L’activation oncogénique de p21ras ou pp60c-src dans les cellules coliques humaines Caco-2 induit des altérations post-traductionnelles du syndécan-1

ARTICLE

De par son incidence, le cancer colorectal représente une cause majeure de mortalité avec 25 000 nouveaux cas par an en France. Il est actuellement admis que la transformation tumorale des cellules coliques résulte d'une série d'altérations génétiques et épigénétiques (Laurent-Puig, 1994). Parmi ces altérations, les mutations activantes du protooncogène ras induisant une hyperactivité de p21^ras et l'activation constitutive de la tyrosine kinase de pp60^c-src, le produit du proto-oncogène src, sont celles les plus fréquemment rencontrées. Au laboratoire, nous maintenons en culture des cellules Caco-2 qui ont été transfectées (Chastre et al., 1993) soit par le gène Ha-ras humain muté sur Val-12 (cellules Caco-2-T) soit par le moyen T du polyome (MT-Py), un oncogène codant pour une protéine membranaire qui active constitutivement la tyrosine kinase de pp60^c-src (cellules Caco-2-MT). Ces cellules Caco-2 transfectées constituent des modèles cellulaires performants pour étudier l'effet de l'activation oncogénique de p21^ras et pp60^c-src sur la synthèse et la structure des protéoglycanes de la surface cellulaire, des constituants qui, par leur capacité d'interagir avec la matrice extracellulaire, influencent le comportement des cellules et notamment les processus d'adhésion et de croissance.

Le syndécan-1, un protéoglycane à héparane sulfate qui représente la majorité des protéoglycanes transmembranaires, a récemment émergé comme un constituant jouant un rôle clé dans le contrôle de la transformation tumorale (Rapraeger, 1993). Dans cette étude, nous avons cherché à déterminer si l'activation oncogénique de p21^ras et du complexe MT-Py/pp60^c-src dans les cellules humaines coliques Caco-2 entraînait des modifications de synthèse du syndécan-1 ainsi que des altérations de la glycosylation et de la sulfatation des chaînes glycaniques de son ectodomaine.

Résultats et discussion

Diminution de l'activité spécifique de l'ectodomaine du syndécan-1 dans les cellules Caco-2 transfectées par les oncogènes

L'activité spécifique de l'ectodomaine du syndécan-1 (exprimée en dpm/mg de protéines) est fortement diminuée dans les cellules Caco-2-MT et Caco-2-T (42 375 ± 5 600 et 30 230 ± 4 570, respectivement) par rapport à celle observée dans les cellules Caco-2-H contrôles transfectées avec le vecteur seul (151 760 ± 14 115) (figure 1A).

Dans les cellules Caco-2-H, la majorité de la radioactivité ³⁵S est incorporée dans les chaînes d'héparane sulfate (87,9 ± 2,8 %), la radioactivité incorporée dans les chaînes de chondroïtine sulfate ne représentant que 12,1 ± 2,8 %. Par contre, dans les cellules transfectées par les oncogènes, la proportion de ³⁵S-sulfate incorporée dans les chaînes d'héparane sulfate diminue (74,1 ± 3,6 % pour les cellules Caco-2-MT et 64,6 ± 5,8 % pour les cellules Caco-2-T) alors que cette proportion augmente dans les chaînes de chondroïtine sulfate (25,9 ± 3,6 % et 35,4 ± 5,8 %, respectivement) (figure 1B).

Ainsi, dans les cellules transfectées par les oncogènes, la diminution de l'activité spécifique de l'ectodomaine du syndécan-1 est concomitante à une augmentation du rapport chondroïtine sulfate/héparane sulfate. Ces résultats sont en accord avec des études précédentes qui ont mis en évidence une augmentation de la teneur en chondroïtine sulfate dans les glycosaminoglycanes isolés de tumeurs coliques (Iozzo et al., 1989).

Diminution de la longueur des chaînes et du degré de sulfatation des glycosaminoglycanes de l'ectodomaine du syndécan-1 dans les cellules Caco-2 transfectées par les oncogènes

L'analyse des chaînes de glycosaminoglycanes de l'ectodomaine du syndécan-1 faite sur colonne de Sépharose Cl-6B nous a permis de déterminer, dans les cellules Caco-2-H contrôles, un kDa de 28,0 ± 1,1 pour les chaînes d'héparane sulfate et de 24,0 ± 0,7 pour les chaînes de chondroïtine sulfate (figure 2). Dans les cellules Caco-2 transfectées par les oncogènes, on observe une diminution de la longueur des chaînes d'héparane sulfate et de chondroïtine sulfate, leurs kDa respectifs étant de 12,5 ± 0,6 et 9,0 ± 0,91 dans les cellules Caco-2-MT et de 19,0 ± 0,8 et 16,0 ± 1,0 dans les cellules Caco-2-T (figure 2).

De plus, les chaînes de glycosaminoglycanes de l'ectodomaine du syndécan-1 ont un degré de sulfatation diminué dans les cellules Caco-2 transfectées par les oncogènes. En effet, l'analyse par chromatographie échangeuse d'ions sur colonne de DEAE-Sephacel montre que les glycosaminoglycanes des cellules Caco-2-MT et Caco-2-T sont élués à des concentrations de NaCl plus faibles que les glycosaminoglycanes des cellules contrôles (0,47 M et 0,40 M contre 0,56 M).

Ces résultats montrent clairement des altérations spécifiques de l'ectodomaine du syndécan-1 dans les cellules Caco-2-MT et Caco-2-T. Des études précédentes ont souligné l'importance de la glycosylation et de la sulfatation du syndécan-1 dans ses interactions avec les constituants de la matrice extracellulaire, mettant ainsi en évidence le rôle central de l'ectodomaine du syndécan-1 dans l'adhésion des cellules à la matrice. Dans les cellules Caco-2 transfectées par les oncogènes, la diminution de glycosylation et de sulfatation observée suggère une diminution des propriétés d'adhésion de ces cellules. Étant donné que précisément le phénotype néoplasique se caractérise par une diminution d'adhésion, l'altération des propriétés de glycosylation et de sulfatation du syndécan-1 paraît être un des mécanismes par lequel les oncoprotéines ras et moyen T du polyome pourraient induire la transformation des cellules coliques humaines.

Mise en évidence d'une activité héparanase dans les cellules Caco-2 transfectées par les oncogènes

La réduction de la longueur des chaînes d'héparane sulfate de l'ectodomaine du syndécan-1 observée dans les cellules Caco-2 transfectées par les oncogènes nous a amenés à suspecter la présence d'une activité héparanase, une enzyme qui dégrade spécifiquement les chaînes d'héparane sulfate.

De l'héparane sulfate préparé à partir de cellules Caco-2-H contrôles est incubé en présence des extraits cellulaires de cellules Caco-2 contrôles et transfectées par les oncogènes. La chromatographie sur colonne de Sépharose Cl-6B des produits obtenus permet de mettre en évidence des chaînes de faible poids moléculaire qui caractérisent les produits de dégradation de l'héparane sulfate par l'héparanase. Ces produits de dégradation qui n'ont pas été détectés dans les cellules Caco-2-H contrôles représentent respectivement 21 et 32 % de l'héparane sulfate dans les cellules Caco-2-MT et Caco-2-T.

L'activité héparanase mesurée dans les cellules Caco-2-MT et Caco-2-T transfectées par les oncogènes peut rendre compte, au moins en partie, de la diminution de longueur des chaînes d'héparane sulfate observée. Au cours de la transformation tumorale, il y a activation de processus de dégradation notamment au niveau des constituants de la matrice extracellulaire. Ces processus mettent en jeu un groupe d'enzymes au sein desquelles les protéases telles que les sérine protéases et les métalloprotéinases jouent un rôle majeur. Nos resultats suggèrent que les héparanases font partie de ce groupe d'enzymes qui sont classiquement surexprimées et/ou activées au cours de la transformation tumorale des cellules. L'activité héparanase mise en évidence dans les cellules Caco-2-MT et Caco-2-T contribuerait ainsi à la progression tumorigénique des cellules coliques Caco-2 induite par p21^ras et le complexe MT-Py/pp60^c-src.

Ainsi, nos résultats montrent clairement que l'activation du potentiel tumorigénique des cellules Caco-2 induite par p21^ras et Py-MT/pp60^c-src est associée à des altérations spécifiques du syndecan-1 à un niveau post-traductionnel. Ces altérations joueraient un rôle critique dans la diminution des propriétés d'adhésion cellules-matrice et, par conséquent, dans la croissance maligne des cellules Caco-2 transfectées par les oncogènes. *

Matériel et méthodes

Les 3 lignées de cellules Caco-2 transfectées utilisées dans cette étude ont été récemment caractérisées (Chastre et al., 1993). L'ectodomaine du syndécan-1 a été isolé par action ménagée de la trypsine, selon la méthode précédemment décrite (Jalkanen et al., 1987). La quantification de cet ectodomaine a été effectuée, après incorporation de sulfate de sodium ³⁵S pendant 24 h, par la technique de dot-blot sur membrane de Zeta-probe (Buee et al., 1991). Les chaînes de glycosaminoglycanes de l'ectodomaine du syndécan-1 ont été caractérisées par dégradation sélective par l'acide nitreux (chaînes d'héparane sulfate) ou par la chondroïtinase (chaînes de chondroïtine sulfate), comme précédemment décrit (Rapraeger, 1993) ; la radioactivité incorporée dans chaque type de chaîne a été quantifiée par dot-blot. Le degré de sulfatation des chaînes de glycosaminoglycanes est obtenu par chromatographie échangeuse d'ions sur colonne de DEA-Sépharose en présence d'un gradient linéaire de NaCl (50-800 mM) (Lévy et al., 1990). La taille des chaînes d'héparane sulfate ou de chondroïtine sulfate a été déterminée après chromatographie sur colonne de Sépharose Cl-6B par mesure de leurs kDa respectifs obtenus par rapport à une courbe standard établie selon la méthode de Wasteson (1971). Pour mettre en évidence la présence d'héparanase, une enzyme dégradant spécifiquement les chaînes d'héparane sulfate, nous avons préparé de l'héparane sulfate à partir de cellules contrôles et nous l'avons mis en présence de sonicats obtenus à partir des cellules Caco-2-H, Caco-2-MT et Caco-2-T ; les produits de dégradation obtenus ont été analysés sur colonne de Sépharose Cl-6B, comme décrit précédemment (Lévy et al., 1996).

REFERENCES

* Buee L, Boyle NJ, Zhang L, Delacourte A, Fillit HM. Optimization of an alcian blue dot-blot assay for the detection of glycosaminoglycans and proteoglycans. Anal Biochem 1991 ; 195 : 238-42.

* Chastre E, Empereur S, Di Gioia Y, El Madhani N, Mareel M, Vleminckx K, Van Roy F, Bex V, Emami S, Spandidos DA, Gespach C. Neoplastic progression of human and rat intestinal cell lines after transfer of the ras and polyoma middle T oncogenes. Gastroenterology 1993 ; 105 : 1776-89.

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* Wasteson A. A method for the determination of the molecular weight and molecular-weight distribution of chondroitin sulphate. J Chromat 1971 ; 59 : 87-97.