules dendritiques apparaît actuellement comme la plus efficace pour induire des réponses immunologiques. La méthode de chargement idéale des cellules dendritiques doit permettre une présentation d’antigènes tumoraux sans induire d’altérations fonctionnelles des cellules dendritiques. Actuellement, les méthodes de chargement utilisent des débris nécrotiques, des corps apoptotiques, des protéines, les ARN tumoraux.
Nous avons rapporté que les cellules tumorales en culture sécrètent des exosomes in vitro. Ces exosomes contiennent des antigènes tumoraux (Mart1, TRP, gp100…). Les cellules dendritiques chargées avec des exosomes de lignées induisent une activation des lymphocytes T cytotoxiques spécifiques de tumeur. De plus, l’injection d’exosomes de tumeur chez la souris permet une protection tumorale par les lymphocytes T cytotoxiques. Les exosomes de cellules tumorales sont donc une source d’antigènes (connus et inconnus) de tumeurs que l’on pourraient aussi utiliser en les chargeant sur des cellules dendritiques. L’existence d’un procédé de purification permettant l’utilisation en thérapeutique humaine permettrait d’envisager un développement clinique à moyen terme.
Suite aux données obtenues avec les exosomes de cellules tumorales in vitro, nous avons confirmé la présence d’exosomes in vivo dans les épanchements malins des séreuses [4]. Ces exosomes contiennent des antigènes de tumeur tels que Her2-neu, Mart1, TRP et gp100. Le chargement des cellules dendritiques avec les exosomes d’épanchement induit l’expansion de lymphocytes T cytotoxiques spécifiques de tumeur in vitro. De plus, les exosomes d’épanchement sont plus efficaces que les exosomes dérivés de lignées tumorales pour induire une réponse T cytotoxique antitumorale.
Les exosomes dérivés d’épanchement représentent donc une source naturelle d’antigènes tumoraux, capables d’induire des réactions immunologiques in vitro. Cette donnée ouvre de nouvelles perspectives dans le traitement du cancer de l’ovaire et le mésothéliome, tumeurs pour lesquelles il n’existe pas de source d’antigènes de tumeur.

Conclusion

Les exosomes représentent une nouvelle approche de vaccination acellulaire. Après avoir démontré une activité préclinique et avoir mis au point un procédé de purification, nous avons réalisé la première étude de phase I d’immunisation par exosomes. Les prochaines études cliniques intègreront les données récentes obtenues dans le laboratoire, notamment sur l’utilisation d’exosomes « adjuvantisés » (co-injection d’exosomes et de substances adjuvantes : séquences oligodéoxynucléotidiques CpG, ARN double brin (Ampligen®) capables d’augmenter la réaction immunitaire de ces derniers. Elles permettront d’optimiser la réponse T cytotoxique spécifique et d’améliorer les effets antitumoraux ; un essai clinique de phase I-II exosomes et adjuvants devrait ensuite être entrepris.  ▼

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