Transmission des signaux de la membrane vers le noyau : variations sur des thèmes communs

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Le développement et le fonctionnement des organismes pluricellulaires dépendent de leur capacité à intégrer les signaux extracellulaires et à fournir une réponse biologique appropriée. Ces réponses peuvent participer au développement normal, comme la prolifération, la différenciation ou la mort cellulaire programmée. Elles permettent également à l'organisme de mettre en place des réponses adaptatives, par exemple la résistance aux agressions extérieures comme les agents de stress environnementaux. À l'inverse, lorsque la cellule n'est plus capable d'intégrer correctement les signaux extracellulaires, elle peut proliférer de manière anarchique et devenir cancéreuse. L'étude des voies de signalisation intracellulaires représente donc une étape indispensable à la compréhension des mécanismes du développement tumoral.

Pour que la cellule s'adapte aux modifications du milieu extracellulaire, il faut qu'elle puisse « sentir » les variations de ce milieu au moyen de récepteurs. Les signaux reçus par ces récepteurs devront être ensuite intégrés à l'intérieur de la cellule, puis transmis aux molécules effectrices de la réponse biologique. La réponse peut être rapide et faire intervenir des molécules déjà présentes dans la cellule. Pour une réponse à plus long terme, les protéines effectrices devront moduler le programme d'expression génique et agir, dans le noyau, au niveau de la régulation de la transcription de certains gènes.

Ainsi, dans de très nombreux cas, les molécules effectrices appartiennent à la classe des facteurs de transcription, capables de se fixer à des séquences d'ADN spécifiques dans les promoteurs de certains gènes et d'en réguler l'expression. Dans ces conditions, l'information contenue dans les stimulus extracellulaires devra être véhiculée depuis la surface de la cellule jusqu'à l'intérieur du noyau.

Le but de cette revue est de présenter brièvement cinq exemples de voies de signalisation intracellulaires intensément étudiées, puis de définir les stratégies communes aux différentes voies, ainsi que leur intérêt respectif.

Diversité des voies de signalisation intracellulaires

Les récepteurs nucléaires : une voie de signalisation directe

Les récepteurs nucléaires forment une famille de protéines possédant à la fois des domaines caractéristiques des facteurs de transcription (domaine transactivateur, domaine de liaison à l'ADN et domaine de dimérisation), mais également un domaine de liaison du ligand (figure 1) (pour revue, voir [1]). Grâce à leur structure lipophile, les ligands de ces récepteurs, comme les hormones stéroïdiennes, thyroïdiennes ou les morphogènes comme l'acide rétinoïque, peuvent traverser la bicouche lipidique de la membrane plasmique et se lier à leur récepteur, directement dans le noyau. La liaison du ligand à son récepteur provoque un changement de conformation allostérique qui augmente son affinité pour les sites de liaison à l'ADN, et permet son interaction avec plusieurs cofacteurs, comme la protéine nommée p300 [2]. Cette protéine, lorsqu'elle est positionnée à proximité d'une région promotrice, est capable d'interagir avec la machinerie générale de transcription et de l'activer. Cela se traduit par la modulation de l'expression de certains gènes cibles, impliqués dans la réponse hormonale ou le développement embryonnaire.

Dans le cas de la signalisation par les récepteurs nucléaires, c'est donc le facteur de transcription lui-même qui joue le rôle de récepteur de l'information. Ce moyen de transmission direct impose que le ligand du récepteur soit capable de traverser la membrane plasmique puis l'enveloppe nucléaire.

Cependant, dans la vaste majorité des cas, le ligand est un polypeptide hydrophobe incapable de franchir la membrane cellulaire : son récepteur est alors situé à la surface de la cellule. Quatre grandes classes de récepteurs sont représentées à la membrane plasmique : les récepteurs à sept domaines transmembranaires couplés aux protéines G hétérotrimériques, les récepteurs à activité tyrosine kinase, les récepteurs à activité sérine/thréonine kinase et les récepteurs des cytokines, dépourvus d'activité kinase. La transmission des signaux à partir de ces récepteurs membranaires suppose donc qu'un ou plusieurs relais intracellulaires soient établis afin de permettre le transport de l'information vers le noyau.

La voie JAK/STAT

La voie JAK/STAT fait intervenir des facteurs de transcription qui présentent la particularité d'être activés au niveau de la membrane plasmique (figure 2) (pour revues, voir [3, 4]). L'activation de cette voie est déclenchée en réponse aux interférons, à un grand nombre de cytokines et à certains facteurs de croissance. Les récepteurs des cytokines sont des molécules transmembranaires dépourvues d'activité kinase intrinsèque, mais associées en permanence avec des protéines kinases cytoplasmiques à spécificité tyrosine nommées JAK (JAnus Kinase), qui forment une famille constituée d'au moins quatre membres (JAK1 à 3, Tyk2). La liaison des cytokines à leur récepteur déclenche la dimérisation des sous-unités des récepteurs, ce qui positionne deux JAK, associées à chaque sous-unité, à proximité l'une de l'autre. Par exemple, l'interféron a fait intervenir le couple JAK1-Tyk2 alors que l'interféron g mobilise la paire JAK1-JAK2. Les JAK sont alors activées, vraisemblablement par transphosphorylation, et phosphorylent à leur tour plusieurs résidus tyrosines situés dans la partie cytoplasmique du récepteur. Ces tyrosines phosphorylées constituent des sites de reconnaissance et de liaison pour des domaines SH2 (Src homology 2), présents dans la séquence des facteurs de transcription STAT (signal transducers and activators of transcription) (figure 2), qui forment une famille composée d'au moins sept formes [4]. Les STAT, ainsi recrutés au niveau des récepteurs, sont phosphorylés par les JAK sur un résidu tyrosine situé dans la région C-terminale de la protéine [5] (figure 2). Une fois phosphorylés, les STAT se dissocient du récepteur pour former des homo- ou hétérodimères avec d'autres membres de la famille par l'intermédiaire d'interactions réciproques entre les domaines SH2 et les phosphotyrosines [6]. Ces dimères sont alors transportés dans le noyau où ils se lient à des éléments spécifiques présents dans le promoteur de certains gènes, comme les gènes codant pour les protéines des complexes majeurs d'histocompatibilité, et modulent ainsi leur expression (figure 2).

Dans la voie JAK/STAT, c'est donc le facteur de transcription lui-même qui sert d'intermédiaire entre les récepteurs membranaires et l'activation nucléaire de la transcription.

Il est à noter que la voie de signalisation déclenchée par le TGF-b fait également intervenir un mécanisme dans lequel le facteur de transcription sert d'intermédiaire direct entre les récepteurs membranaires et le noyau. En effet, la liaison du TGF-b à son récepteur, un membre de la famille des récepteurs à activité sérine/thréonine kinase, déclenche la phosphorylation de facteurs cytoplasmiques nommés SMAD par le récepteur lui-même. Une fois phosphorylés, ces facteurs sont relocalisés dans le noyau où ils provoquent l'expression de certains gènes (pour revue, voir [7]).

La voie NF-kB

Les facteurs de transcription NF-kB forment une famille de protéines, dont le membre le mieux caractérisé est constitué d'un hétérodimère entre une protéine de 50 kDa (p50 ou NF-kB1) et une protéine de 65 kDa (p65 ou RelA) (figure 3). Dans la plupart des cellules, le dimère p65/p50 NF-kB forme un complexe cytoplasmique avec la protéine inhibitrice IkBa (figure 3) (pour revue, voir [8]). Cette interaction a pour effet de séquestrer le facteur de transcription dans le cytoplasme et de l'empêcher ainsi de contacter ses sites de fixation sur l'ADN.

La voie NF-kB est activée en réponse à plusieurs cytokines comme le TNFa (tumor necrosis factor) ou les interleukines 1 et 2, mais également en réponse à des stress environnementaux comme les lipopolysaccharides. La liaison du TNF-a à son récepteur provoque le recrutement de plusieurs protéines adaptatrices, interagissant entre elles par l'intermédiaire de domaines conservés, nommés death domains. Ces facteurs interagissent eux-mêmes avec d'autres protéines, parmi lesquelles une protéine kinase à spécificité sérine/thréonine nommée NIK (NF-kB-inducing kinase), ce qui provoque son activation [9] (figure 3). NIK, par un mécanisme encore inconnu, stimule à son tour deux protéines kinases à spécificité sérine/thréonine récemment identifiées, IKK (IkB kinase) a et b (pour revue, voir [10]). Ces deux protéines kinases appartiennent à un complexe de haut poids moléculaire (700 kDa) et sont toutes deux capables de phosphoryler sur deux résidus sérines situés dans la région N-terminale de IkBa. La phosphorylation de ces deux résidus constitue un signal pour l'ubiquitinylation et la dégradation de IkBa par le complexe du protéasome [11]. La dégradation de IkBa a pour conséquence de libérer les dimères p65/p50 [12], qui sont rapidement transférés dans le noyau, où ils se fixent dans la région promotrice de certains gènes, notamment des gènes impliqués dans la réponse immunitaire et inflammatoire, et modulent ainsi leur expression (figure 3).

La voie NF-kB, bien que moins directe que la voie JAK/STAT, présente également un exemple de transmission des signaux dans lequel le relais entre les événements cytoplasmiques et nucléaires est réalisé par le facteur de transcription lui-même.

Dans la majorité des cas cependant, les facteurs de transcription sont des protéines principalement nucléaires. Leur activation implique donc que le signal soit transporté lui-même dans le noyau.

La voie PKA : un exemple de transmission par messager secondaire

Dans les cellules non stimulées, la PKA (protéine kinase dépendante de l'AMPc) est une holoenzyme composée de deux sous-unités catalytiques possédant une activité sérine/thréonine kinase (C) et de deux sous-unités régulatrices (R) (figure 4). Les sous-unités régulatrices sont elles-mêmes associées aux membranes de la région périnucléaire, par interaction avec des ancres spécifiques, les AKAP (A kinase anchoring protein) [13], ce qui maintient la PKA dans le cytoplasme.

La fixation de ligands, comme l'adrénaline ou la prostaglandine E1, à des récepteurs couplés aux protéines G hétérotrimériques, déclenche l'activation des sous-unités Ga_S. Les protéines Ga_s, une fois activées, provoquent la stimulation de l'adénylate cyclase, qui convertit l'AMP en AMP cyclique. L'AMPc joue le rôle de « second messager » : en se liant aux sous-unités régulatrices de la PKA, il provoque la dissociation des deux sous-unités catalytiques qui sont alors relocalisées dans le noyau. Une des cibles nucléaires des sous-unités catalytiques de la PKA est le facteur de transcription CREB (cyclic AMP responsive element binding protein) (figure 4) (pour revue, voir [14]). La phosphorylation par la PKA de la sérine 133 de CREB stimule sa capacité à activer la transcription [15], et augmente son affinité envers la protéine nucléaire p300/CBP (CREB binding protein) [16]. Cette dernière, positionnée à proximité de la région promotrice grâce à son interaction avec CREB, active l'expression des gènes cibles par interaction avec la machinerie générale de transcription [16].

Dans la signalisation par la voie PKA, le facteur de transcription est localisé dans le noyau et c'est donc une protéine kinase qui sert de relais entre la série d'événements cytoplasmiques et nucléaires.

La voie Ras/MAPK : un exemple de transmission en cascade

La voie Ras/MAPK (mitogen-activated protein kinase) est activée en réponse à de nombreux stimulus extracellulaires, particulièrement par les facteurs de croissance. Cette activation est déclenchée majoritairement par les récepteurs à activité tyrosine kinase, mais aussi par des récepteurs couplés aux protéines G hétérotrimériques, et fait intervenir un grand nombre d'étapes entre la membrane et le noyau.

* Des récepteurs à Ras : une série d'adaptateurs

La liaison des facteurs de croissance aux récepteurs à activité tyrosine kinase provoque leur dimérisation, ce qui entraîne la stimulation de l'activité kinase de ces récepteurs, vraisemblablement par modification conformationnelle. Chaque sous-unité du récepteur phosphoryle l'autre sous-unité, sur plusieurs résidus tyrosine présents dans le domaine intracellulaire. Ces tyrosines phosphorylées servent de sites de reconnaissance pour les domaines SH2 de nombreuses protéines, à l'origine de l'activation de plusieurs voies de signalisation, parmi lesquelles la voie menant à l'activation de Ras (figure 5A) (pour revue, voir [17]). En effet, le recrutement à proximité de la membrane plasmique des protéines adaptatrices comme Shc ou Grb2, permet de positionner à proximité de Ras son facteur d'échange, la protéine Sos. Cette relocalisation, qui a pour effet d'activer Ras, est réalisée par le jeu d'interactions protéiques faisant intervenir le domaine SH3 (Src homology 3) de Grb2 et une région riche en résidus proline de Sos [18].

* Le cycle de Ras

Les protéines Ras (H-Ras, K-Ras et N-Ras) appartiennent à la famille des petites protéines liant le GTP (pour revue, voir [19]). Elles sont constituées d'un domaine globulaire représentant le site de fixation du nucléotide (GDP ou GTP) et d'une région C-terminale qui se termine par un site de farnésylation. L'addition d'un groupement farnésyl à la cystéine de ce motif ainsi que de groupements palmytoyls à des cystéines situées plus en amont permet l'ancrage permanent de Ras à la membrane plasmique. La protéine Ras suit un cycle analogue à celui des autres protéines G (figure 5B) : sous la forme GDP, Ras est inactive. L'échange du GDP pour le GTP est très lent mais peut être accéléré par des facteurs d'échange, comme la protéine Sos. Sous sa forme liant le GTP, Ras peut interagir avec différents effecteurs, tels Raf, la phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K) ou le facteur d'échange de la petite protéine G Ral (pour revue, voir [20]). L'hydrolyse du GTP, qui permet le retour de Ras à une forme inactive liant le GDP, est quant à elle accélérée par des protéines GAP (GTPase activating protein).

* Activation de la cascade des MAP kinases

Une des cibles de Ras est la protéine kinase cytoplasmique à spécificité sérine/thréonine, c-Raf (pour revue, voir [21]). Le domaine effecteur de Ras lié au GTP interagit avec la région N-terminale de Raf (domaine CR1), ce qui permet la relocalisation de Raf à proximité de la membrane plasmique et son activation (figure 5C). Le mécanisme de cette activation n'est pas tout à fait élucidé, mais ferait intervenir des événements de phosphorylation à la fois sur des résidus tyrosine et sérine/thréonine. Cependant, les protéines kinases responsables de ces activations ne sont pas formellement identifiées. L'interaction de Raf avec les protéines 14-3-3 et une oligomérisation de plusieurs molécules Raf jouent également un rôle dans son activation (figure 5C).

Une fois activée, la protéine kinase Raf phosphoryle et active à son tour une protéine kinase à double spécificité sérine/thréonine et tyrosine, la MAPK kinase kinase (MKK). La MKK phosphoryle elle-même une troisième protéine kinase à spécificité sérine/thréonine, la MAP kinase (MAPK) sur deux résidus : une thréonine et une tyrosine, ce qui provoque son activation (pour revue, voir [22]) (figure 6). La MAPK est alors relocalisée dans le noyau [23] où elle phosphoryle certains facteurs de transcription, comme Elk1, qui appartient à la famille des TCF (ternary complex factor) [24] (figure 6). La phosphorylation de Elk1 augmente son activité transcriptionnelle [25] et sa capacité à former un complexe avec un autre facteur de transcription, le facteur SRF (serum responsive factor) [26], ce qui se traduit par l'expression des gènes cibles, comme le gène c-fos.

Tout comme dans la voie PKA, c'est une protéine kinase, la MAPK, qui sert de relais entre les événements cytoplasmiques et nucléaires.

Intérêt d'un système comportant plusieurs étapes comme celui de la voie MAPK

La différence majeure entre les voies de signalisation présentées dans cette revue réside dans le nombre d'étapes mises en jeu entre la membrane plasmique et le noyau, qui varie de un, dans le cas des récepteurs nucléaires, à dix, dans le cas de la voie Ras/MAPK.

Le nombre d'étapes influence-t-il la rapidité de transmission des signaux ? A priori, une voie de signalisation comportant de multiples étapes, comme la voie MAPK, pourrait fonctionner plus lentement qu'une voie de signalisation plus directe, telle la voie JAK/STAT. Cependant, le cytoplasme est une structure semi-fluide : la diffusion d'une même molécule entre les différents compartiments subcellulaires pourrait donc se révéler plus lente que la transmission de l'information par des protéines préalablement organisées dans l'espace intracellulaire. En outre, la vitesse de transmission des signaux pourrait être affectée par certaines étapes limitantes, comme le transfert dans le noyau. Cette question n'est donc pas résolue à l'heure actuelle, mais il faut souligner que les cascades de signalisation déclenchées à partir de récepteurs membranaires conduisent toutes à l'induction rapide de l'expression des gènes cibles (de l'ordre de 10 min), ne montrant donc pas de différence nette de rapidité de transmission, quel que soit le nombre d'étapes mises en jeu.

Un nombre d'étapes élevé permet-il une amplification des signaux ? Du point de vue théorique, l'amplification résultant d'une cascade de trois protéines kinases comme celle des MAPK, phosphorylant chacune par exemple 1 000 molécules cibles, pourrait atteindre un facteur 10⁹. Compte tenu du nombre effectif de molécules par cellules de mammifères, le facteur d'amplification dû à la cascade MAPK est en réalité d'un facteur 100 à 500 au maximum [27]. Ce facteur d'amplification relativement faible pourrait donc être obtenu sans faire intervenir une cascade de trois protéines kinases.

Ces observations indiquent donc que, même si elles existent, la rapidité de transmission de signaux et l'amplification ne sont pas les caractéristiques primordiales d'un système de transmission comportant de multiples étapes.

Quel est donc l'intérêt d'un tel système ? D'une part, les calculs numériques des constantes d'association et de dissociation de la voie MAPK indiquent qu'un tel système en cascade aboutirait à la régulation très sensible de l'activation de la MAPK, qui s'apparenterait ainsi à celle d'un système allostérique [27]. D'autre part, l'intérêt majeur d'un système utilisant plusieurs protéines en cascade est le nombre et la variété des niveaux de régulations possibles. Dans le cas de la cascade Ras/MAPK, les régulations peuvent s'exercer au niveau des récepteurs, des adapteurs, du cycle de Ras, de la cascade de protéines kinases. Le nombre important d'étapes permet également la convergence de plusieurs voies de signalisation vers un même module, ainsi qu'un système de branchements vers d'autres voies de signalisation. Par exemple, la PKA est capable de moduler l'interaction entre Ras et Raf en phosphorylant Raf sur un résidu sérine [28]. La MAPK est également capable de phosphoryler certains membres de la famille des récepteurs nucléaires et participerait ainsi à leur régulation [29]. Enfin, la MAPK est capable d'interagir avec certains membres de la famille STAT et jouerait ainsi un rôle important dans la transmission du signal par la voie JAK/STAT en réponse aux cytokines [30].

Une étape obligatoire : le franchissement de l'enveloppe nucléaire

Tous les mécanismes de signalisation aboutissant à une modulation de l'expression des gènes doivent obligatoirement faire intervenir une étape de transport de l'information dans le noyau. Comme cela a été décrit précédemment, les protéines qui servent de relais entre le cytoplasme et le noyau sont diverses (facteurs de transcription, protéines kinases), mais, de plus, les stratégies utilisées pour le passage de l'enveloppe nucléaire présentent des différences notables.

Entrée dans le noyau par diffusion : le cas de PKA (et de la MAPK ?)

L'enveloppe nucléaire est constituée d'une double membrane interrompue par des complexes multiprotéiques formant des pores de 10 nm de diamètre, à travers lesquels les ions, les métabolites et les protéines dont la masse moléculaire est inférieure à 40-60 kDa peuvent diffuser de manière passive (pour revue, voir [31]). La vitesse de diffusion est généralement inversement proportionnelle à la masse moléculaire des protéines. La sous-unité catalytique de la PKA, de masse moléculaire de 38 kDa, est capable de diffuser passivement dans le noyau [32]. La régulation de la translocation nucléaire de la PKA en fonction de la stimulation est donc déterminée par son interaction différentielle avec les sous-unités régulatrices, de masse moléculaire élevée (90 kDa sous forme de dimère), qui constituent un système d'ancrage cytoplasmique. La MAPK, dont les deux isoformes présentent une masse moléculaire de 42 ou 44 kDa, est également capable d'entrer dans le noyau par diffusion [33]. Un mécanisme d'ancrage cytoplasmique, faisant intervenir le propre activateur de la MAPK, la MKK, a récemment été proposé pour expliquer la régulation de la translocation de la MAPK [33].

Entrée dans le noyau par le système dépendant d'un NLS : récepteurs nucléaires et NF-kB

Les protéines de masse moléculaire supérieure à 40-60 kDa sont transférées dans le noyau par un transport actif nécessitant une séquence d'adressage : le NLS (nuclear localisation signal) (pour revue, voir [34]). Les NLS ont été identifiés pour la première fois dans l'antigène T du virus SV40 ; ils ne suivent pas un consensus précis mais se répartissent en deux classes : des courtes séquences de 4 à 7 acides aminés enrichies en résidus basiques et des séquences bipartites plus longues comportant deux séquences de résidus basiques séparées par une dizaine d'acides aminés (figure 7). Les protéines possédant un NLS sont reconnues par un récepteur de 60 kDa, l'importine a (figure 7). L'importine a est capable d'interagir avec une autre molécule de 97 kDa, l'importine b, qui permet la relocalisation du complexe à la surface cytoplasmique du pore nucléaire, par interaction avec des protéines constituant ce pore, nommées nucléoporines. Cette première étape ne requiert pas d'énergie. En revanche, la deuxième étape du transport, qui correspond à la translocation proprement dite de la protéine à travers le pore nucléaire, nécessite de l'énergie, fournie principalement par l'hydrolyse du GTP effectuée par la petite protéine G nucléaire, nommée Ran.

Les récepteurs nucléaires, ainsi que la plupart des facteurs de transcription comme NF-kB, c-Jun ou c-Myc, possèdent des NLS et sont donc transportés dans le noyau de manière active. Cela peut se faire de manière non régulée : dès leur synthèse, les protéines sont localisées dans le noyau et les signaux devront être alors transportés jusqu'au noyau ; c'est le cas de la plupart des récepteurs nucléaires, des facteurs de transcription CREB (voie PKA) ou Myc (voie MAPK). Dans d'autres cas en revanche, la translocation nucléaire des protéines possédant un NLS est régulée. La régulation peut se faire par phosphorylation : par exemple, la phosphorylation du facteur de transcription NF-AT [35] ou celle de la forme oncogénique de Jun (v-Jun) empêche le NLS de fonctionner [36]. Cela est probablement dû au fait que les charges négatives portées par les groupements phosphates annulent l'effet des charges positives des résidus basiques du NLS. Le transport nucléaire de ces facteurs nécessite donc une étape de déphosphorylation, effectuée par des phosphatases, comme la calcineurine dans le cas de NF-AT [35]. La régulation du transport peut également faire intervenir une interaction entre protéines. Par exemple, le NLS du facteur de transcription NF-kB est masqué par son interaction avec l'inhibiteur IkB ou par la partie C-terminale des formes précurseurs de NF-kB [37], ce qui empêche sa translocation nucléaire. Malgré la différence dans le mode de transfert, la voie NF-kB présente un cas similaire à celui de la voie PKA, avec des protéines cytoplasmiques de masse moléculaire élevée, pouvant servir d'ancre afin d'empêcher la translocation de protéines capables d'entrer dans le noyau. C'est la dissociation d'avec l'ancre (voie PKA) ou sa dégradation (voie NF-kB) qui permet donc la relocalisation nucléaire de ces protéines.

Autres stratégies de transfert nucléaire : le cas des STAT

Certaines protéines de masse moléculaire élevée sont capables de pénétrer dans le noyau, mais ne présentent pas de séquence NLS caractéristique. Pour ce type de protéines, le transport dans le noyau peut se faire soit par cotransport avec des protéines possédant un NLS, soit par un système de translocation indépendant du NLS. Un tel système a récemment été identifié pour expliquer la translocation de la ribonucléoparticule hnRNPA1 et fait intervenir une séquence de 38 acides aminés, nommée « séquence M9 » [38]. Cette séquence ne présente aucune analogie avec un NLS, mais elle est reconnue par un récepteur, la transportine, très similaire à un des récepteurs des NLS, l'importine b [38].

Les facteurs de transcription STAT, dont la masse moléculaire avoisine les 90 à 100 kDa, ne possèdent pas de séquence NLS et leur mécanisme de transport nucléaire n'a pas encore été élucidé. Il pourrait faire intervenir des séquences nouvelles, reconnues par les récepteurs des pores nucléaires. Par ailleurs, la translocation des STAT étant dépendante de leur phosphorylation sur tyrosine et de l'intégrité de leur domaine SH2 [39], il est possible qu'ils soient transportés dans le noyau par une protéine annexe possédant un NLS, via une interaction entre des domaines SH2 et des tyrosines phosphorylées.

L'étude des voies de signalisation choisies en exemple met en évidence la diversité des moyens utilisés par la cellule pour la transmission de l'information et le passage de l'enveloppe nucléaire. Cependant, ces stratégies a priori très différentes font apparaître plusieurs points communs.

Stratégies communes

Reconnaissance entre protéines

Pour permettre la transmission de l'information, la même molécule peut parcourir tous les compartiments subcellulaires, comme le ligand des récepteurs nucléaires, mais le plus souvent plusieurs molécules prennent le relais. L'interaction entre les protagonistes de la signalisation joue alors un rôle crucial pour assurer le passage ordonné de l'information. L'interaction entre protéines peut être utilisée pour relocaliser les molécules à un endroit précis de la cellule, afin de les positionner au contact de leurs activateurs ou de leurs substrats : c'est le cas des interactions récepteur/
Grb2/Sos, qui permettent de mettre en contact Ras et son facteur d'échange Sos, de l'interaction Ras/Raf qui entraîne Raf à proximité de ses activateurs potentiels situés au niveau de la membrane plasmique et de l'interaction récepteur/STAT qui positionne les STAT à proximité des récepteurs et permet ainsi leur phosphorylation par les JAK. À l'inverse, l'interaction entre protéines peut être utilisée afin de séquestrer des protéines dans un compartiment cellulaire et de les empêcher ainsi d'entrer en contact avec leurs substrats : c'est le cas par exemple de l'interaction entre IkB et NF-kB ou entre les sous-unités régulatrices et catalytiques de la PKA. La transmission des signaux implique alors une dissociation de l'interaction. Dans tous les cas, l'interaction des protéines est un phénomène transitoire, dépendant de la stimulation.

Certaines protéines interagissent par le biais de domaines consacrés spécifiquement à cette interaction. L'interaction de Ras et de Raf par exemple fait intervenir un domaine propre à chacune des protéines, le domaine effecteur de Ras et le domaine N-terminal de Raf (domaine CR1), et ne se produit que lorsque Ras est actif, sous sa forme liant le GTP. Ce type d'interaction permet non seulement la transmission des signaux, mais intervient également dans le maintien de la spécificité.

Parallèlement à ces interactions effectuées par des domaines particuliers à deux protéines, il existe des domaines d'interaction retrouvés dans de nombreuses protéines intervenant dans la signalisation. Ces domaines, constitués de 50 à 150 acides aminés, sont dépourvus d'activité catalytique, mais reconnaissent des motifs bien précis (figure 8). Par exemple, les domaines SH2 et PTB (phosphotyrosine binding protein) [40] interagissent avec des résidus tyrosine uniquement lorsque ceux-ci sont phosphorylés. Quant aux domaines SH3 (Src homology 3), ils reconnaissent une séquence d'acides aminés riche en résidus proline [41]. Des domaines PH (pleckstrin homology) pourraient être également impliqués dans l'interaction protéine/protéine mais le motif reconnu n'est pas identifié [42]. Il semble toutefois que deux domaines PH puissent interagir l'un avec l'autre. Tous ces domaines sont présents dans de très nombreuses protéines jouant un rôle dans la transmission des signaux (figure 8), ce qui pourrait poser un problème de spécificité. Dans le cas des domaines SH2, la sélectivité est principalement conférée par la séquence des trois résidus suivant la tyrosine phosphorylée.

Phosphorylation

La grande majorité des voies de signalisation font intervenir la phosphorylation comme modification post-traductionnelle véhiculant l'information. Deux types de résidus possèdent un groupement hydroxylé susceptible de lier un groupement phosphate : les tyrosines ou les sérines/thréonines.

Les tyrosines phosphorylées sont principalement utilisées comme site d'ancrage des domaines SH2 ou PTB et interviennent donc dans la localisation des différentes protéines par interaction protéine/protéine (figure 8). Cependant, dans certains cas, comme celui de Raf ou de Src, la phosphorylation de résidus tyrosine permet également la régulation (positive ou négative) de l'activité des protéines. Les protéines kinases capables de phosphoryler les résidus tyrosine sont peu abondantes puisqu'elles représentent seulement 2 % des protéines kinases totales. Elles regroupent majoritairement des protéines membranaires comme le récepteur de l'EGF, du PDGF et de l'insuline ou des protéines cytoplasmiques comme les protéines JAK ou Src.

La phosphorylation sur résidus sérine/thréonine, quant à elle, joue un rôle prépondérant dans l'activation des protéines kinases ou des facteurs de transcription. Le mécanisme de l'activation des protéines kinases n'est pas complètement élucidé mais fait vraisemblablement intervenir un changement de conformation de la protéine phosphorylée et sa stabilisation dans une conformation active [43]. Quant aux facteurs de transcription, la présence de charges acides apportées par les groupements phosphate, pourrait coopérer avec le domaine transactivateur et contribuer à l'activation de la transcription [44]. Par ailleurs, la phosphorylation sur résidus sérine/thréonine apparaît de plus en plus comme un signal d'ubiquitinylation des protéines pour permettre leur dégradation consécutive par le complexe du protéasome. C'est le cas notamment de IkB [11], mais également de STAT1 [45]. Les protéines kinases à activité sérine/thréonine représentent la grande majorité des protéines kinases et sont principalement cytoplasmiques et/ou nucléaires, comme la PKA, Raf ou la MAPK.

Enfin, la double phosphorylation de résidus sérine/thréonine et tyrosine par des protéines kinases à double spécificité est un mécanisme beaucoup plus rare. Pour l'instant, seules deux protéines kinases à double spécificité sont connues : la MKK et la protéine kinase Wee1 responsable de la phosphorylation et de l'inactivation des Cdk.

L'intérêt majeur de la phosphorylation lors de la transmission des signaux est qu'elle constitue un moyen très rapide de modifier les protéines. De plus, hormis le cas de la dégradation par le protéasome, cette modification est réversible : la déphosphorylation, effectuée par les protéines phosphatases, permet le retour des molécules à leur état basal. Ainsi, l'équilibre entre les protéines kinases et les protéines phosphatases constitue-t-il un moyen de régulation crucial pour la transmission des signaux.

Conservation et réitération des modules de signalisation

Toutes les voies de signalisation présentées dans cette revue sont conservées chez les différents organismes pluricellulaires [46]. Par exemple, le module MAPK est retrouvé chez le xénope, la drosophile et le nématode, et joue un rôle crucial dans la prolifération et la différenciation cellulaires de ces organismes (figure 9A). De manière intéressante, le module MAPK est également conservé chez les eucaryotes unicellulaires, comme les levures, chez lesquelles il est activé en réponse aux phéromones [47] (figure 9A). La conservation des voies de signalisation au cours de l'évolution souligne leur importance et leur efficacité pour la transmission des signaux.

Par ailleurs, au moins cinq cascades homologues à celles des MAPK ont été découvertes à ce jour chez les mammifères. Elles coexistent dans la même cellule et permettent la transmission de signaux aussi variés que les facteurs de croissance, les cytokines ou le stress environnemental [48] (figure 9B). La redondance des voies de signalisation est particulièrement nette pour les modules MAPK, mais se retrouve également dans les autres voies. En effet, plusieurs isoformes appartenant à la même famille de protéines coexistent dans la cellule. Ainsi par exemple, sept membres de la famille STAT et cinq membres de la famille JAK sont connus [3]. La réitération de modules de signalisation similaires, en plus de leur conservation au cours de l'évolution, met en évidence leur intérêt pour la transmission de stimulus extracellulaires.

Cette redondance pose toutefois le problème du maintien de la spécificité. Plusieurs niveaux de régulation peuvent être utilisés par la cellule afin de maintenir la sélectivité des signaux extracellulaires au sein d'un module précis de signalisation (pour revue, voir [49]) :

­ l'expression, dans la même cellule et au même instant, de tous les composants d'une cascade de signalisation ;

­ la reconnaissance sélective des molécules appartenant à une même voie de signalisation ; cela comprend à la fois l'interaction physique entre ces molécules et, si les molécules sont des protéines kinases, la reconnaissance sélective des sites de phosphorylation ;

­ la présence de protéines annexes, permettant de regrouper dans l'espace les molécules d'un même module de signalisation et de les isoler d'interactions non spécifiques. Un tel exemple est fourni par la voie MAPK impliquée dans la réponse aux phéromones chez la levure, qui fait intervenir une protéine nommée Ste5 dont le rôle serait d'augmenter la spécificité [49].

Toutefois, malgré les mécanismes de spécificité mis en place par la cellule, il existe des interférences entre les modules de signalisation similaires. Ces interférences ont vraisemblablement un rôle régulateur important et permettent à la cellule d'utiliser un nombre fini de voies de signalisation pour les adapter en une multitude de réponses.

Remerciements.

L'auteur tient à remercier chaleureusement le Dr Jacques Pouysségur qui dirige le laboratoire d'étude du contrôle de la division cellulaire (CNRS, UMR 6543), dans lequel ce travail a été réalisé.

CONCLUSION

voies de signalisation et cancer

De nombreuses protéines jouant un rôle dans la transmission des signaux ont initialement été identifiées en tant qu'oncogènes dans le génome de rétrovirus transformants ou dans des cellules tumorales (pour revue, voir [50]). Il s'est avéré par la suite que ces oncogènes correspondaient à des versions mutées de protéines cellulaires. Par exemple, une forme mutée du facteur de transcription NF-kB, nommé v-Rel, a été découverte par analyse du génome d'un rétrovirus aviaire provoquant des lymphomes de cellules B. Une version mutée de la protéine Ras, v-Ras, a quant à elle été identifiée dans le génome de rétrovirus murins provoquant des sarcomes mais également dans de nombreuses tumeurs humaines, comme les tumeurs de la vessie ou du côlon. La plupart des classes de protéines jouant un rôle dans la transmission des signaux ­ récepteurs, facteurs de transcription, protéines kinases ou encore protéines G ­ possèdent ainsi des contreparties oncogéniques (tableau).

Les modifications des formes oncogéniques consistent dans la plupart des cas en des mutations ponctuelles ou des délétions, qui se traduisent par l'activation constitutive des molécules. Par exemple, la mutation de la protéine Ras la plus fréquemment retrouvée dans les tumeurs humaines est le remplacement d'une glycine par un autre acide aminé en position numéro 12 dans le domaine de liaison du GTP. Cette modification empêche l'hydrolyse du GTP en GDP et a pour conséquence de maintenir Ras sous une forme liant le GTP, active en permanence (figure 5B). La forme oncogénique de Raf est quant à elle dépourvue de la région N-terminale (figure 5C). Dans la forme sauvage, cette région exerce un rôle inhibiteur en se repliant sur le domaine catalytique : sa délétion entraîne donc une activation constitutive de Raf. La version oncogénique de NF-kB, v-Rel, possède pour sa part à la fois des mutations ponctuelles et une délétion de cent acides aminés dans le domaine C-terminal. Cette forme ne possède plus la capacité d'être maintenue dans le cytoplasme par l'inhibiteur IkB et se trouve ainsi en permanence localisée dans le noyau.

Les versions oncogéniques des protéines signalisatrices possèdent donc la caractéristique commune d'être actives constitutivement, indépendamment des signaux extracellulaires. Or la plupart des voies de signalisation décrites ci-dessus jouent un rôle crucial dans la régulation de la prolifération cellulaire en réponse aux facteurs de croissance (voie Ras-MAPK) ou aux cytokines (voie NF-kB). Certains gènes cibles de ces voies de signalisation codent en effet pour des protéines impliquées dans le cycle cellulaire. Ces voies sont également capables de moduler certaines molécules du cytosquelette ou d'adhésion cellulaire et jouent ainsi un rôle important dans le contrôle de la morphologie de la cellule.

L'expression dans la cellule de versions constitutivement actives des protéines signalisatrices donne ainsi naissance à un signal prolongé, se traduisant par l'activation soutenue des effecteurs, indépendamment des conditions extracellulaires. Cette altération conduit la cellule à proliférer de manière anarchique et à acquérir des modifications morphologiques caractéristiques des cellules transformées, comme l'indépendance d'ancrage. La dérégulation des voies de signalisation représente donc un événement décisif dans le déroulement des différentes étapes menant au développement tumoral.

Durant de nombreuses années, l'étude des oncogènes a permis de découvrir de nombreuses voies de signalisation intracellulaires. Le fait que ces voies soient conservées dans tous les organismes a récemment permis la convergence de plusieurs approches différentes, en particulier l'approche génétique, conduisant à l'identification de nouvelles molécules impliquées dans la transmission des signaux. Il ne fait aucun doute que ces protéines constituent autant de cibles potentielles pour définir de nouvelles stratégies thérapeutiques dans la recherche contre le cancer.

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