Le flavopiridol, une protéine kinase dépendante des cyclines

ARTICLE

La connaissance du rôle de ces cdk dans la régulation du cycle cellulaire et la découverte de leur hyperactivation dans presque 90 % des tumeurs humaines sont à l'origine de l'engouement récent pour le développement d'inhibiteurs de cdk. La grande majorité des cellules cancéreuses humaines présente des anomalies au niveau de la voie de phosphorylation qui inactive la protéine Rb, que ce soit à la suite de mutations du gène Rb ou par augmentation de l'activité des cdk, notamment à la suite d'une diminution, voire d'une perte totale des inhibiteurs endogènes de ces cdk, comme les protéines p15, p16, p21 et p27. La perte de ces protéines inhibitrices représente souvent un facteur de mauvais pronostic [4]. Pour ces raisons, les cdk constituent des cibles attractives pour l'élaboration de nouveaux agents cytotoxiques agissant sélectivement sur les cellules tumorales [5, 6].

Au cours des cinq dernières années, un large éventail d'inhibiteurs plus ou moins sélectifs d'une ou de plusieurs cdk a été étudié et quelques-uns d'entre eux font actuellement l'objet d'essais en chimiothérapie anticancéreuse [7]. Le flavopiridol (figure 1) est l'archétype de ces inhibiteurs.

Structure et mécanisme d'action

Le flavopiridol (initialement dénommé L86-8275 ou HMR 1275) est un dérivé flavonoïde semi-synthétique issu de la rohitukine, un alcaloïde isolé de l'écorce d'une plante largement répandue en Inde, Dysoxylum binectariferum [8, 9]. Initialement, il fut décrit comme un inhibiteur de l'activité tyrosine kinase du récepteur de l'EGF et de la protéine kinase A (tableau I) [9]. Mais l'évaluation de son pouvoir antiprolifératif sur le panel de 60 lignées cellulaires du NCI (National Cancer Institute, Maryland, États-Unis) a révélé une action cytotoxique exceptionnelle, avec des IC50 de l'ordre de 66 nM, soit plus de 1 000 fois inférieures à celles obtenues pour des doses inhibant in vitro les deux kinases précitées. L'effet antiprolifératif s'avéra rapidement indépendant du blocage de l'activité du récepteur de l'EGF et l'arrêt du cycle cellulaire en phase G1 ou à la frontière G2/M orienta les recherches sur la piste des cdk 1 et 2 [10]. Les études ultérieures sur enzyme purifiée ont confirmé cette hypothèse. Le flavopiridol inhibe toutes les cdk (cdk 1 à cdk 9) ; son action est cependant plus efficace sur les cdk 1, 2 et 4 que sur la cdk 7 par exemple (tableau I) [11]. L'inhibition peut être levée de manière compétitive par l'ATP, la portion benzopyranone du flavopiridol occupant la position du cycle purine de l'ATP au niveau de la kinase [12].

Parallèlement à l'action directe au niveau des cdk, deux autres mécanismes sont mis en jeu par le flavopiridol. D'une part, le dérivé flavonoïde réduit l'expression de la cycline D1, oncogène surexprimé dans de nombreuses tumeurs humaines [13] et associé à un mauvais pronostic [14, 15]. La diminution du taux de cycline D1 conséquente au traitement des cellules de carcinome mammaire MCF-7 par le flavopiridol est suivie d'une chute du taux de cycline D3, sans variation du taux des cyclines D2 et E, puis d'une perte de l'activité cdk 4. La cycline D1 est un cofacteur essentiel pour l'activation des cdk 4 et 6. L'abolition de l'activité cdk 4 serait la conséquence directe d'une déplétion en ARNm codant pour la cycline D1 [13]. D'autre part, le flavopiridol inhibe l'activité du complexe cdk 7-cycline H empêchant ainsi la phosphorylation des autres cdk au niveau des résidus thréonine en position 160/161 [11, 16].

Dans plusieurs modèles, l'arrêt du cycle cellulaire induit par le flavopiridol s'accompagne d'une induction de l'apoptose. C'est le cas de nombreuses lignées hématopoïétiques [17-19] ou de carcinomes des voies aérodigestives supérieures. En particulier avec la lignée HN30, résistante à plusieurs agents génotoxiques comme la bléomycine et les radiations gamma, l'apoptose induite par le flavopiridol a été associée à une déplétion en cycline D1 indépendamment du statut p53 de ces cellules carcinomateuses [20]. Des observations similaires ont été faites à partir de lignées issues de cancers de la prostate [21], de l'œsophage [22] et du poumon [23, 24]. Le flavopiridol induit également l'apoptose dans un modèle cellulaire particulier au niveau de cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (Huvec). Dans ce modèle de cellules non tumorales, l'apoptose induite par le flavonoïde est indépendante de son effet sur la régulation du cycle cellulaire [25].

Par ailleurs, plusieurs auteurs ont montré un effet anti-invasif et antiangiogénique du flavopiridol. Ces effets ne sont pas nécessairement la conséquence d'une inhibition des cdk mais pourraient impliquer d'autres cibles protéiques [25-27]. D'une part sur un modèle de cancer du sein, Li et al. [28] ont récemment proposé que l'inhibition de l'invasion cellulaire par le flavopiridol serait la conséquence directe d'une diminution de sécrétion des métalloprotéases matricielles, elle-même engendrée par une inhibition de l'expression du gène c-erbB-2. La surexpression de ce gène dans les cancers du sein est corrélée à l'invasion et à la progression métastatique de ces tumeurs [29]. D'autre part, dans une étude récente, l'expression du VEGF induite par un stress hypoxique sur des monocytes humains est modifiée [27]. Dans ce modèle, le flavopiridol affecte l'expression génique en altérant la stabilité des ARNm. La diminution importante de la demi-vie des ARNm codant pour le VEGF pourrait être à l'origine de l'activité antiangiogénique du flavopiridol puisque le VEGF représente un stimulus physiopathologique pour l'induction de l'angiogenèse in vivo [27].

Un autre point essentiel au mécanisme d'action du flavopiridol concerne l'insensibilité de ce composé vis-à-vis des phénomènes de résistance multidrogue. Les lignées prostatiques 5637 et UMUC-3, résistantes à la doxorubicine du fait de la surexpression de la protéine MDR1, ne présentent pas de résistance croisée avec le flavopiridol. Au contraire, la surexpression de la glycoprotéine P (Pgp, codée par le gène MDR1) accroît légèrement la sensibilité de ces cellules au flavopiridol, ce qui incite à l'utilisation de ce flavonoïde pour le traitement des cancers de la prostate chimiorésistants [21]. De même, le transporteur MRP1, principalement impliqué dans le transport des composés neutres et anioniques tels que les glucuronidates et les conjugués du glutathion, interagit avec le flavopiridol. Ce dernier diminue le transport de molécules en stimulant l'activité ATPasique du transporteur. De cette manière, de faibles concentrations en flavopiridol (100 nM) permettent d'accroître significativement l'accumulation de la daunorubicine dans les cellules résistantes GLC4/ADR issues d'un cancer du poumon humain à petites cellules surexprimant le transporteur MRP1 [30]. De ce fait, le flavopiridol, tout comme d'autres dérivés flavonoïdes, pourrait jouer un rôle de modulateur de la résistance multidrogue en favorisant l'action des substrats de la MRP1, tels que la daunorubicine, la vincristine ou encore l'étoposide.

Tout récemment, une lignée de cellules d'un carcinome ovarien résistante au flavopiridol a été caractérisée [31]. Cette lignée OV202 hp présente une résistance croisée avec le cisplatine alors que sa sensibilité à d'autres médicaments ­ oxaliplatine, paclitaxel, topotécan, étoposide, doxorubicine, vincristine et 5-fluoro-uracile ­ reste inchangée. L'acquisition de cette résistance au flavopiridol et au cisplatine n'est liée ni à une modification des taux de cyclines A, D et E et des CDK 2 et 4, ni à une modification du taux de Pgp, ni même à un défaut de la machinerie apoptotique, mais serait liée à une diminution des deux médicaments dans ces cellules OV202 [31].

Le flavopiridol agit de manière synergique avec plusieurs médicaments antitumoraux conventionnels [32]. À des concentrations nanomolaires non cytotoxiques, il potentialise l'effet proapoptotique de la mitomycine C et du paclitaxel sur des lignées de cancers du sein et de l'estomac [33, 34]. L'observation d'une forte synergie avec le paclitaxel dans plusieurs modèles cellulaires, dont la lignée A549 issue d'un cancer du poumon non à petites cellules [32], a récemment conduit au développement d'essais cliniques de phase I [35]. Des travaux récents montrent qu'in vitro, le flavopiridol présente un effet chimiopréventif des anomalies chromosomiques et des instabilités génétiques induites par le paclitaxel [36].

Enfin, tout récemment, une autre facette du mécanisme d'action du flavopiridol a été dévoilée. Sur la base d'études spectroscopiques et biochimiques, Bible et al. [37] ont démontré l'existence d'une interaction forte entre l'ADN et le flavopiridol. La fixation du ligand à la double hélice d'acides nucléiques, vraisemblablement par intercalation entre les paires de bases, serait à l'origine de la toxicité du produit vis-à-vis des cellules non prolifératrices. Mais l'affinité du flavopiridol pour l'ADN est 8 à 10 fois plus faible que celle mesurée avec des agents intercalants conventionnels comme les anthracyclines. La fixation à l'ADN engendre une inhibition de la synthèse d'ARN ainsi qu'une augmentation du taux de la protéine p53 dans la lignée d'un carcinome du poumon non à petites cellules (A549). À ce niveau, l'effet du flavopiridol est comparable à celui de l'étoposide bien que cet inhibiteur de cdk soit sans effet sur l'activité catalytique des topo-isomérases I et II [37].

Études précliniques

Aux congrès de l'American Association for Cancer Research de 1998 et 1999, le flavopiridol intéressait pas moins de 17 présentations. C'est dire l'intérêt porté à cette molécule. L'activité antitumorale in vitro du flavopiridol montrait une certaine spécificité vis-à-vis de lignées prostatiques, résultats confirmés par les études in vivo [38]. Administré par voie orale, à 10 mg/kg/j (dose maximale tolérée), le flavopiridol permet une régression tumorale, prolongée au-delà de 4 semaines pour des cancers de prostate humains (PRXF1337 et PRXF1369) greffés chez la souris. La régression tumorale est également complète pour 4 des 5 souris portant une leucémie (HL60) et 4 des 8 souris portant un lymphome folliculaire (SUDHL-4), toutes traitées par le flavopiridol à 7,5 mg/kg/j, en bolus intraveineux pendant 5 jours. L'administration continue n'apporte pas d'amélioration [18]. À 5 mg/kg/j en bolus intrapéritonéal, le flavopiridol permet une régression de 60 à 70 % de la taille de la tumeur des voies aérodigestives supérieures (HN12) et la survie est prolongée plus de 10 semaines [20]. Enfin, sa faible biodisponibilité (de l'ordre de 20 % chez le rat), sa toxicité gastro-intestinale et sa tolérance médiocre per os ne permettent pas d'envisager une administration clinique orale. Aussi bien chez la souris que chez le chien, le profil pharmacocinétique est semblable et bicompartimental. Le flavopiridol est métabolisé dans le foie et éliminé dans la bile [39]. Aucune lésion organique n'a été observée chez l'animal.

Essais cliniques

Le flavopiridol est la première molécule inhibitrice de cdk en essai clinique. Dans un essai mené par le NCI, 76 patients ont été traités par le flavopiridol en perfusion continue de 72 heures toutes les 2 semaines [7]. Une diarrhée sécrétoire est la dose toxique limitante (DLT) et la dose maximale tolérée est de 78 mg/m²/j ou de 50 mg/m²/j respectivement en présence et en l'absence d'un traitement prophylactique antidiarrhéique. Une hypotension dose-limitante (mais réversible) et un syndrome pseudo-inflammatoire surviennent également à 98 mg/m²/j. La relation entre le mode d'action du flavopiridol et la survenue de ces deux effets indésirables est encore inconnue. Deux patients atteints d'une pathologie rénale ont présenté une réponse partielle ou mineure, et 2 patients porteurs d'un lymphome non hodgkinien ou d'un cancer du côlon ont présenté également une réponse mineure. Aux doses maximales tolérées, la concentration plasmatique de flavopiridol est de 344 et 271 nM (à 78 mg/m²/j et 50 mg/m²/j), marge thérapeutique nécessaire à l'activité anti-cdk in vitro. On observe également une certaine stabilisation des cancers en cours de traitement par le flavopiridol. Quatorze patients ont reçu du flavopiridol pendant plus de 6 mois (5 patients plus de 1 an et 1 patient plus de 2 ans).

Dans un autre essai clinique et selon le même schéma d'administration, une réponse complète a été observée chez un patient porteur d'un cancer gastrique résistant au fluoro-uracile [40]. Vingt-sept patients étaient inclus dans un autre essai de phase I mais selon un schéma d'administration différent : une perfusion quotidienne courte (1 heure) pendant 5 jours toutes les 3 semaines [41]. Quel que soit le traitement prophylactique préalable, la dose recommandée est de 37,5 mg/m²/j et les DLT sont les nausées, vomissements, neutropénie, fatigue et diarrhée. Ce protocole se poursuit en administrant le flavopiridol sur 3 jours. En toute logique, des essais de phase II dans les cancers du rein et dans les cancers gastriques métastatiques ont été initiés [42, 43]. Diarrhée, asthénie et, de manière surprenante, thrombose artérielle ou veineuse sont apparues respectivement chez 20 %, 83 % et 26 % des patients dans le premier essai. Dans le deuxième essai clinique, 42 % des patients ont même présenté une thrombose [43]. De même, malgré un prolongement de la survie, aucune réponse objective n'a été observée dans cette population de patients présentant un cancer rénal. Une réponse partielle a également été observée dans les cancers gastriques. Des essais de phase II dans les cancers pulmonaires non à petites cellules [44] et colorectaux [45] ont donné des résultats aussi peu encourageants. La dose recommandée dans ces essais cliniques est vraisemblablement trop élevée ; 40 mg/m²/j en perfusion de 72 heures toutes les 2 semaines pour atteindre une concentration de 0,5 mg/ml est la dose de flavopiridol préconisée pour les essais cliniques ultérieurs.

Les espoirs se tournent vers les associations thérapeutiques, et plus particulièrement celles incluant le paclitaxel. D'autant plus qu'une réponse complète est caractérisée dans un premier essai de phase I, la dose de paclitaxel étant fixée (sur 3 heures) et précédant de 24 heures l'administration de flavopiridol (sur 24 heures) [46]. La neutropénie représente la DLT pour des doses associées de paclitaxel (100 mg/m²) et de flavopiridol (20 mg/m²), recommandées dans les essais suivants. Un essai de polychimiothérapie est excessivement prometteur. Il semblerait que l'association de paclitaxel suivi de flavopiridol et de cisplatine, administrés respectivement aux doses de 175 mg/m² (3 heures à J1), 80 mg/m² (24 heures à J2) et 50 mg/m² (J2) toutes les 3 semaines, soit bien tolérée et efficace, même dans des cancers de l'œsophage, du poumon ou de la prostate réfractaires aux taxanes [47].

La difficulté de prescription de cette nouvelle molécule est une des conclusions qui ressort des premiers essais cliniques. Il est rare d'inclure plus de 60 patients dans un essai clinique de phase I, ce qui a été le cas pour cette molécule [7]. Il est rare également d'observer des toxicités limitantes aussi diversifiées (hypotension, diarrhée, neutropénie et surtout thrombose).

CONCLUSION

Le flavopiridol fut le premier inhibiteur des protéines kinases dépendantes des cyclines à entrer dans l'arène des essais cliniques. Son action n'est cependant pas restreinte aux kinases dépendantes des cyclines puisqu'il agit également au niveau de la cycline D1 et présente une activité antiangiogénique non négligeable. La découverte toute récente d'une interaction forte avec l'ADN vient également contrarier la spécificité d'action du flavopiridol. La multiplicité des cibles intracellulaires explique peut-être en partie les toxicités multiples dénombrées au cours des essais cliniques. Lors des essais de monothérapie, le flavopiridol n'a pas encore apporté de résultats très encourageants bien que quelques réponses complètes ou partielles aient été épisodiquement rapportées. L'espoir se porte davantage sur son utilisation en association avec le cisplatine et le paclitaxel, notamment pour le traitement des cancers du poumon et de la prostate. À ce jour, l'avenir du flavopiridol reste incertain.

Article reçu le 13 juillet 2000, accepté le 5 septembre 2000.

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